冈 比亚按蚊 胚胎的显微注射方法

摘要

显微注射技术对于将外源基因引入蚊子的基因组至关重要。该协议解释了詹姆斯实验室使用的一种方法，该方法将DNA构建体微注射到 冈比亚按蚊 胚胎中以产生转化的蚊子。

摘要

胚胎显微注射技术对于许多昆虫物种的分子和遗传学研究至关重要。它们提供了一种以稳定和可遗传的方式将编码感兴趣基因的外源DNA片段以及有利性状引入昆虫种系的方法。由此产生的转基因菌株可以研究由整合DNA的表达引起的表型变化，以回答基本问题或用于实际应用。虽然该技术很简单，但它需要调查人员的耐心和实践，以实现最大化效率的技能水平。这里展示的是一种对非洲疟疾蚊子冈 比亚按蚊胚胎进行显微注射的方法。目标是通过显微注射外源DNA递送到胚胎中，以便它可以在发育中的种系（极点）细胞中被吸收。转座酶、整合酶、重组酶或其他核酸酶（例如CRISPR相关蛋白，Cas）的注射DNA的表达可以触发导致其共价插入染色体的事件。由这些技术产生的转基因 冈比亚锥虫 已被用于免疫系统成分，参与血液喂养的基因和嗅觉系统元素的基础研究。此外，这些技术已被用于生产 冈比亚锥虫 菌株，其性状可能有助于控制疟疾寄生虫的传播。

引言

自20世纪初以来，显微注射技术已被用于实验性地操纵生物体¹。显微注射已用于研究基本生物学功能和/或在所需生物体的生物学中引入重要变化。显微注射技术一直受到载体生物学家的特别兴趣，并已被广泛用于操纵载体基因组^2-11。节肢动物载体中的转基因实验通常旨在通过实施降低载体适应性或增加对它们传播的病原体的难治性的改变来降低载体传播病原体的效率。蚊子传播多种人类病原体，对全世界的发病率和死亡率产生重大影响。蚊子的按蚊属传播人类疟疾寄生虫病原体疟原虫属。按蚊的基因工程实验旨在更好地了解这些蚊子的生物学并降低其媒介能力，以制定新的疟疾消除策略。

全世界疟疾感染最多的蚊媒位于 冈比亚按蚊 物种群中。然而，大多数成功的转基因实验都是在印度次大陆的疟疾病媒 按蚊斯蒂芬西上进行的。虽然存在大量实验室适应的 冈比亚按蚊 菌株，但文献中报道的转基因 冈比亚按蚊属 系的数量与 按蚊斯蒂芬西的菌株无法相比。据认为， 冈比亚按蚊 胚胎比 按蚊更难注射并实现成功的转基因，尽管这些差异的原因尚不清楚。该协议描述了一种已被证明通过显微注射实现 冈比亚按蚊 胚胎转基因遗传的方法。该协议基于Hervé Bossin和Mark Benedict¹² 先前开发的方法，并添加了一些额外的细节和更改，这些细节和更改已被发现可以提高转基因的效率。

方案

1. 准备蚊子进行显微注射

1. 在13（~5000厘米^3）的笼子里播种，其中约100只雄性和200-300只雌性1-2天成虫，并让它们交配2天。
2. 交配期过后，根据昆虫实践，使用2毫升带有人工喂养装置的血液或活麻醉动物为蚊子提供血粉^14。第二天为蚊子提供第二份血餐，以确保所有交配的雌性都有机会进食，并且部分喂养的蚊子已经完全充血。
3. 在第二次血粉后2-4天利用蚊子进行胚胎收集。
   注意:幼虫营养对成虫健壮和生殖健康很重要。请参阅Benedict等人（2020）以获取有关如何饲养健康昆虫的信息¹⁴。当蚊子在人工饲养器或活体麻醉动物上喂食时，没有观察到产卵的显着差异。使用昆虫中冈 比亚按蚊 常规使用的任何方法。

2. 胚胎制备

1. 使用吸气器将20-30名女性置于透明的50 mL锥形管中，该锥形管已被切割（用带锯）在两端打开，一端覆盖乳胶牙科薄膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸（图1）。
   注意:蚊子会将卵沉积在滤纸上，尼龙网会将滤纸牢固地固定在适当的位置。蚊子卵呈圆柱形，长度约为500μm，最宽处直径约为200μm，前端和后端逐渐变细（图2）。
2. 将充满蚊子的管子放入装有双蒸馏水（ddH₂O）的小（60 mm x 15 mm）培养皿中。将管和培养皿置于28°C的培养箱中45分钟（图3）。
3. 从培养箱中取出试管，然后将试管插入空笼中。轻轻敲击管子，让蚊子飞出，一旦所有蚊子飞出，就将管子从笼子里取出。
4. 当管子没有蚊子时，拧下底圈，取下尼龙，然后用镊子小心地从管子中取出带有鸡蛋的滤纸。将滤纸放入塑料培养皿（100 mm x 15 mm）中，该培养皿中含有一层用ddH₂O润湿的滤纸。
5. 观察鸡蛋。已经老化到浅灰色的蛋（图4）就可以对齐了。
   1. 如果鸡蛋仍然是白色的，请将它们放回孵化器并每5分钟检查一次颜色。白色的蛋很脆弱，容易破裂，注射过程后不能很好地存活，导致孵化率低。
   2. 深灰色或黑色的鸡蛋陈酿太多。不要使用它们。

3. 胚胎排列

1. 用剃须刀片切开一块尼龙印迹膜（2 cm x 1 cm），确保边缘修剪整齐。
   注意:如果边缘不直，则在注射过程中，鸡蛋将无法正确固定在膜上。
2. 将膜放在载玻片上，并用一张滤纸（2 cm x 2 cm）覆盖膜，留下约1 mm的膜过滤器（图5）。
   注:使用前确保显微镜载玻片清洁，并使用干净的镊子操作膜过滤器。
3. 用去离子的H₂O润湿滤纸，因为如果长时间干燥，鸡蛋会死亡。
   注意:不要在纸上放太多水，因为胚胎在注射过程中会移动，但要确保有足够的水来防止胚胎干燥（图6A，B）。多余的水可以通过用一张滤纸吸收来去除。
4. 用画笔（尺寸#0）轻轻地将30-50个胚胎转移到膜的边缘。使用刷子将卵子沿着膜垂直对齐，方法是在载玻片上轻轻滚动卵子，使腹侧（凸面）朝上。
5. 将所有卵子朝向同一方向，以便在显微注射显微镜下观察卵子时，后端（更尖，图6A，B）处于向下位置，并与针头形成〜15°的角度（图6C）。用卵子（30-50）排列膜的整个边缘，并将载玻片置于显微镜下进行注射。
   注意:仔细选择鸡蛋。丢弃白色（太年轻或未发育）或深灰色（太老会断针）和异常的（图7）。确保滤纸始终保持湿润。

4. 基因制备

1. 按照制造商的协议，至少使用无内毒素的DNA质粒最大准备试剂盒纯化用于注射的质粒DNA。
2. 将DNA重悬于PCR级水中，并在4°C下以17，100×g的冷藏离心机离心30分钟。 然后，将上清液转移到新的，干净的1.5mL锥形管中。小心地使用微量移液器，以避免从色谱柱中转移不需要的颗粒物。
3. 使用十分之一体积的3M乙酸钠和两倍体积的100%乙醇进行DNA的第二次沉淀。
4. 将DNA重悬于300-500μLPCR级水中，最终质粒浓度为1000 ng / μL。将质粒混合物在注射缓冲液中混合，最终质粒浓度为300-400 ng / μL，并制成10-20μL等分试样。
   注意:DNA可以储存在-20°C，DNA显微注射等分试样可以储存在-20°C，如果使用RNA组分，可以储存在-80°C。注射液中不要超过800 ng / μL的DNA，因为粘度会导致针头堵塞。

5. 针头准备

1. 通过使用可编程的微量移液器拉动10厘米的石英毛细管来制作针头。
2. 在显微镜下检查针头，以确保尖端形成良好。确保可编程拉拔器上的针头设置产生一个尖端，该尖端开始从端子端逐渐变细约0.5 mm，并以细点结束（见 图6）。容易断裂的针通常具有太长的锥度。
   注意:条件可能因拔针器而异（作者将根据要求提供他们使用的可编程拉拔器的设置。期刊限制禁止我们引用特定品牌）。针头可以手工拉动，但这需要大多数实验室无法提供的技能组合。

6. 胚胎显微注射

1. 使用微量加载器尖端用2μL DNA混合物填充针头。将针插入针座并连接自动压力泵管（图8）。
2. 重要提示:对齐指针，使其与滑块的平面成15°的角度（图8）。
3. 通过小心地触摸第一个卵子打开针尖，并通过将针尖插入后极≤10μm来注射。成功的注射将导致卵子内细胞质的小运动。
4. 使用显微镜同轴载物台对照移动到下一个卵子继续注射。
   1. 为了确保针尖保持打开并且没有堵塞，请在进入另一个胚胎之前按下注射按钮，并可视化针头开口处的小液滴。
   2. 如果针头堵塞，请按"清除"按钮清除针头并重复液滴可视化测试。如果针尖开口稍大，根据需要调整压力，以确保液滴的大小保持较小。
   3. 用一根针头注射约40-50个卵。
      注意:确保滤纸始终保持湿润。在针头上保持足够的背压以保持其清洁。无法疏通堵塞的针头必须更换为新针头。胚胎放置，针头插入和注射使显微镜更容易，这些显微镜具有用于载物台水平移动的同轴控制（图9）。
5. 注射完成后，将鸡蛋冲洗到衬有滤纸并装满50mL去离子H₂O的玻璃容器中（图10）。
   注意:胚胎将在注射后2天开始孵化，可能需要长达3-5天的时间。孵化的首龄幼虫必须立即转移到装有水和食物的干净容器中（每天检查2次）。

结果

所描述的显微注射方案应用的代表性例子可以在Carballar-Lejarazú等人⁵中找到。这里的目的是将自主基因驱动系统插入到An. gambiae的实验室菌株G3的种系中。该系统被设计为靶向该物种第三条染色体上的基本同源位点（Agcd），该位点编码血红素过氧化物酶，催化3-羟基炔基亚宁转化为黄原蛋白，这是嗜铬生物合成的最后一步（图11）。含纯合子基因驱动的蚊子是功能丧失的主要突变体，具有幼虫，蛹和新出现的具有红眼表型的成虫。含有驱动系统的质粒pCO37在冈比亚锥形虫纳米基因同源物的调节元件的控制下表达化脓性链球菌Cas9（SpCas9）内切酶，在冈比亚锥形U6基因启动子和3XP3-CFP显性标记盒的控制下表达用于鉴定转基因后代的23核苷酸引导RNA（gRNA）。Agcd与gRNA靶切位点两侧的基因组区域同源的DNA片段使得同源定向修复（HDR）介导的整合成为可能。

讨论

随着CRISPR/Cas9等精确和灵活的基因工程技术的可用性增加，转基因生物体可以比以前更直接、更稳定地开发。这些工具使研究人员能够创造出蚊子媒介的转基因菌株，这些菌株非常接近于实现对病原体的难耐性（种群改变）或可遗传不育（种群抑制）的理想特性。然而，为了开发最安全、最稳定的转基因蚊子，需要创建和评估更多的转基因系，以便为实地研究选择最佳品系。所描述的方案可以提高产生 冈比亚按蚊 转基因的效率，以便可以开发额外的候选者用于种群修饰和抑制策略。

所描述的显微注射程序利用了实验室中可能提供的设备和材料，这些设备和材料通常对蚊子或其他节肢动物媒介进行显微注射。在整个协议中保持对细节的关注非常重要。匆忙完成诸如按质量选择种蛋或跳过步骤（例如第二次DNA沉淀）将损害结果并导致孵化减少和转化效率降低。此外，如果在蚊子饲养中不小心，可能会出现许多困难。在拥挤的条件下饲养或缺乏营养的蚊子会产下质量较差的卵^14，这在显微注射工作流程中造成了瓶颈，并将增加达到所需数量的注射胚胎所需的时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 显微注射缓冲液	-	1	mM NaHPO4 缓冲液，pH 6.8,50 mM KCl
印迹膜（Zeta-Probe GT 基因组测试印迹膜）	Bio-Rad		整齐笔直地切成 2x1 cm 的小块
管 50 ml（一次性离心管，聚丙烯）	Fisher Brand		Ends cut
去离子水或双蒸水 （ddH20）	Mili-Q		装在洗瓶中
解剖显微镜	徕卡	Leica MZ12	用于胚胎对位
镊子			No. 5 尺寸
玻璃容器	Pyrex	No. 3140	125 x 65
玻璃滑轨	Fisher 品牌	编号 12-549-3	75x26 mm
培养箱	Barnsted 实验室线	型号 150	28 °C
KCl			50 mM
乳胶牙科胶片	Crosstex International	No. 19302
显微注射器	萨特仪器		XenoWorks 数字显微
注射器 微量移液器吸头	Eppendorf 埃彭多夫		20 µL 微型加载机 epT.I.P.S.
显微作器	Sutter Instrument		XenoWorks 显微作器
微量移液器	雷宁		20 µL
微量移液器拉拔器	Sutter Instrument	Sutter P-2000 微量移液器拉拔器
显微镜	Leica	DM 1000 LED 或 M165 FC	用于显微注射
最小纤维滤纸	Fisher Brand	No. 05-714-4	色谱纸，厚
蚊子	MR4， BEI Resources		冈比亚按蚊，交配成年雌性，羽化后 4-5 天采血
NaHPO4 缓冲液			1 mM，ph 6.8
尼龙网
油漆刷	Blick	No. 05831-7040	精细，尺寸 4/0
培养皿			塑料，（60x15 mm，90x15 mm）
乙酸			3M
石英玻璃毛细管	萨特仪器	编号QF100-70-10	带灯丝，外径 1 mm， 内径 0.7 10 cm 长
水 PCR 级	罗氏	03315843001