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方法文章

小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理

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DOI：

10.3791/62581

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2021年8月5日

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1Center for Electron Microscopy and Analysis, The Department of Materials Science and Engineering, Ohio State University, 2Center for Regenerative Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 3Thermo Fisher Scientific

本文内容

摘要

本文介绍了一种相关性工作流程，用于切除、加压、固定和成像小鼠肺动脉瓣，以确定其宏观构象及局部细胞外基质结构。

摘要

心脏瓣膜相关疾病（HVD）的根本病因尚不明确。小鼠动物模型为研究HVD提供了优秀的工具，然而，要精确量化多个尺度下结构与组织的特征，需要高超的手术技巧和仪器操作能力，这在一定程度上限制了该领域的发展。本研究详细描述了小鼠心脏的解剖、整块染色、样品处理以及多尺度下心脏瓣膜成像的关联成像流程。采用静水跨瓣压力控制时间异质性，通过化学固定维持心脏瓣膜的构象。利用显微计算机断层扫描（µCT）确认心脏瓣膜的几何形态，并为后续用于连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的样品处理提供参考依据。采集并重建了细胞外基质（ECM）的高分辨率连续扫描电镜图像，以获得其局部组织结构的三维表征。随后将µCT与SBF-SEM成像方法进行关联，以克服肺动脉瓣跨区域的空间差异。尽管本研究所展示的内容仅针对肺动脉瓣，该方法可推广应用于描述生物系统中的层级结构组织，对于实现多尺度下的结构表征具有重要意义。

引言

肺动脉瓣（PV）的功能是确保血液在右心室与肺动脉之间的单向流动。肺动脉瓣的畸形与多种先天性心脏病相关。目前，先天性心脏瓣膜病（HVD）的治疗方法主要是瓣膜修复或瓣膜置换，这些治疗可能需要患者在一生中接受多次侵入性手术1。目前普遍认为，心脏瓣膜的功能源于其结构，这一关系常被称为结构-功能相关性。更具体而言，心脏的几何结构和生物力学特性决定了其功能表现。而这些力学特性又由细胞外基质（ECM）的组成和组织结构所决定。通过建立一种测定小鼠心脏瓣膜生物力学特性的方法，可利用转基因动物模型来研究ECM在心脏瓣膜正常功能与功能障碍中的作用2,3,4,5。

小鼠动物模型长期以来被视为分子研究的标准模型，因为与其他物种相比，小鼠的转基因模型更容易获得。小鼠转基因模型为心脏瓣膜相关疾病的研究提供了多功能的平台6。然而，表征心脏瓣膜几何结构和细胞外基质（ECM）组织所需的外科技术与仪器设备，一直是推动心脏瓣膜病（HVD）研究的主要障碍。文献中的组织学数据能够揭示小鼠心脏瓣膜细胞外基质的组成，但仅限于二维图像形式，无法描述其三维结构7,8。此外，心脏瓣膜在空间和时间上均具有异质性，若取样位置和构象未标准化，则难以在不同实验之间对ECM组织得出一致结论。传统的三维表征方法，如磁共振成像（MRI）或三维超声心动图，无法提供分辨ECM组分所需的分辨率9,10。

本研究详细描述了一种完全关联的工作流程，通过流体静力跨瓣压力固定小鼠肺动脉瓣的构象，解决了由心动周期引起的时间异质性问题。通过在不同成像模式（特别是微计算机断层扫描（µCT）和连续块面扫描电子显微镜）之间对感兴趣区域进行取样并配准跨多个长度尺度的数据集，精确控制了空间异质性。此前已有研究提出利用µCT进行前期 scout 扫描以指导后续取样，但由于肺动脉瓣存在时间上的动态变化，因此在手术层面需要额外的控制措施11。

描述小鼠心脏瓣膜生物力学的体内研究较为匮乏，目前主要依赖计算模型来描述其变形行为。将纳米尺度下的局部细胞外基质数据与心脏瓣膜的几何结构和位置相关联至关重要。这能够提供可量化的、空间定位的机械性贡献ECM蛋白分布图谱，可用于强化现有的心脏瓣膜生物力学模型12,13,14。

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方案

本研究中动物的使用遵循全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准的方案 AR13-00030。

1. 肺动脉瓣切除

  1. 对小鼠解剖所需工具进行高压灭菌。这些工具包括精细剪刀、显微镊子、显微血管夹、持夹镊子、显微持针器、弹簧剪和牵开器。
  2. 手术前至少将所有小鼠适应环境两周。取出约1年龄的C57BL/6小鼠，从笼中取出后称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮:赛拉嗪 = 3:1，每克体重0.01 mL）实施安乐死。
  3. 将小鼠仰卧位放置于托盘上，并用胶带固定四肢。固定后，进行开胸操作。
    1. 清除多余脂肪组织和筋膜，暴露心脏。
    2. 切除右心房，并通过左心室以室温生理盐水（0.9% NaCl）进行灌注。灌注量约为20 mL，持续约30秒。此过程可使小鼠完全放血。
  4. 切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，完整取出心脏。操作肺动脉时需格外小心。在心室-动脉连接处上方约2 mm处剪断，该段将作为后续加压的通路。
  5. 切除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下。注意确保切除心室过程中肺动脉主干结构不受影响。

2. 肺动脉瓣的压力固定

  1. 将加压导管与肺动脉吻合，使窦管交界处与导管末端之间保留约1 mm的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度运动。
  2. 将储液罐抬升至接近生理压力的水平，并用生理盐水充满。测试流通系统，确保无堵塞或气泡存在。
  3. 在吻合的肺动脉瓣处连接一个三通阀，通过切换流出道确保导管内有充分的液体流动（即无气泡）。当流动充分后，将流出道切换至吻合的肺动脉瓣，确保肺动脉干被加压。可通过观察肺动脉干扩张来确认加压成功。
  4. 一旦确认肺动脉干已加压，逐步引入固定液（1.25% 戊二醛，1.0% 多聚甲醛溶于0.15 M cacodylate缓冲液），直至完全置换出生理盐水。具体操作为移除约25%储液罐容量的生理盐水，并替换为初始固定液。
    注意：所使用的固定剂（多聚甲醛和戊二醛）具有高度毒性，应穿戴适当的个人防护装备（PPE）以确保安全。
  5. 用浸有固定液的纱布覆盖组织样本，防止干燥。
  6. 以固定液灌注3小时，根据需要补充储液罐以维持恒定压力。在固定过程中，由于化学固定作用，肺动脉瓣发生收缩是常见现象。若出现此情况，需持续补充初始固定液以维持生理压力。
  7. 将心脏瓣膜置于固定液中，于4 °C保存备用。样本保存时间最长可达1周，未观察到明显差异。

3. 组织块整体染色与包埋15,16

警告：本节使用的染色试剂（亚铁氰化钾、四氧化锇、硫代碳酰肼、天冬氨酸铅和醋酸铀酰）具有高毒性，应极其小心地操作。建议在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。

  1. 染色
    1. 用冰冷的 0.15 M 卡可基酸盐缓冲液清洗固定的心瓣膜样本 5 分钟。重复清洗两次。
    2. 将心瓣膜完全浸入含有 1.5% 亚铁氰化钾、0.15 M 卡可基酸盐、2 mM 氯化钙和 2% 四氧化锇的溶液中，置于冰上孵育 1 小时。
    3. 在样本孵育期间，通过将 0.1 g TCH 溶解于 10 mL ddH2O 中制备硫代碳酰肼（TCH）溶液。将溶液置于 60 °C 烤箱中 1 小时。定期轻轻振荡以确保 TCH 完全溶解。使用前立即用 0.22 µm 注射器滤器过滤该溶液。
    4. 用室温 ddH2O 清洗样本：将样本放入装有 ddH2O 的试管中 5 分钟，并通过轻轻摇动容器进行轻微振荡。重复此过程三次。
    5. 将样本置于过滤后的 TCH 溶液中，在室温下孵育 20 分钟。然后按照步骤 3.1.4 所述方法，用室温 ddH2O 清洗三次，每次 5 分钟。
    6. 完成后，将样本置于 2% 四氧化锇溶液中，室温孵育 30 分钟。然后再次用室温 ddH2O 清洗三次，每次 5 分钟。
    7. 将样本在 1% 醋酸铀溶液中 4 °C 过夜孵育。
    8. 在此期间，将 0.066 g 硝酸铅溶于 10 mL 天冬氨酸储备液中，用 1 N KOH 调节 pH 至 5.5。将溶液置于 60 °C 烤箱中以溶解硝酸铅。
    9. 过夜孵育后，按照步骤 3.1.4 所述方法进行清洗，重复三次。然后将心瓣膜组织置于步骤 3.1.8 制备的铅-天冬氨酸溶液中，在 60 °C 烤箱中孵育 30 分钟。
  2. 脱水
    1. 用室温 ddH2O 清洗组织 5 分钟，重复三次。
    2. 用 ddH2O 新鲜配制 20%、50%、70%、90% 和 100% 的乙醇溶液。置于冰上保存，直至使用。
    3. 对心瓣膜组织进行脱水处理：依次在冰上使用 20%、50%、70% 和 90% 乙醇溶液处理，每次 5 分钟。然后在冰上用 100% 乙醇连续处理两次，每次 5 分钟。
    4. 将组织转移至冰冻丙酮中 10 分钟，随后转移至室温新鲜丙酮中 10 分钟。
  3. 包埋
    1. 根据制造商说明配制树脂混合物（参见材料表）：组分 A 11.4 g，组分 B 10 g，组分 C 0.3 g，组分 D 0.05–0.1 g。首先将组分 A 和 B 分别加热至 60 °C 后混合，再加入组分 C 和 D。加入组分 C 和 D 后，混合物将变为琥珀色。充分混合后应呈均匀状态。
    2. 配制体积比为 25:75、50:50 和 75:25 的树脂:丙酮混合液，充分混匀。
    3. 将组织依次置于 25:75、50:50 和 75:25 的树脂:丙酮混合液中，每种混合液在室温下处理 2 小时。
    4. 将组织置于 100% 树脂中，室温过夜。
    5. 次日，将组织转移至新鲜的 100% 树脂中，室温处理 2 小时。
    6. 将心瓣膜组织转移至包埋胶囊中，更换为新鲜 100% 树脂，并置于 60 °C 烤箱中固化 48 小时。
  4. 按如下所示进行相关成像。

4. 微型计算机断层扫描成像

  1. 使用粘合剂（胶水或双面胶均可）将树脂样品块固定在 µCT 样品 holder 上。
  2. 将 holder 放入 µCT 腔室，并通过拧紧夹头将其固定在载物台上，确保 holder 无任何移动。扫描过程中样品的移动会降低图像质量。
  3. 通过双击图标打开 µCT 用户界面。点击 Projects 旁边的 + 号添加项目，并填写必要的信息字段。
  4. 项目创建完成后，找到该新建项目并点击选中。此时将出现第二个栏目 Acquisitions。点击 Acquisitions 旁边的 + 号，并填写必要的信息字段。
  5. 关闭腔室门，按下 µCT 前面板上的启动按钮以启动系统。在用户界面中点击标有 Warmup 的按钮，开始 X 射线预热。
    注意：系统在成功完成预热程序后将自动关闭 X 射线。需手动点击按钮重新开启 X 射线。
  6. 调整载物台旋转位置，使样品的旋转中心不偏离显示器中心（即在整个扫描过程中样品始终处于视野范围内）。对于本实验所用系统，需按照以下步骤在下拉选项卡中调节感兴趣区域（ROI）载物台：
    1. 将旋转角度设为 0°，标记样品边缘；然后将样品旋转至 180°，再次标记样品边缘。
    2. 调节 ROI 载物台的 x 轴位置，使样品边缘位于上述两个极端位置之间。对 y 轴位置重复此过程，使用 90° 和 270° 的旋转角度进行调节。
    3. 若样品旋转时边缘移出视野范围，则需降低 µCT 的放大倍数，直至在上述设定角度下可见样品边缘，从而进行粗略的 ROI 载物台调节。
    4. 在较低放大倍数下完成初步调节后，移动样品或探测器以提高放大倍数，并对 ROI 位置进行精细调节。
      注意：此过程可能需要重复多次以确保对齐准确。正确对齐的结果是样品在所有旋转角度下几乎无水平移动。
  7. 使用制造商提供的软件将 µCT 调整至所需的扫描参数。这些参数包括管电压、管电流、探测器距离、样品距离、曝光时间、轨迹以及投影数量（本研究中使用的 µCT 采集参数见 Table S1）。
    注意：校准参数（如空白场和暗场扫描）应保持为制造商规定的标准值，除非另有说明。例如，若样品过大导致系统无法将其移出视野，则需手动取出样品以执行空白场校准扫描。
  8. 参数设置完成后，点击 Time Estimate 按钮可预估扫描所需时间。点击 Start 按钮开始扫描。
  9. 扫描完成后，确认 X 射线已关闭，松开夹头，并小心地将样品从 µCT 腔室中取出。

5. 样品处理与图像关联

  1. 使用制造商提供的软件（参见材料表），通过滤波反投影算法重建µCT投影图像。
    1. 在屏幕顶部选择Recon选项卡，然后选择Project和Acquisition选项卡。
    2. 选择与滤波反投影相关的重建模板，点击Start Recon按钮。
  2. 使用图像处理软件识别并分割肺动脉瓣。此步骤需要预先掌握肺动脉瓣的解剖结构17。在动脉压力升高时，瓣叶会合，阻塞肺动脉瓣的管腔。
  3. 确定切片方向相对于扫描方向和样品的位置。重新调整样品方向，使切片方向与目标轴对齐。
  4. 确定用于高分辨率成像的兴趣区域。在本实验中，选择了瓣叶中部（腹部）以及动脉-瓣膜交界处。
  5. 对于较大材料，可使用剃刀或砂纸去除多余树脂和样品；对于更精细的部分，则使用切片机进行修整。
  6. 到达目标位置后，将实际样本与虚拟µCT切片进行比对，以确认位置。此步骤通过比较横截面的解剖特征完成。

6. 连续块面扫描电子显微镜18

  1. 将样品截面减小至适合SBF-SEM，尺寸约为2.0 × 1.5 × 1.8 mm。
  2. 使用环氧树脂将修整后的样品固定在SBF-SEM铝制样品 stub 上。
  3. 在样品块表面镀约35 nm厚的金层。旋转样品平台，以确保镀层均匀。
  4. 对SBF-SEM腔室进行放气，并将切片刀刃高度调整至显微镜的等中心高度。
  5. 插入样品并调平样品 stub。
  6. 在低真空条件下成像，以防止电荷积累，并使用背散射电子探测器（SBF-SEM成像参数见表S2）。
  7. 使用自动化软件在不同放大倍数下对多个感兴趣区域进行成像并拼接（参见材料表）。

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结果

肺动脉与加压导管的吻合如图所示 图1A施加静水压后，肺动脉干径向扩张（图1B）表明肺动脉瓣瓣叶处于闭合状态。通过以下方式确认肺动脉瓣的构象： µCT。在这种情况下，瓣叶对合（闭合），且瓣环呈圆形。图2A). 图2B，C 显示不同程度的肺动脉瓣加压不足，原因可能是固定（图2B）或动脉塌陷（图2C).

样本块修整依据µCT体积渲染结果进行。本例中，选择与窦-瓣交界平行的平面作为切片方向。通过解剖标志，将µCT体积渲染的虚拟横断面与光学图像（图3）进行比对，以确认切片方向和位置。

当样本...

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讨论

去除心室具有两个目的。首先，将心室侧暴露于大气压下，从而只需从肺动脉瓣的动脉侧施加跨瓣压力即可使其关闭；其次，提供一个稳定的基底，防止肺动脉干发生扭转。在加压过程中，肺动脉干会向径向和下方扩张，容易发生扭曲，导致肺动脉干塌陷。用生理盐水溶液对肺动脉瓣进行预加压，可提供额外的质量控制，以确保加压充分，并检测系统是否存在任何泄漏。固定剂的主要作用迅速，仅需数秒即可完成；若未使用生理盐水进行流体静力预加压，肺动脉瓣将被固定在随机构象中。若不进行预加压，肺动脉瓣成功闭合的几率仅为10%–20%；而通过预加压步骤，成功率可提升至90%以上。

针对本应用优化了µCT和SBF-SEM成像条件。肺动脉瓣在完全拉伸时厚度可小于10 µm。通常，分辨某一结构至少需要3个体素的阈值；因此，µCT体积重建的扫描体素尺寸设定为2.9 µm，视场为8.4 × 8.4 × 6.3 mm。在µCT中可实现更小的体素尺寸，但这需要对样品进行修整和/或延长扫描时间。通过将样品更靠近X射线源放置，可实现更高分辨率。将X射线探测器远离样品放置也可获得更小的体素，但会降低探测器上的总通量，从而影响信噪比。作为参考，本研究中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由授予 CKB 的 R01HL139796 和 R01HL128847 基金以及授予 DWM 的 RO1DE028297 和 CBET1608058 基金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25% 戊二醛（水溶液）EMS16210主要固定剂组分
0.9% 氯化钠注射液Hospira Inc.NDC 0409-4888-10
1 mL 注射器BD309659
10 mL 注射器BD309604
200 proof 乙醇EMS15055
22G 针头BD305156
3 mL 注射器BD309657
三通旋塞阀Smiths Medical ASD, Inc.MX5311L
4% 四氧化锇EMS19150染色组分
4% 多聚甲醛（水溶液）EMS157-4-100主要固定剂组分
可吸收性止血剂Ethicon1961
丙酮EMS10012
黑色聚酰胺单丝缝线，10-0AROSurgical instruments CorporationTI38402
黑色聚酰胺单丝缝线，6-0AROSurgical instruments CorporationSN-1956
C57BL/6 小鼠Jackson Laboratories664约 1 岁
氯化钙Sigma-Aldrich10043-52-4
持夹钳FST00072-14
棉签Fisher Scientific23-400-118
DPBSGibco14190-144
Dumont #5 镊子FST11251-20
Dumont #5/45 镊子FST11251-35
Dumont #7 细镊FST11274-20
Durcupan ACM 树脂EMS14040用于包埋
精细剪刀FST14028-10
Heliscan 微型 CTThermo Fisher Scientific微型 CT
盐酸氯胺酮注射液Hospira Inc.NDC 0409-2053
L-天冬氨酸Sigma-Aldrich56-84-8染色组分
硝酸铅EMS17900染色组分
低真空背散射探测器Thermo Fisher ScientificVSDBSSEM 背散射探测器
微型 Adson 镊FST11018-12
Millex-GP 滤器，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌EMD MilliporeSLGP033NS
无纺纱布McKesson Corp.94442000
六氰合铁(II)酸钾三水合物Sigma-Aldrich14459-95-1染色组分
氢氧化钾Sigma-Aldrich1310-58-3
压力监测管路Smiths Medical ASD, Inc.MX562
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）Hospira Inc.NDC 0409-0138-22
3 号 BEEM 包埋胶囊EMS69910-01包埋容器
三水合二甲胂酸钠Sigma-Aldrich6131-99-3缓冲液
Solibri 牵开器FST17000-04
溅射、碳镀和电子束镀膜仪LeicaEM ACE600金镀膜仪
手术显微镜LeicaM80
硫代碳酰肼（TCH）EMS21900染色组分
Tish 持针器/镊子MicrinsMI1540
修整仪Wahl9854-500
醋酸铀EMS22400染色组分
VolumeScope 扫描电子显微镜Thermo Fisher ScientificVOLUMESCOPESEM连续块面扫描电子显微镜
赛拉嗪无菌溶液Akorn Inc.NADA# 139-236

参考文献

  1. Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
  2. Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
  3. Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
  4. Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889(2020).
  5. Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
  6. McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
  7. Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
  8. Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
  9. Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
  10. Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
  11. Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
  12. Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
  13. Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
  14. Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
  15. Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
  16. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  17. Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
  18. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
  19. Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
  20. Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).

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