穆林肺瓣膜相关成像的手术和样品处理

Summary

在这里，我们描述了一个相关的工作流程的切除，加压，固定和成像的粘液肺瓣，以确定总构象和局部细胞外矩阵结构。

Abstract

心脏瓣膜相关疾病 （HVD） 的根本原因难以捉摸。Murine 动物模型为研究 HVD 提供了绝佳的工具，但是，在多个长度尺度上准确量化结构和组织所需的外科和器具专业知识阻碍了其发展。这项工作提供了详细的描述，以描绘不同长度尺度的心瓣膜解剖，集团染色，样品处理和相关成像程序。通过化学固定心脏瓣膜构象，用于控制时间异质性。微计算断层扫描 （μCT） 用于确认心脏瓣膜的几何形状，并为串行块面部扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 所需的下游样品处理提供参考。拍摄了细胞外矩阵 （ECM） 的高分辨率序列 SEM 图像，并进行了重建，以提供其组织的本地 3D 表示。然后，将 μCT 和 SBF-SEM 成像方法关联在一起，以克服整个肺瓣的空间变化。虽然所介绍的工作完全在肺瓣上，但这种方法可以用来描述生物系统中的分层组织，并且对于跨多个长度尺度的结构特征至关重要。

Introduction

肺瓣膜 （PV） 用于确保右心室和肺动脉之间的单向血液流动。肺瓣膜畸形与几种形式的先天性心脏病有关。目前对先天性心脏瓣膜疾病（HVD）的治疗是瓣膜修复或瓣膜置换，这可能需要在患者^{一生中进行}多次侵入性手术。人们普遍认为心脏瓣膜的功能来源于其结构，通常称为结构功能相关。更具体地说，心脏的几何和生物力学特性决定了心脏的功能。机械特性则由 ECM 的组成和组织决定。通过开发一种确定穆林心脏瓣膜生物力学特性的方法，转基因动物模型可用于质疑ECM在心脏瓣膜功能和^{功能障碍2、3、4、5}中的作用。

长期以来，穆林动物模型一直被视为分子研究的标准，因为与其他物种相比，转基因模型在小鼠中更容易获得。穆林转基因模型为研究心脏瓣膜相关疾病提供了一个多功能的平台^。然而，几何学和ECM组织的特点的外科专业知识和仪器要求一直是推进HVD研究的主要障碍。文献中的病理学数据提供了一张图到穆林心脏瓣膜细胞外矩阵的内容，但仅以2D图像的形式，无法描述其3D架构^7，8。此外，心脏瓣膜在空间和时间上都是异质的，因此，如果取样和构造不是固定的，则很难在有关ECM组织的实验中得出结论。传统的 3D 定性方法，如 MRI 或 3D 声心动图，不提供解决 ECM 组件^9、10所需的分辨率。

这项工作详细介绍了一个完全相关的工作流程，其中通过修复与静水性转腔压力的粘液光伏的构象来解决心脏循环引起的时间异质性问题。空间异质性通过对感兴趣的区域进行采样和从不同的成像方式（特别是 μCT 和串行块面部扫描电子显微镜）中注册数据集，在不同的长度尺度上精确控制。这种用 μCT 进行侦察以引导下游取样的方法以前曾被提出过，但由于肺瓣膜存在时间变化，因此在手术¹¹级需要额外的控制水平。

在描述穆林心脏瓣膜生物力学的体内研究中，生物力学很少，相反，在描述变形行为时依赖于计算模型。纳米长度尺度上的局部细胞外数据与心脏瓣膜的几何形状和位置相关至关重要。这反过来又提供了可量化的、空间映射的机械贡献ECM蛋白分布，可用于强化现有的生物力学心脏瓣膜模型12、13、14。

Protocol

本研究中动物的使用符合全国儿童医院机构动物护理和使用委员会根据AR13-00030协议。

1. 肺瓣切除

1. 解密鼠标解剖所需的必要工具。这包括细剪刀、微钳子、微血管钳、夹子、微刀架、弹簧剪刀和缩回器。
2. 手术前至少让所有小鼠适应2周。将C57BL/6小鼠（大约1岁）从笼子中取出并称重，然后用氯胺酮/西拉津鸡尾酒（3:1氯胺酮:西拉津，每克0.01ml）过量服用安乐死。
3. 将鼠标放在托盘上的负位，用胶带固定其四肢。一旦固定，执行胸腔切除术。
   1. 通过去除任何多余的脂肪组织和筋膜来暴露心脏。
   2. 取出右中庭，用室温盐水溶液（0.9% NaCl）在左心室中灌注。灌注需要大约 20 mL 超过 30 秒。这会导致鼠标的排泄。
4. 切除高级静脉卡瓦、劣质静脉卡瓦、肺动脉和主动脉，切除整个心脏。应特别注意肺动脉。在通风口-动脉交界处上方切割约2毫米，因为这将作为加压的导管。
5. 取出左右心室，使腔室暴露在大气压力之下。确保肺干结构不受心室切除的影响。

2. 肺瓣膜压力固定

1. 带肺动脉的麻醉加压管，在管状结和管末端之间留下约1毫米的距离，以适应传单和肺干的巨大运动。
2. 将储层提升到类似的生理压力，并填充盐水溶液。测试流经系统，以确保没有堵塞或气泡。
3. 将止损卡连接到血管造影肺瓣上，通过切换外流道确保管道（即无气泡）的充足流动。一旦流量充足，将流出开关到血管肺瓣，并确保肺干加压。这是通过肺干消散来识别的。
4. 一旦肺干加压得到确认，逐步采用原固定溶液（1.25%谷胱甘肽，1.0%的甲醛在0.15M可可二甲酸酯），直到盐水溶液被清除。这是通过去除盐水溶液的一部分（约占储层容量的 25%），并将其替换为主要固定剂来完成的。
   注意事项:使用的固定剂（副甲醛和谷胱甘肽）是剧毒的，应佩戴适当的个人防护设备（PPE），以确保安全。
5. 在组织样品上放置固定浸泡纱布，以防止干燥。
6. 将固定剂香水敷料 3 小时，根据需要重新填充储层以保持恒定压力。在整个固定过程中，肺瓣膜因化学固定而收缩的情况并不少见。如果是这样的话，不断补充水库的主要固定，以保持生理压力。
7. 将心脏瓣膜存放在 4 °C 的固定溶液中，直到使用。样品存储长达1周，没有任何明显的差异。

3. 恩集团样品染色和嵌入^15，16

警告:本节中使用的染色试剂（铁氰化钾、四氧化二甲酸酯、硫碳水化合物、阿斯巴酸盐铅和醋酸尿素）具有剧毒性，应极其小心地处理。建议使用烟气罩和适当的 PPE。

1. 染色
   1. 用冷0.15 M可可二甲酸酯缓冲器清洗固定心脏瓣膜样本5分钟。再重复洗两次。
   2. 将心脏瓣膜完全浸入1.5%的铁氰化钾、0.15M可可硅酸盐、2mM氯化钙和2%四氧化硫溶液中，在冰上浸泡1小时。
   3. 当样品孵育时，将溶解 0.1 克 TCH 溶解在 10 mL 的 ddH₂O 中，将溶液放入 60 °C 烤箱中 1 小时，准备硫碳水化合物 （TCH） 溶液。定期轻轻搅拌，以确保TCH完全溶解。使用前立即通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤解决方案。
   4. 将样品放在 ddH₂O 管中 5 分钟，然后摇动容器，用室温 ddH₂O 清洗样品。重复此过程三次。
   5. 在室温下将其放到过滤的 TCH 溶液中 20 分钟。按照步骤 3.1.4 中描述的室温 ddH 2 O 执行三次（每次₅分钟）洗涤步骤。
   6. 完成后，将样品放在 2% 的四氧化硫中，在室温下放置 30 分钟。然后用室温 ddH₂O 再洗三次，每次 5 分钟。
   7. 在 4 °C 下将样品在 1% 的醋酸尿素中孵育过夜。
   8. 在此期间，在10mL的阿斯酸库存溶液中，制作0.066克硝酸铅溶液。调整 pH 值至 5.5 与 1 N KOH。将溶液放入 60 °C 烤箱中溶解硝酸铅。
   9. 隔夜孵化后，按照第 3.1.4 步的描述执行洗涤步骤。重复三次。然后，在 60 °C 烤箱中将心脏瓣膜组织从第 3.1.8 步开始，在铅阿斯巴酸盐溶液中孵育 30 分钟。
2. 脱水
   1. 在室温下用 ddH₂O 清洗组织 5 分钟，重复三次。
   2. 在 ddH₂O 中制作 20%、50%、70%、90% 和 100% 乙醇的新解决方案，在冰上保持直到使用。
   3. 使心脏瓣膜组织脱水。在冰上分别进行20%、50%、70%和90%乙醇的后续治疗，每次5分钟。然后在冰上进行两次100%乙醇的后续治疗，为期5分钟。
   4. 将组织移至冰冷丙酮10分钟。然后在室温下放上新鲜丙酮10分钟。
3. 嵌入
   1. 根据制造商的规格制作树脂混合物（见 材料表）:11.4 克 A 组件、10 克 B 组件、0.3 克成分 C 和 0.05-0.1 克组件 D。最初混合组件 A 和 B，将每个组件加热到 60 °C，然后添加组件 C 和 D。添加组件 C 和 D 后，混合物将变成琥珀色。适当混合时，将均匀。
   2. 制作体积比为 25:75、50:50 和 75:25 树脂:丙酮的混合物。彻底混合。
   3. 将组织放在随后的治疗中，在室温下分别处理25:75、50:50和75:25树脂:丙酮混合物2小时。
   4. 在室温下将组织放在100%树脂中过夜。
   5. 第二天，在室温下将组织放在新鲜的100%树脂中2小时。
   6. 将心脏瓣膜组织转移到嵌入胶囊中，用新鲜的 100% 树脂替代，并放入 60 °C 烤箱中 48 小时进行治疗。
4. 执行如下所示的相关成像。

4. 微计算断层成像

1. 用胶粘剂将树脂样品块安装到 μCT 样品支架上（胶水或双面胶带效果良好）。
2. 将支架放入 μCT 腔室，然后拧紧夹板将其固定在舞台上，这样支架就没有动静。扫描过程中的样品运动会降低图像质量。
3. 通过双击图标打开 μCT 用户界面。通过选择项目旁边的 + 符号来添加 项目 ，并填写必要的字段。
4. 创建后，查找创建的项目，然后单击它进行选择。这将打开第二列收购。选择收购旁边的 +并填写必要的字段。
5. 通过按下前面板或 μCT 上的臂按钮来关闭室门并武装系统。通过选择表示 预热的按钮，从用户界面进行预热 X 光检查。
   注:系统将在成功的热身手术后自动关闭 X 光片。通过选择按钮打开 X 光片。
6. 调整阶段旋转，使样品旋转的中心不会偏离监视器的中心（即样品在整个扫描的视野内）。对于此实验中使用的系统，这涉及到在下方详细的下拉选项卡下调整感兴趣区域 （ROI） 阶段。
   1. 通过将旋转角度设置为 0° 并标记示例边缘来设置 ROI 阶段调整。然后将样品旋转到 180°，并再次标记样品的边缘。
   2. 调整投资回报率阶段 x 轴位置，使样品的边缘在这两个极端之间。对于 y 位置的旋转角度为 90° 和 270° 重复此过程。
   3. 如果样品的旋转导致边缘移出视野，则减少 μCT 需求的放大倍数，直到以上述设定角度可见样本的边缘，并可以进行粗糙的投资回报率阶段调整。
   4. 一旦在较低的放大倍率调整，移动样品或探测器，以增加放大倍率和投资回报率位置可以精细调整。
      注:此过程可能需要重复，以确保对齐。适当的对齐结果在样品中显示很少或根本没有水平运动通过所有样品旋转角度。
7. 使用制造商的软件调整 μCT 以达到所需的扫描参数。这些参数包括管电位、管电流、探测器距离、样本距离、暴露时间、轨迹和投影数量（请参阅本研究中使用的 μCT 采集参数表 S1）。
   注:校准参数（如清晰场和暗场扫描）应保持在制造商的规格，除非另有说明。例如，如果样本太大，系统无法将样品移出现场视图，则需要删除样本以执行清晰的现场校准扫描。
8. 设置参数后，可以通过按 下时间估计 按钮来观察扫描持续时间的近似值。选择 "开始" 按钮以开始扫描。
9. 扫描完成后，确保关闭 X 射线，拧开小木屋，并小心地从 μCT 室中取出样品。

5. 样品处理与图像相关性

1. 使用制造商提供的软件使用过滤的背面投影算法重建 μCT 投影（参见 材料表）。
   1. 选择屏幕顶部的 Recon 选项卡。选择 项目 和 收购 选项卡。
   2. 选择与过滤后投影相关的重新构想模板。按下 "开始"重合 按钮。
2. 使用图像处理软件识别和分割肺瓣。这需要事先了解肺瓣^膜17的解剖学。在高架动脉压力下，传单会合体并阻塞肺瓣的流明。
3. 确定扫描方向和样品的切片方向。重新定位样品，使切片方向与所需的轴对齐。
4. 确定高分辨率成像感兴趣的区域。在这个实验中，选择了传单的腹部（中间）和动脉-瓦尔维拉交界处。
5. 去除多余的树脂，用剃须刀刀片或砂光取样，以获得大块材料，或用微原子取样，以取出更细的树脂。
6. 一旦到达感兴趣的位置，将物理标本与虚拟 μCT 切片进行比较以确认位置。这是通过比较横截面的解剖特征来完成的。

6. 串行块面部扫描电子显微镜¹⁸

1. 减少标本的横截面，以适应 SBF-SEM，约 2.0 x 1.5 x 1.8 mm。
2. 使用环氧树脂将修剪过的样品安装到 SBF-SEM 铝存根上。
3. 用 35 纳米黄金涂抹标本块。在平台上旋转样品以涂抹均匀的涂层。
4. 通风 SBF-SEM 室，将刀刃的高度调整为显微镜欧心高度。
5. 插入样品并平放样本存根。
6. 低真空条件下的图像，以防止充电和反散射探测器（请参阅 表 S2 的 SBF-SEM 采集参数）。
7. 使用自动化软件在不同的放大倍数下对多个感兴趣的区域进行图像和拼接（参见 材料表）。

Results

压管肺动脉的肺结膜病见图1A。在应用静水压力后，肺干会径向分散（图1B），表明肺瓣膜处于封闭配置中。肺瓣膜构造通过 μCT 确认。在这种情况下，传单是小品（封闭的），年鉴是圆形的（图2A）。图2B、C通过固定（图2B）或动脉塌陷（图2C）显示肺瓣加压不足程度不一。

样品块修剪由 μCT 卷渲染引导。在这种情况下，选择与中管交界处平行的平面作为切片方向。使用解剖地标，μCT 卷渲染虚拟横截面与光学图像 （图 3）相关，以确认切片方向和位置。

一旦标本块位于所需的位置和方向，在传单中的...

Discussion

切除心室有两个目的。首先，将心室侧暴露在大气压力之下，因此只需要从肺瓣的动脉侧施加转腔压力来关闭:其次，提供一个稳定的基座，以防止肺干扭动。在加压过程中，肺干径向和低劣地分散，容易扭动，导致肺干坍塌。用盐水溶液预装肺瓣膜可以进行额外的质量检查，以确保加压充足，并且系统中是否存在泄漏。主固定剂的动作速度很快，大约几秒钟，无需用盐水溶液进行静水预装，肺瓣膜将随机构象固定。在没有预装的情况下，封闭式肺瓣的成功率约为10%-20%。通过预装步骤，成功率超过 90%。

为此应用程序调整了 μCT 和 SBF-SEM 成像条件。肺瓣，当完全拉伸时，可以小于10μm厚。根据经验，能够解析一个功能需要 3 个 voxels 的阈值:因此，μCT 卷渲染的扫描尺寸为 2.9 μm，视野为 8.4 x 8.4 x 6.3 mm。较小的 voxel 尺寸可以在 μCT 中实现，但这需要样品修剪和/或更长的扫描时间。较小的样品将使其更接近 X 射线源，从而获得更高的分辨率。也可以通过将 X 射线探测器放置在离样品较远的位置来实现更小的 voxels;然而，这将减少探测器的总通量，并损害信号与噪声比。作为参...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25% 戊二醛 （aq）	EMS	16210	初级固定成分
0.9% 氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL 注射器	BD	309659
10 mL 注射器	BD	309604
200 防乙醇	EMS	15055
22G 针头	BD	305156
3 mL 注射器	BD	309657
3 通旋塞阀	Smiths Medical ASD， Inc.
4% 四氧化锇	EMS	19150	染色成分
4% 多聚甲醛 （aq）	EMS	157-4-100	初级固定成分
吸收止血剂	Ethicon	1961
丙酮	EMS	10012
黑色聚酰胺单丝缝合线，10-0	ARO紧急器械公司
黑色聚酰胺单丝缝合线，6-0	ARO紧急仪器公司	SN-1956
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratories	664	大约 1 yo
氯化钙	Sigma-Aldrich	10043-52-4
夹子应用镊子	FST	00072-14
棉尖涂抹器	FisherScientific	23-400-118
DPBS	Gibco	14190-144
Dumont #5 镊子	FST	11251-20
Dumont #5/45 镊子	FST	11251-35
Dumont #7 细镊子	FST	11274-20
Durcupan ACM 树脂	EMS	14040	用于嵌入
细剪刀	FST	14028-10
Heliscan microCT	Thermo Fisher Scientific		Micro-CT
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	56-84-8	染色组分
硝酸铅	EMS	17900	染色组分
低真空反向散射检测器	Thermo Fisher Scientific	VSDBS	SEM 反向散射检测器
微速电子	FST	11018-12
Millex-GP 过滤器，0.22 um，PES 33mm，非无菌	EMD Millipore	SLGP033NS
无纺布 songes	McKesson Corp.	94442000
六氰基铁酸钾（II） 三水合	Sigma-Aldrich	14459-95-1	染色成分
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	1310-58-3
压力监测管路	Smiths Medical ASD， Inc.	MX562
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
尺寸 3 BEEM 胶囊	EMS	69910-01	包埋容器
二甲胂酸钠三水合	Sigma-Aldrich	6131-99-3	缓冲
器 Solibri 牵开器	FST	17000-04
溅射、碳和电子束镀膜机	Leica	EM ACE600	金镀膜机
显微镜	Leica	M80
硫代碳酰肼 （TCH）	EMS	21900	染色组分
Tish 针架/镊子	Micrins	MI1540
修剪器	Wahl	9854-500
乙酸铀酰	EMS	22400	染色组分
Volumescope 扫描电子显微镜	Thermo Fisher Scientific	VOLUMESCOPESEM	系列块面部扫描电子显微镜
甲苯噻嗪无菌溶液	Akorn Inc.	NADA# 139-236