使用下一代测序来鉴定与CD4启动子附近CAS9诱导的双链断裂修复相关的突变

Summary

这里介绍的是sgRNA / CAS9内切酶和下一代测序方案，可用于鉴定与CD4启动子附近的双链断裂修复相关的突变。

Abstract

DNA中的双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤类型。由于无数的侮辱可导致这些病变（例如，复制应激，电离辐射，未修复的紫外线损伤），DSB每天都会发生在大多数细胞中。除了细胞死亡之外，未修复的DSB还会降低基因组完整性，由此产生的突变会驱动肿瘤发生。这些风险和DSB的患病率促使人们研究细胞修复这些病变的机制。下一代测序可以与电离辐射诱导DSB配对，以提供一种强大的工具来精确定义与DSB修复缺陷相关的突变。然而，这种方法需要计算上具有挑战性且成本高昂的全基因组测序来检测与电离辐射相关的随机发生的DSB的修复。罕见的切割内切酶，如I-Sce1，提供了产生单个DSB的能力，但它们的识别位点必须插入到感兴趣的基因组中。因此，修复部位本质上是人为的。最近的进展允许引导RNA（sgRNA）将Cas9内切酶引导到任何感兴趣的基因组位点。这可以应用于DSB修复的研究，通过允许下一代测序专注于Cas9诱导的DSB侧面的DNA，使下一代测序更具成本效益。该手稿的目标是通过提出一种方案来证明这种方法的可行性，该协议可以定义源自CD4基因上游DSB修复的突变。该方案可以调整以确定与外源性因素相关的DSB诱变潜力的变化，例如修复抑制剂，病毒蛋白表达，突变和环境暴露，计算要求相对有限。一旦对生物体的基因组进行了测序，这种方法理论上可以在任何基因组位点和可以转染的生物体的任何细胞培养模型中使用。对这种方法的类似改编可以比较同一遗传背景中不同位点之间的修复保真度。

Introduction

保持基因组稳定性对所有生物体都至关重要。准确的DNA复制和强大的DNA损伤反应（DDR）对于忠实地繁殖遗传物质^1，2是必要的。DNA损伤在大多数细胞中定期发生^2，3。当这些损伤被感知时，细胞周期进展停止，DNA修复机制被激活。DNA或DSB中的双链断裂是毒性和致突变性最强的DNA损伤类型^3，4。

虽然几种DDR信号通路可以修复这些病变，但研究最彻底的DSB修复途径是同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。HR是一种基本上无差错的途径，它使用姐妹染色单体作为同源模板来修复DSB。这往往发生在细胞周期^5，6，7的S期和G2期。NHEJ更容易出错，但它可以在整个细胞周期^8，9中发生。已经开发了各种报告物测定法来测量特定修复机制^10，11，12的效率。这些测定倾向于依靠流式细胞术，使用GFP或mCherry作为读数^11，13对DSB修复途径活性进行高通量测量。虽然效率很高，但它们依赖于在人为引入的DSB上进行的规范修复。

还有许多其他方法可用于研究DSB修复。其中许多依赖于免疫荧光（IF）显微镜^1，14。IF显微镜检测在DSB暴露于遗传毒性化学物质或电离辐射^15，16诱导后代表修复复合物的离散核病灶。跟踪这些病灶的形成和消退分别提供了修复开始和完成的指示，分别为^14，17。然而，这些DSB诱导方法（即化学物质或电离辐射）不会在基因组中定义的位置引起DSB。在功能上也不可能使用它们来始终如一地诱导少量（例如，2-4个）的DSB。结果，最常用的诱导DSBs的方法导致大量病变随机分布在整个基因组¹⁸中。通过插入罕见切割内切内切酶的识别位点并表达相关的内切酶（例如I-Sce1¹⁹），可以引入少量DSB。不幸的是，目标位点的必要整合阻止了在内源性基因组位点检查DSB。

本手稿描述了一种检测与在用户定义的位点处生成的DSB修复相关的突变的方法。我们提供了一个代表性的例子，说明该方法适用于评估病毒蛋白增加与DSB相关的突变数量的能力。具体而言，本手稿描述了使用单一引导 RNA （ sgRNA ）来指导 CAS9 内切酶在人包皮角质形成细胞表达载体对照（ HFK LXSN ）和表达人瘤病毒 8 型（ HFK 8E6 ）的 E6 蛋白的人类 CD4 开放阅读框处诱导 DSB 。断裂周围区域的靶向下一代测序（NGS）允许严格定义与病变修复相关的突变。这些数据表明，病毒蛋白在DSB修复过程中导致突变增加约20倍。它还提供了DSBs在单个位点的诱变后果的无偏表征，而无需进行全基因组测序。原则上，该方案可以很容易地进行调整，以比较基因组位点或细胞系之间突变的相对风险。

Protocol

1. 细胞电镀

1. 在角质形成细胞培养基（10 mL /板）中，用人角质形成细胞生长补充剂（HKGS）和1%青霉素/链霉素在10cm平板中生长HFK LXSN和HFK 8E6细胞。在具有5%CO₂的夹套培养箱中，在37°C下将细胞生长至约80%汇合。
2. 用3mL胰蛋白酶EDTA（0.05%，乙二胺四乙酸）代替培养基。在37°C下孵育3分钟。用等体积的胎牛血清（FBS）补充培养基中和胰蛋白酶，并将细胞转移到15mL离心管中。以300 ×g 离心5分钟。
3. 用HKGS重悬10 mL角质形成细胞培养基。用血细胞计数器测定细胞的浓度。
4. 板4 x 10⁵ 细胞/ 6-cm板（两个用于HFK LXSN的平板和两个用于HFK 8E6的平板）在4mL角质形成细胞培养基中，用HKGS和1%青霉素和链霉素。在37°C下在含有5%CO₂的夹套培养箱中生长。
   注意:出于两个原因，为该方案选择了HFK细胞的分析。首先，HFK是一种难以转染的细胞系。因此，通过证明该方案在该细胞系中起作用，提供了证据表明它可能在更常用和更容易转染的细胞中起作用。其次，先前发表的数据表明，病毒蛋白（8E6）阻碍了DNA ^20，21，22中双链断裂的^修复。因此，比较HFK LXSN和HFK 8E6使我们能够证明该测定法检测与细胞修复能力降低相关的突变增加的能力。

2. 转染

1. 在转染当天（接种后24小时），用3 mL无抗生素补充培养基替换培养基。在夹套培养箱中在37°C下孵育2小时。
2. 根据制造商的说明，使用适当的脂质转染试剂转染细胞。
   1. 使用前将转染试剂加热至室温并轻轻移液。
   2. 对于每个细胞系（HFK LXSN和HFK 8E6），将适量的转染缓冲液（按照制造商的指示）放入无菌的1.5 mL离心管（试管1）中。包括另一个具有相同量转染缓冲液的试管（模拟转染或试管2）。
   3. 从步骤2.2.2向试管1中加入2μg表达靶向人CD4的CAS9 / sgRNA的质粒DNA（px330-CD4，5'-GGCGTATCTGTGTGAGACT）。轻轻移液以完全混合。向试管2中加入等体积的无菌水。
   4. 包括每个细胞系仅含有转染试剂（无质粒）的对照板。
      注意:第二个板在实验中用作阴性对照，允许用户确认用CAS9 / sgRNA转染不对任何突变负责。
   5. 将适量的转染试剂（按照制造商的指示）与步骤2.2.3中的DNA混合物（试管1）和步骤2.2.2中的模拟转染（试管2）一起加入试管中。轻轻移液以完全混合。在室温下孵育15-30分钟，以留出足够的时间形成复合物。
   6. 将转染混合物逐滴加入平板中。轻轻摇动培养物1分钟，使转染混合物均匀分布。
3. 转染后孵育48小时，以允许CAS9表达。
4. 通过胰蛋白酶消化收获细胞。
   1. 用1mL胰蛋白酶-EDTA（0.05%，乙二胺四乙酸）代替培养基。在37°C下孵育3分钟。用等体积的FBS补充培养基中和胰蛋白酶。
   2. 对于每板细胞，将细胞悬浮液转移到两个具有相等等分试样的微量离心管中。以300 ×g 离心5分钟。
   3. 在步骤2.4.2中将细胞沉淀从一管中重悬于1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行测序。用冰冷的PBS重悬于步骤2.4.2中的另一根管以进行免疫布纹。
5. 收获整个细胞裂解物用于免疫印迹。
   1. 将管以300 ×g 离心5分钟。弃去上清液。
   2. 向管中加入100μL放射免疫沉淀测定缓冲液（RIPA裂解缓冲液）与1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂混合，用移液管充分混合并在冰上孵育10分钟。
      注意:RIPA裂解缓冲液含有10mM三盐酸，pH 8.0;1 mM 乙二胺四乙酸;0.5 mM EGTA;1% 曲拉通 X-100;0.1%脱氧胆酸钠;0.1% 安全数据表;140 mM NaCl和去离子水。
   3. 离心机以13，000 ×g 裂解物10分钟。收集免疫印迹的上清液。

3. 通过免疫印迹测量CAS9的表达

1. 根据制造商的说明，用双辛胆酸（BCA）测定测定蛋白质浓度。
2. 在3%-8%三醋酸甘油酯凝胶的孔中运行每个样品的20μg蛋白质150分钟，然后半干转印（10 V 30分钟，然后25 V 12分钟）到聚偏二氟乙烯膜。
3. 在室温下用0.1%吐温（PBST）在PBS中阻断5%脱脂奶粉中的膜1小时后，加入抗CAS9（1:1000）和抗GAPDH（1:1000）抗体。在4°C下孵育过夜。
4. 用PBST洗涤膜后，将膜与二抗在PBST中的5%脱脂奶粉中在室温下孵育1小时。
5. 对印迹进行成像，并通过密度测定²³确定CAS9水平。有关代表性印迹，请参见 图 1 。
   注意:通过免疫荧光显微镜检测磷酸化的H2AX（S139）病灶的形成可用于验证CAS9活性¹⁴。根据细胞周期位置，CAS9靶位点中的突变是否阻止进一步切割，以及感兴趣的基因组中存在多少个CAS9切割位点，预计会有少量不同的病灶（通常为1-4个病灶）。代表性图像如图 2所示。

4. 核酸提取和扩增子生成

1. 使用制造商指定的高分子量DNA提取试剂盒从步骤2.4.3的细胞样品中提取DNA。
2. 根据数据表，用指定的溶剂重悬引物。用相同的试剂稀释至20μM，并将20μM引物池池放入指定的池中。
   注:引物池列于 补充表1中。
3. 使用长扩增 Taq 聚合酶为每个20μM引物池创建PCR预混液，如 表1中所述。
   1. 加入21μL母混料到分离的PCR管中。
4. 从步骤4.1中加入4μL目标样品（100ng / μL）到含有主混料和帽测定管的PCR测定管中。确保每个引物池的反应分开。
   1. 涡旋混合PCR测定管和离心机（快速旋转）以去除管盖上的液滴。
   2. 将PCR管放在传统的热循环仪上。
   3. 程序PCR机器如 表2中所述。
   4. 在热循环仪上运行程序。

5. PCR纯化

1. 使用基于磁珠的PCR纯化系统从PCR反应中除去引物。
   1. 使用前30分钟从冰箱中取出清洁珠子。
   2. 使用前充分涡旋磁珠，并确保所有磁珠都重悬。
   3. 向深孔96孔板的每个孔中加入30μL（1.2x）重悬微球。
   4. 向含有磁珠的孔中加入25μLPCR反应物。
   5. 将板放在2000rpm的平板振荡器上2分钟。
   6. 摇动后让板在室温下保持5分钟。
   7. 将深孔板放在96孔板磁铁上并孵育2分钟。
   8. 除去并丢弃上清液，没有干扰珠子。
   9. 当板保持在磁铁上时，加入180μL80%乙醇并孵育30秒。取出并丢弃上清液。
   10. 重复步骤 5.1.9。
   11. 使用10μL移液器，从孔中取出并丢弃任何剩余的液体。
   12. 让珠子在室温下干燥10分钟。
   13. 向含有磁珠的孔中加入20μL无核酸酶水，并从磁铁中取出板。
   14. 在室温下以2000rpm摇动板2分钟。
   15. 将板在室温下孵育5分钟。
   16. 将板放在磁铁支架上，并在室温下孵育2分钟。
   17. 将上清液取出到第二个标记的PCR板中。这包含清理后的DNA。
2. 用荧光计测量每个反应的浓度。
   1. 确保dsDNA荧光计试剂处于室温下。
   2. 设置荧光测定管和两个额外的标准管。
   3. 向除两个试管外的所有管中加入199μL的1x dsDNA工作溶液。将190μL工作溶液加入最后两个试管中。
   4. 加入10μL两种标准品（包含在 材料表中）以分离测定管。
   5. 向荧光计主混管中加入1μL每个PCR反应物。
   6. 涡旋管在室温下混合并孵育2分钟。
   7. 在荧光计的主屏幕上，选择带有测定试剂盒使用（1x dsDNA）的按钮，然后选择 读取标准品并运行样品。
   8. 插入标准 1 管，选择" 读取 "按钮，然后对标准 2 重复上述步骤。
   9. 按照步骤5.2.6，对一个样品重复，选择1μL的样品体积，并将提供所得浓度。
   10. 对其余样品重复步骤5.2.7。
3. 使用以下等式计算所有反应的预计摩尔浓度，并分别从每个样品（每个样品一个最终池）中池中分别池化相等的反应浓度。
   
   1. 重复步骤5.2.1至5.2.7以获得最终的池浓度。
4. 检查制造商指定的毛细管电泳机/琼脂糖凝胶上的扩增子池。
   1. 为适当数量的样品准备毛细管电泳管。加入制造商指定的7μLDNA缓冲液。
   2. 将4μL扩增子池加入含有DNA缓冲液的管中。
   3. 将试管放在电泳机上，然后按照制造商为dsDNA指定的机器运行机器。
   4. 查看电泳凝胶图片，确保条带定位到~5 kb（扩增子大小）。
5. 使用以下等式计算所有反应的预计摩尔浓度，并分别从每个样品（每个样品一个最终池）中池中分别池化相等的反应浓度。
   

6. 文库准备

1. 从步骤5.3.1稀释样品池至0.2ng / μL以进行文库制备。
   1. 使用与短序列（300bp）兼容的低输入文库制备试剂盒，按照制造商的说明，使用步骤5.3中创建的每个样品池的唯一索引组合来制备文库。
      注:按照制造商的说明选择索引序列。所有适合文库制备试剂盒的索引都适用于样品。
   2. 在文库制备之后，根据制造商的说明将所有样品池化。
      注意:在创建文库池之前，请计算目标序列250倍覆盖率所需的读取次数，并确保所选测序盒能够为每个包含的样品提供足够的覆盖率。对于总共0.5Mb，这将相当于1M次读取。
2. 准备用于测序的文库池。
   1. 解冻并制备300循环的墨盒和测序试剂。
   2. 根据测序仪制造商的说明，使步骤5.1.1中创建的测序池变性并稀释。
   3. 将变性和稀释的文库池添加到测序试剂中，并按照制造商指定 运行 测序机。
      注:有关故障排除，请参阅随附的 表 3 。

7. 数据分析

注意:所有数据步骤都在基因组数据分析软件中执行。括号表示用户输入。大于符号表示任何给定步骤（例如，^{第 1 次} 鼠标单击>2^次 鼠标单击）的鼠标单击顺序

1. 通过单击" 打开软件" > 导入 > Illumina > "选择文件" > "下一步 "> 选择要保存的位置来导入 读数> 完成。读取现在将显示在软件中。
2. 修剪和过滤读取。
   1. 在深度序列数据分析软件中，修剪原始读取默认参数。
   2. 突出显示读取，然后单击 工具箱>准备排序数据>修剪读取>下一个>下一个 > 下一个 > 下一个 > 保存 > 下一个> （选择要保存的位置） > 完成
3. 将修剪后的读取映射到引用。
   1. 使用匹配分数2，不匹配成本为3，插入/删除成本为2，将修剪后的读取映射到步骤4.1中使用的参考序列。确保长度分数高于 0.7，相似性分数等于或高于 0.8。
   2. 突出显示修剪后的读取文件，然后单击 工具箱>重新排序分析>将读取映射到引用>下一个>（选择参考序列）>下一个>（确保参数如上所示）>下一步>保存>（选择要保存的位置）>完成。
4. 提取变体和插入项。
   1. 使用适当的插入码调用方，使用 p 值阈值为 0.005 或更低且最大不匹配数为 3 来提取插入。
   2. 突出显示映射的读取文件，然后单击 工具箱>重新排序分析>变体检测>印加和结构变体检测>下一>（确保输入所需的显著性>下一步>保存>（选择要保存的位置）>完成。
   3. 使用适当的变体调用方，使用 5% 的显著性从读取映射调用变体。
   4. 突出显示映射的读取文件，然后单击 工具箱>重新排序分析>变体检测>低频变体检测 > 下一个>（确保输入所需的显著性> 下一个 > 下一个 > 保存>（选择要保存的位置）>完成。
      注意:确保在插入缺失和变异调用方中考虑宿主基因组的倍体。不要提取低于5%的突变体。该阈值考虑了与测定相关的PCR和测序错误。归一化（基于CAS9的免疫布体检测）应通过调整测序覆盖率来完成。例如，如果样品A的转染效率是样品B的两倍，则样品A的50%读数应用于分析。这应该通过随机抽样来完成，而不是减少任何样本低于100倍的覆盖率。

Results

针对该方案提出了三个具有代表性的结果。 图1 是免疫印迹确认CAS9在HFK对照（LXSN）和HFK表达β-HPV 8E6（8E6）中的表达。转染后48小时，收获全细胞裂解物，随后用抗CAS9抗体（或GAPDH作为上样对照）探针。结果表明，HFK LXSN和HFK 8E6表达的CAS9量相似，表明两个细胞系之间的转染效率相似。 图2 是免疫荧光显微镜图像，显示CAS9使用pH2AX病灶（DSBs²⁴的标准标记物）诱导的DSBs。这表明两个DSB是由CAS9 / sgRNA诱导的，从而证实了DSB诱导正在按预期发生。 图3 显示，8E6在CAS9诱导的DSB 22周围增加了²⁰⁰ Kb范围内的基因组变异。这与HPV8 E6解除对DSB修复的调节并增加基因组不稳定性的假设一致。此图显示了从此方法获取的数据...

Discussion

除了提供的信息深度之外，此方法还具有几个优点。首先，DSB修复，从理论上讲，可以在任何基因组位点进行评估，而无需修改目标细胞的基因组。其次，通过制作和分析针对定义区域的单个DSB，降低了成本和计算工作量，从而增加了对修复的NGS分析的访问。最后，随着其他生物体的基因组常规可用，并且多个出版物证明成功转染了不同的哺乳动物和非哺乳动物细胞系，这种方法的效用预计将广泛^10，23，24。

本文分析了人类包皮角质形成细胞中的DSB修复作为说明性示例。角质形成细胞的转染效率往往低于其他组织类型。因此，该方案使用了针对这些难以转染的细胞优化的转染方法。转染方法应针对所分析的细胞类型进行优化。该方案中使用的CAS9诱导的DSB的能力已在骨肉瘤，结肠癌，肺癌，成纤维细胞，胚胎肾和人角质形成细胞^10，23

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 孔组织培养板	Celltreat	229106	细胞培养板
BCA 试剂盒	VWR	89167-794	BCA 检测试剂盒
离心机 5910 R	Eppendorf	2231000772	台式离心机
CLC 基因组工作台	Qiagen	832001	深度序列数据分析软件/插入缺失调用者/变体调用者
数字微孔板 Geniepulse	Scientific industries	SI-400A	摇板仪
DYKDDDDK 标签单克隆抗体 （FG4R）	ThermoFisher Scientific	MA191878	抗 FLAG 抗体
Epilife CF 试剂盒	ThermoFisher Scientific	MEPICF500	细胞培养培养基和补充剂
胎牛血清 （FBS）	VWR	89510-194	细胞培养补充剂
山羊抗兔 IgG	ThermoFisher Scientific	A-11012	二抗
HighPrep PCR 纯化系统	MagBio	AC-60005	基于微珠的 PCR 纯化试剂盒
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR 试剂盒	KAPA Biosystems	KK2600	PCR 预混液/PCR 检测
MagAttract HMW DNA 试剂盒	Qiagen	67563	高分子量 DNA 提取试剂盒
磁力架-96	Thermo Fisher Scientific	AM10027	96 孔磁力架
MiniAmp 热循环仪	Applied Biosystems	A37834	热循环仪
	Miseq Illumina	SY-410-1003	测序仪
Miseq v2 300 循环试剂盒	Illumina	MS-102-2002	300 循环卡盒/测序试剂
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1024	文库制备试剂盒
Nextera XT 试剂盒 v2 套装 A	Illumina	20027215	索引
Nunc 96 孔聚丙烯深孔板	Thermo Fisher Scientific	260251	深孔 96 孔板
青霉素-链霉素溶液 （100X）	Calsson Labs	PSL02-6X100ML	细胞培养用抗生素
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	靶向	PD8117	PBS
px330-CD4	Addgen	136938	SgRNA/CAS9质粒
QIAxcel Advanced System	Qiagen	9001941	毛细管电泳机
QIAxcel DNA筛选试剂盒	Qiagen	929004	DNA缓冲液/毛细管
Qubit 1x ds HS检测试剂盒	ThermoFisher科学级	Q23851	荧光计试剂/1x dsDNA 溶液
Qubit 4 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33238	荧光计
Qubit 检测管	Thermo Fisher Scientific	Q32856	荧光计检测管
RIPA 裂解缓冲液	VWR	VWRVN653-100ML	用于蛋白质提取的裂解缓冲液
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红	ThermoFisher Scientific	25300054	胰蛋白酶
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
Xfect 转染试剂	Takara Bio	631318	转染试剂
基因组数据分析软件	QIAGEN	CLC Workbench v21.0。	数据分析软件