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方法文章

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

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⸱

DOI：

10.3791/62583

⸱

2022年3月31日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。

摘要

DNA中的双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤类型。由于多种损伤因素均可导致此类病变（例如复制应激、电离辐射、未修复的紫外线损伤），大多数细胞每天都会发生DSBs。除了引起细胞死亡外，未修复的DSBs还会降低基因组完整性，由此产生的突变可能促进肿瘤发生。这些风险以及DSBs的普遍性促使人们深入研究细胞修复这些损伤的机制。新一代测序技术可与电离辐射诱导的DSBs相结合，成为精确定义与DSB修复缺陷相关突变的有力工具。然而，该方法需要进行计算复杂且成本高昂的全基因组测序，以检测电离辐射所引发的随机分布的DSBs的修复情况。稀有切割内切酶（如I-SceI）能够产生单一的DSB，但其识别位点必须预先插入目标基因组中，因此修复位点本质上是人为构建的。近期的技术进展使得单导向RNA（sgRNA）可将Cas9内切酶靶向至任意感兴趣的基因组位点。这一技术可用于DSB修复的研究，通过将新一代测序聚焦于Cas9诱导的DSB侧翼区域，从而显著降低测序成本。本文的目标是通过展示一种可定义CD4基因上游DSB修复所引发突变的实验方案，验证该方法的可行性。该方案可被改造用于评估外源因素（如修复抑制剂、病毒蛋白表达、突变及环境暴露）对DSB诱变潜能的影响，且计算资源需求相对有限。一旦某生物体的基因组完成测序，该方法理论上可应用于该生物体任何可转染的细胞培养模型中的任意基因组位点。对该方法进行类似改造还可实现相同遗传背景下不同基因座之间修复保真度的比较。

引言

维持基因组稳定性对所有生物体都至关重要。准确的DNA复制和强大的DNA损伤应答（DDR）是遗传物质忠实传递所必需的1,2。在大多数细胞中，DNA损伤会频繁发生2,3。当这些损伤被识别后，细胞周期进程将被阻滞，同时激活DNA修复机制。DNA中的双链断裂（DSB）是最具毒性且最易引发突变的DNA损伤类型3,4。

尽管存在多种DNA损伤应答（DDR）信号通路可修复这些损伤，但研究最为深入的双链断裂（DSB）修复通路是同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。HR是一种基本无错误的修复途径，利用姐妹染色单体作为同源模板来修复DSB，通常发生在细胞周期的S期和G2期5,6,7。NHEJ则更容易出错，但可在整个细胞周期中发生8,9。目前已开发出多种报告基因检测方法，用于测量特定修复机制的效率10,11,12。这些检测通常依赖流式细胞术，通过GFP或mCherry信号的高通量检测来评估DSB修复通路的活性11,13。尽管这类方法效率很高，但其依赖于在人工引入的DSB位点发生经典的修复过程。

研究DNA双链断裂（DSB）修复的方法有多种。其中许多方法依赖于免疫荧光（IF）显微技术1,14。IF显微技术可检测到在基因毒性化学物质或电离辐射诱导产生DSB后，细胞核内形成的离散焦点，这些焦点代表了修复复合物的存在15,16。通过追踪这些焦点的形成与消退，可分别反映修复过程的启动与完成情况14,17。然而，这类DSB诱导方法（即使用化学物质或电离辐射）并不能在基因组的特定位置诱导产生DSB。此外，从功能上也无法利用这些方法稳定地仅诱导少量DSB（例如2–4个）。因此，目前最常用的DSB诱导方法会在基因组中随机产生大量损伤18。可通过插入一种罕见切割位点的内切酶识别序列，并表达相应的内切酶（如I-SceI）来引入少量DSB19。但遗憾的是，这种方法需要整合外源靶位点，因而无法用于研究内源性基因组位点上的DSB修复过程。

本文描述了一种检测与用户定义位点处产生的双链断裂（DSB）修复相关突变的方法。我们提供了一个代表性示例，展示该方法用于评估病毒蛋白是否能够增加与DSB相关的突变数量。具体而言，本文描述了使用单导向RNA（sgRNA）引导CAS9核酸酶，在表达空载体对照（HFK LXSN）的人包皮角质形成细胞以及表达人乳头瘤病毒8型E6蛋白（HFK 8E6）的细胞中，诱导人CD4开放阅读框位点产生DSB。通过对断裂位点周围区域进行靶向下一代测序（NGS），可严格界定与损伤修复相关的突变。这些数据表明，病毒蛋白在DSB修复过程中导致突变数量增加了约20倍。该方法还能在无需全基因组测序的情况下，对单一位点DSB的致突变后果进行无偏倚的表征。原则上，该实验方案可轻松适用于比较不同基因组位点或不同细胞系之间突变的相对风险。

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方案

1. 细胞铺板

  1. 在10 cm培养皿中，使用角质形成细胞培养基（每皿10 mL），添加人角质形成细胞生长添加剂（HKGS）和1%青霉素/链霉素，培养HFK LXSN和HFK 8E6细胞。将细胞在37 °C、5% CO2的加温培养箱中培养至约80%汇合度。
  2. 用3 mL胰蛋白酶-EDTA（0.05%，乙二胺四乙酸）替换培养基。在37 °C孵育3分钟。用等体积含胎牛血清（FBS）的补充培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至15 mL离心管中。以300 x g离心5分钟。
  3. 用10 mL含HKGS的角质形成细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度。
  4. 在6 cm培养皿中接种4 × 105个细胞/皿（HFK LXSN接种两皿，HFK 8E6接种两皿），每皿加入4 mL含HKGS以及1%青霉素和链霉素的角质形成细胞培养基。在37 °C、5% CO2的加温培养箱中培养。
    注意：本实验方案选择HFK细胞进行分析基于两个原因。首先，HFK是一种转染难度较高的细胞系。因此，若本方案在该细胞系中有效，则表明其在更常用且更易转染的细胞中也可能有效。其次，已有发表数据表明，一种病毒蛋白（8E6）会阻碍DNA双链断裂的修复20,21,22。因此，通过比较HFK LXSN和HFK 8E6细胞，可展示本检测方法检测与细胞修复能力下降相关的突变增加的能力。

2. 转染

  1. 转染当天（铺板后24小时），更换为3 mL无抗生素的补充培养基。在37 °C恒温培养箱中孵育2小时。
  2. 根据制造商说明书，使用适当的脂质体转染试剂对细胞进行转染。
    1. 使用前将转染试剂恢复至室温，并轻柔吹打混匀。
    2. 对于每种细胞系（HFK LXSN 和 HFK 8E6），在无菌的1.5 mL离心管（管1）中加入适量转染缓冲液（按制造商说明）。另取一管加入相同体积的转染缓冲液（模拟转染，即管2）。
    3. 向步骤2.2.2中的管1加入2 µg表达靶向人CD4的CAS9/sgRNA质粒DNA（px330-CD4，5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT），轻柔吹打以充分混匀。向管2中加入等体积的无菌水。
    4. 为每种细胞系设置仅含转染试剂（无质粒）的对照组培养板。
      注意：第二个培养板作为实验中的阴性对照，用于确认CAS9/sgRNA转染本身不会导致任何突变。
    5. 按照制造商说明，向步骤2.2.3中含DNA混合物的管（管1）以及步骤2.2.2中的模拟转染管（管2）加入适量转染试剂。轻柔吹打混匀，室温孵育15–30分钟，以确保复合物充分形成。
    6. 将转染混合物逐滴加入培养板中。轻轻摇动培养板1分钟，使转染混合物均匀分布。
  3. 转染后继续孵育48小时，以允许CAS9表达。
  4. 通过胰酶消化收集细胞。
    1. 将培养基更换为1 mL 0.05%胰酶-EDTA（乙二胺四乙酸）。在37 °C孵育3分钟。用等体积含FBS的补充培养基中和胰酶活性。
    2. 将每块培养板的细胞悬液等分转移至两个微量离心管中。在300 x g 离心5分钟。
    3. 将步骤2.4.2中一个离心管的细胞沉淀重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中用于测序。将另一个离心管的细胞沉淀用预冷的PBS重悬，用于免疫印迹分析。
  5. 收集全细胞裂解液用于免疫印迹分析。
    1. 在300 x g 离心5分钟，弃去上清液。
    2. 向离心管中加入100 µL放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA裂解缓冲液），其中含有1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂，用移液器充分混匀后，冰上孵育10分钟。
      注意：RIPA裂解缓冲液成分包括10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、1% Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS、140 mM NaCl以及去离子水。
    3. 在13,000 x g 条件下离心10分钟，收集上清液用于免疫印迹分析。

3. 通过免疫印迹检测CAS9表达

  1. 根据制造商说明书，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。
  2. 每份样品取 20 µg 蛋白，在 3%-8% Tris-乙酸凝胶的加样孔中电泳 150 分钟，随后进行半干转膜（10 V 转 30 分钟，再 25 V 转 12 分钟）至聚偏二氟乙烯膜上。
  3. 用含 0.1% Tween 的 PBS 缓冲液（PBST）配制的 5% 脱脂奶粉室温封闭膜 1 小时后，加入抗 CAS9 抗体（1:1000）和抗 GAPDH 抗体（1:1000），4 °C 过夜孵育。
  4. 用 PBST 洗涤膜后，在含 5% 脱脂奶粉的 PBST 中加入二抗，室温孵育 1 小时。
  5. 成像并用密度测定法分析条带23。代表性条带见图 1。
    注意：可通过免疫荧光显微镜检测磷酸化 H2AX（S139）焦点的形成，以验证 CAS9 活性14。焦点数量通常较少（一般为 1–4 个），具体数量取决于细胞周期位置、CAS9 靶位点是否发生突变而阻止进一步切割，以及目标基因组中 CAS9 切割位点的拷贝数。代表性图像见图 2。

4. 核酸提取与扩增子生成

  1. 使用高分子量DNA提取试剂盒，按照制造商说明，从步骤2.4.3的细胞样品中提取DNA。
  2. 根据产品说明书，用指定溶剂重悬引物。用相同试剂稀释至20 µM，并将20 µM引物混合至指定的引物池中。
    注意：引物池列于补充表1中。
  3. 根据表1中的说明，针对每个20 µM引物池，使用长片段扩增Taq聚合酶配制PCR主混合液。
    1. 将21 µL主混合液分别加入不同的PCR管中。
  4. 从步骤4.1中取4 µL目标样品（100 ng/µL），加入含有主混合液的PCR检测管中，并盖紧管盖。确保每种引物池分别进行独立反应。
    1. 涡旋振荡以混匀PCR检测管，短暂离心以去除管盖内壁的液滴。
    2. 将PCR管放入常规的热循环仪中。
    3. 按照表2中的说明设置PCR仪程序。
    4. 在热循环仪上运行程序。

5. PCR 产物纯化

  1. 使用基于磁珠的PCR纯化系统从PCR反应中去除引物。
    1. 在使用前30分钟将纯化磁珠从冰箱中取出。
    2. 使用前充分涡旋振荡磁珠，确保所有磁珠完全重悬。
    3. 向深孔96孔板的每孔中加入30 µL（1.2倍体积）重悬的磁珠。
    4. 向含有磁珠的各孔中加入25 µL PCR反应产物。
    5. 将板置于板式振荡器上，以2000 rpm振荡2分钟。
    6. 振荡后，将板在室温下静置5分钟。
    7. 将深孔板置于96孔磁力架上，孵育2分钟。
    8. 小心移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
    9. 保持板在磁力架上，向每孔加入180 µL 80%乙醇，孵育30秒后移除并弃去上清液。
    10. 重复步骤5.1.9。
    11. 使用10 µL移液器小心吸除各孔中残留的液体并弃去。
    12. 让磁珠在室温下干燥10分钟。
    13. 向含有磁珠的各孔中加入20 µL无核酸酶水，并将板从磁力架上取下。
    14. 在室温下以2000 rpm振荡板2分钟。
    15. 在室温下孵育板5分钟。
    16. 将板放回磁力架上，室温孵育2分钟。
    17. 将上清液转移至另一个已标记的PCR板中。此上清液即为纯化后的DNA。
  2. 使用荧光计测定每个反应的浓度。
    1. 确保双链DNA荧光计试剂已平衡至室温。
    2. 准备荧光定量检测管，另加两管用于标准品。
    3. 除最后两管外，其余各管均加入199 µL 1x双链DNA工作液；最后两管各加入190 µL工作液。
    4. 分别向两个检测管中各加入10 µL两种标准品（见材料表中提供）。
    5. 向荧光计主混合管中各加入1 µL PCR反应产物。
    6. 涡旋振荡各管混匀，在室温下孵育2分钟。
    7. 在荧光计主界面上选择正在使用的检测试剂盒（1x dsDNA），然后选择读取标准品并运行样本。
    8. 插入标准品1管，点击读取按钮，然后对标准品2重复该操作。
    9. 完成步骤5.2.6后，对一个样本重复相同操作，选择样本体积为1 µL，仪器将自动给出浓度结果。
    10. 对剩余样本重复步骤5.2.7。
  3. 根据以下公式计算所有反应的预期摩尔浓度，并对每个独立样本的反应分别等浓度混合（每个样本最终形成一个混合池）。
    DNA定量公式：皮摩尔/微升 = DNA浓度 / (0.66 × DNA大小（以1000 bp计）)
    1. 重复步骤5.2.1至5.2.7，以获得最终混合池的浓度。
  4. 按照制造商说明，在毛细管电泳仪或琼脂糖凝胶上检测扩增子混合产物。
    1. 根据样本数量准备相应数量的毛细管电泳管。按制造商说明加入7 µL DNA缓冲液。
    2. 向含DNA缓冲液的管中加入4 µL扩增子混合产物。
    3. 将管放入电泳仪，按照制造商针对双链DNA的说明运行程序。
    4. 观察电泳图像，确认条带位于约5 kb处（即扩增子大小）。
  5. 根据以下公式计算所有反应的预期摩尔浓度，并对每个独立样本的反应分别等浓度混合（每个样本最终形成一个混合池）。
    DNA定量公式：皮摩尔/微升 = DNA浓度 / (0.66 × DNA大小（以1000 bp计）)

6. 文库构建

  1. 将第 5.3.1 步中的样本池稀释至 0.2 ng/µL，用于文库制备。
    1. 使用适用于短序列（300 bp）的低投入量文库制备试剂盒，按照制造商说明书，为第 5.3 步中创建的每个样本池使用独特的索引组合制备文库。
      注意：请遵循制造商说明书选择索引序列。所有适用于该文库制备试剂盒的索引均可用于本实验样本。
    2. 完成文库制备后，按照制造商说明书将所有样本混合成文库池。
      注意：在构建文库池前，计算目标序列达到 250 倍覆盖深度所需的测序读长数量，并确保所选测序芯片可为每个包含的样本提供足够的覆盖深度。对于总计 0.5 Mb 的目标区域，需要 100 万条读长。
  2. 准备文库池用于测序。
    1. 解冻并准备一个 300 周期芯片及测序试剂。
    2. 根据测序仪制造商的说明书，对第 5.1.1 步中制备的测序文库池进行变性与稀释。
    3. 将变性并稀释后的文库池加入测序试剂中，并按照制造商规定运行测序仪。
      注意：故障排查请参见附录表 3。

7. 数据分析

注意：所有数据处理步骤均在基因组数据分析软件中进行。括号内表示用户输入。大于号表示每一步操作中的鼠标点击顺序（例如，1st 鼠标点击>2nd 鼠标点击

  1. 通过点击打开软件 > 导入 > Illumina > 选择文件 > 下一步 > 选择保存位置 > 完成来导入测序读段。此时读段将显示在软件中。
  2. 对读段进行修剪和过滤。
    1. 在深度测序数据分析软件中，使用默认参数对原始读段进行修剪。
    2. 选中读段，然后点击工具箱 > 准备测序数据 > 修剪读段 > 下一步 > 下一步 > 下一步 > 下一步 > 保存 > 下一步 > （选择保存位置）> 完成。
  3. 将修剪后的读段比对至参考序列。
    1. 使用步骤4.1中所用的参考序列，以匹配得分为2、错配代价为3、插入/缺失代价为2的参数，将修剪后的读段比对至参考序列。确保长度比对比例高于0.7，相似性比例不低于0.8。
    2. 选中修剪后的读段文件，点击工具箱 > 重测序分析 > 将读段比对至参考序列 > 下一步 > （选择参考序列）> 下一步 > （确保参数设置如上所述）> 下一步 > 保存 > （选择保存位置）> 完成。
  4. 提取变异位点和插入缺失（indels）。
    1. 使用合适的插入缺失检测工具，以p值阈值≤0.005、最大错配数为3的条件提取插入缺失。
    2. 选中比对后的读段文件，点击工具箱 > 重测序分析 > 变异检测 > 插入缺失和结构变异 > 下一步 > （确保输入所需的显著性参数）> 下一步 > 保存 > （选择保存位置）> 完成。
    3. 使用合适的变异检测工具，基于读段比对结果，以5%的显著性水平检测变异位点。
    4. 选中比对后的读段文件，点击工具箱 > 重测序分析 > 变异检测 > 低频变异检测 > 下一步 > （确保输入所需的显著性参数）> 下一步 > 下一步 > 保存 > （选择保存位置）> 完成。
      注意：在插入缺失和变异检测过程中，需考虑宿主基因组的倍性。不得提取频率低于5%的突变体，该阈值可排除与实验相关的PCR扩增和测序错误。应通过调整测序深度对数据进行归一化处理（基于免疫印迹检测CAS9的表达水平）。例如，若样本A的转染效率是样本B的两倍，则应仅使用样本A中50%的读段进行分析。该操作应通过随机抽样完成，且任何样本的测序深度均不得低于100x。

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结果

本方案展示了三个代表性实验结果。图1为免疫印迹结果，证实了CAS9在HFK对照细胞（LXSN）及表达β-人乳头瘤病毒8E6（8E6）的HFK细胞中的表达情况。转染48小时后，收集全细胞裂解液，并使用抗CAS9抗体（或以GAPDH作为上样对照）进行检测。结果显示，HFK LXSN与HFK 8E6细胞中CAS9的表达量相似，表明两种细胞系的转染效率相当。图2为免疫荧光显微镜图像，通过pH2AX焦点（DSB的经典标志物24）显示CAS9诱导的DNA双链断裂（DSB）。该结果表明，CAS9/sgRNA成功诱导了两个DSB，证实DSB的产生符合预期。图3显示，8E6可增加CAS9诱导的DSB位点周围200 Kb范围内的基因组变异22。该发现与HPV8 E6蛋白扰乱DSB修复并加剧基因组不稳定性这一假说一致。本图...

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讨论

除了所提供的信息深度之外，该方法还具有多个优势。首先，理论上，无需对目标细胞的基因组进行修饰，即可在任何基因组位点评估双链断裂（DSB）修复。其次，由于仅需在特定区域诱导并分析单个靶向的DSB，从而降低了测序成本和计算分析的复杂性，使得高通量测序（NGS）对修复过程的分析更加便捷。最后，随着越来越多物种的基因组被陆续解析，以及多项研究已成功实现多种哺乳类和非哺乳类细胞系的转染，预计该方法的应用范围将十分广泛10,23,24。

本研究以人包皮角质形成细胞中的DNA双链断裂（DSB）修复作为示例进行分析。角质形成细胞的转染效率通常低于其他组织类型。因此，本实验方案采用了一种针对这类难转染细胞优化的转染方法。应根据所研究的细胞类型对转染方法进行相应优化。本方案中使用的CAS9诱导DSB的能力已在骨肉瘤、结肠癌、肺癌、成纤维细胞、胚胎肾细胞及人角质形成细胞中得到验证10...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本手稿中报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（P20GM130448）（NAW 和 RP）；美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI R15 CA242057 01A1）；堪萨斯州立大学约翰逊癌症研究中心；以及美国国防部（CMDRP PRCRP CA160224（NAW））的资助。我们感谢堪萨斯州立大学兽医学院共聚焦成像中心及 Joel Sanneman 在免疫荧光显微镜实验方面的支持。本研究内容仅由作者负责，不代表上述资助机构的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 孔组织培养板Celltreat229106细胞培养板
BCA 试剂盒VWR89167-794BCA 检测试剂盒
Centrifuge 5910 REppendorf2231000772台式离心机
CLC Genomic WorkbenchQiagen832001深度测序数据分析软件/插入缺失检测工具/变异检测工具
Digital Microplate Genie pulseScientific industriesSI-400A微孔板振荡器
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)ThermoFisher ScientificMA191878抗 FLAG 抗体
Epilife CF 试剂盒ThermoFisher ScientificMEPICF500细胞培养基及添加剂
胎牛血清（FBS）VWR89510-194细胞培养添加剂
山羊抗兔 IgGThermoFisher ScientificA-11012二抗
HighPrep PCR Clean-up 系统MagBioAC-60005基于磁珠的 PCR 纯化试剂盒
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR 试剂盒KAPA BiosystemsKK2600PCR 预混液/PCR 检测试剂
MagAttract HMW DNA 试剂盒Qiagen67563高分子量 DNA 提取试剂盒
96 孔磁力架Thermo Fisher ScientificAM1002796 孔磁力架
MiniAmp 温控循环仪Applied BiosystemsA37834温控循环仪
MiseqIlluminaSY-410-1003测序仪
Miseq v2 300 循环试剂盒IlluminaMS-102-2002300 循环测序 cartridge/测序试剂
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒IlluminaFC-131-1024文库制备试剂盒
Nextera XT 试剂盒 v2 A 组Illumina20027215Index 引物组
Nunc 96 孔聚丙烯深孔储存板Thermo Fisher Scientific26025196 孔深孔板
青霉素-链霉素溶液（100X）Calsson LabsPSL02-6X100ML细胞培养用抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）Bio BasicPD8117PBS
px330-CD4Addgen136938靶向 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT 的 sgRNA/CAS9 质粒
QIAxcel Advanced 系统Qiagen9001941毛细管电泳仪
QIAxcel DNA 筛查试剂盒Qiagen929004DNA 缓冲液/毛细管电泳管
Qubit 1x ds HS 检测试剂盒ThermoFisher ScientificQ23851荧光计试剂/1x dsDNA 溶液
Qubit 4 荧光计ThermoFisher ScientificQ33238荧光计
Qubit 检测管Thermo Fisher ScientificQ32856荧光计检测管
RIPA 裂解缓冲液VWRVWRVN653-100ML蛋白提取用裂解缓冲液
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红ThermoFisher Scientific25300054胰蛋白酶
Vortex-Genie 2Scientific industriesSI-0236涡旋振荡器
Xfect 转染试剂Takara Bio631318转染试剂
基因组数据分析软件QIAGENCLC Workbench v21.0.数据分析软件

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