小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

摘要

本文介绍了一种相关性工作流程，用于切除、加压、固定和成像小鼠肺动脉瓣，以确定其宏观构象及局部细胞外基质结构。

摘要

心脏瓣膜相关疾病（HVD）的根本病因尚不明确。小鼠动物模型为研究HVD提供了优秀的工具，然而，要精确量化多个尺度下结构与组织的特征，需要高超的手术技巧和仪器操作能力，这在一定程度上限制了该领域的发展。本研究详细描述了小鼠心脏的解剖、整块染色、样品处理以及多尺度下心脏瓣膜成像的关联成像流程。采用静水跨瓣压力控制时间异质性，通过化学固定维持心脏瓣膜的构象。利用显微计算机断层扫描（µCT）确认心脏瓣膜的几何形态，并为后续用于连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的样品处理提供参考依据。采集并重建了细胞外基质（ECM）的高分辨率连续扫描电镜图像，以获得其局部组织结构的三维表征。随后将µCT与SBF-SEM成像方法进行关联，以克服肺动脉瓣跨区域的空间差异。尽管本研究所展示的内容仅针对肺动脉瓣，该方法可推广应用于描述生物系统中的层级结构组织，对于实现多尺度下的结构表征具有重要意义。

引言

肺动脉瓣（PV）的功能是确保血液在右心室与肺动脉之间的单向流动。肺动脉瓣的畸形与多种先天性心脏病相关。目前，先天性心脏瓣膜病（HVD）的治疗方法主要是瓣膜修复或瓣膜置换，这些治疗可能需要患者在一生中接受多次侵入性手术¹。目前普遍认为，心脏瓣膜的功能源于其结构，这一关系常被称为结构-功能相关性。更具体而言，心脏的几何结构和生物力学特性决定了其功能表现。而这些力学特性又由细胞外基质（ECM）的组成和组织结构所决定。通过建立一种测定小鼠心脏瓣膜生物力学特性的方法，可利用转基因动物模型来研究ECM在心脏瓣膜正常功能与功能障碍中的作用^2,3,4,5。

小鼠动物模型长期以来被视为分子研究的标准模型，因为与其他物种相比，小鼠的转基因模型更容易获得。小鼠转基因模型为心脏瓣膜相关疾病的研究提供了多功能的平台⁶。然而，表征心脏瓣膜几何结构和细胞外基质（ECM）组织所需的外科技术与仪器设备，一直是推动心脏瓣膜病（HVD）研究的主要障碍。文献中的组织学数据能够揭示小鼠心脏瓣膜细胞外基质的组成，但仅限于二维图像形式，无法描述其三维结构

方案

本研究中动物的使用遵循全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准的方案 AR13-00030。

1. 肺动脉瓣切除

1. 对小鼠解剖所需工具进行高压灭菌。这些工具包括精细剪刀、显微镊子、显微血管夹、持夹镊子、显微持针器、弹簧剪和牵开器。
2. 手术前至少将所有小鼠适应环境两周。取出约1年龄的C57BL/6小鼠，从笼中取出后称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮:赛拉嗪 = 3:1，每克体重0.01 mL）实施安乐死。
3. 将小鼠仰卧位放置于托盘上，并用胶带固定四肢。固定后，进行开胸操作。
   1. 清除多余脂肪组织和筋膜，暴露心脏。
   2. 切除右心房，并通过左心室以室温生理盐水（0.9% NaCl）进行灌注。灌注量约为20 mL，持续约30秒。此过程可使小鼠完全放血。
4. 切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，完整取出心脏。操作肺动脉时需格外小心。在心室-动脉连接处上方约2 mm处剪断，该段将作为后续加压的通路。
5. 切除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下。注意确保切除心室过程中肺动脉主干结构不受影响。

2. 肺动脉瓣的压力固定

1. 将加压导管与肺动脉吻合，使窦管交界处与导管末端之间保留约1 mm的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度....

结果

肺动脉与加压导管的吻合如图所示 图1A施加静水压后，肺动脉干径向扩张（图1B）表明肺动脉瓣瓣叶处于闭合状态。通过以下方式确认肺动脉瓣的构象： µCT。在这种情况下，瓣叶对合（闭合），且瓣环呈圆形。图2A). 图2B，C 显示不同程度的肺动脉瓣加压不足，原因可能是固定（图2B）或动脉塌陷（图2C).

样本块修整依据µCT体积渲染结果进行。本例中，选择与窦-瓣交界平行的平面作为切片方向。通过解剖标志，将µCT体积渲染的虚拟横断面与光学图像（图3）进行比对，以确认切片方向和位置。

当样本.......

讨论

去除心室具有两个目的。首先，将心室侧暴露于大气压下，从而只需从肺动脉瓣的动脉侧施加跨瓣压力即可使其关闭；其次，提供一个稳定的基底，防止肺动脉干发生扭转。在加压过程中，肺动脉干会向径向和下方扩张，容易发生扭曲，导致肺动脉干塌陷。用生理盐水溶液对肺动脉瓣进行预加压，可提供额外的质量控制，以确保加压充分，并检测系统是否存在任何泄漏。固定剂的主要作用迅速，仅需数秒即可完成；若未使用生理盐水进行流体静力预加压，肺动脉瓣将被固定在随机构象中。若不进行预加压，肺动脉瓣成功闭合的几率仅为10%–20%；而通过预加压步骤，成功率可提升至90%以上。

针对本应用优化了µCT和SBF-SEM成像条件。肺动脉瓣在完全拉伸时厚度可小于10 µm。通常，分辨某一结构至少需要3个体素的阈值；因此，µCT体积重建的扫描体素尺寸设定为2.9 µm，视场为8.4 × 8.4 × 6.3 mm。在µCT中可实现更小的体素尺寸，但这需要对样品进行修整和/或延长扫描时间。通过将样品更靠近X射线源放置，可实现更高分辨率。将X射线探测器远离样品放置也可获得更小的体素，但会降低探测器上的总通量，从而影响信噪比。作为参考，本研究中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% 戊二醛（水溶液）	EMS	16210	主要固定剂组分
0.9% 氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL 注射器	BD	309659
10 mL 注射器	BD	309604
200 proof 乙醇	EMS	15055
22G 针头	BD	305156
3 mL 注射器	BD	309657
三通旋塞阀	Smiths Medical ASD, Inc.	MX5311L
4% 四氧化锇	EMS	19150	染色组分
4% 多聚甲醛（水溶液）	EMS	157-4-100	主要固定剂组分
可吸收性止血剂	Ethicon	1961
丙酮	EMS	10012
黑色聚酰胺单丝缝线，10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
黑色聚酰胺单丝缝线，6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratories	664	约 1 岁
氯化钙	Sigma-Aldrich	10043-52-4
持夹钳	FST	00072-14
棉签	Fisher Scientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 镊子	FST	11251-20
Dumont #5/45 镊子	FST	11251-35
Dumont #7 细镊	FST	11274-20
Durcupan ACM 树脂	EMS	14040	用于包埋
精细剪刀	FST	14028-10
Heliscan 微型 CT	Thermo Fisher Scientific		微型 CT
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	56-84-8	染色组分
硝酸铅	EMS	17900	染色组分
低真空背散射探测器	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM 背散射探测器
微型 Adson 镊	FST	11018-12
Millex-GP 滤器，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌	EMD Millipore	SLGP033NS
无纺纱布	McKesson Corp.	94442000
六氰合铁(II)酸钾三水合物	Sigma-Aldrich	14459-95-1	染色组分
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	1310-58-3
压力监测管路	Smiths Medical ASD, Inc.	MX562
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
3 号 BEEM 包埋胶囊	EMS	69910-01	包埋容器
三水合二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	6131-99-3	缓冲液
Solibri 牵开器	FST	17000-04
溅射、碳镀和电子束镀膜仪	Leica	EM ACE600	金镀膜仪
手术显微镜	Leica	M80
硫代碳酰肼（TCH）	EMS	21900	染色组分
Tish 持针器/镊子	Micrins	MI1540
修整仪	Wahl	9854-500
醋酸铀	EMS	22400	染色组分
VolumeScope 扫描电子显微镜	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	连续块面扫描电子显微镜
赛拉嗪无菌溶液	Akorn Inc.	NADA# 139-236