显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles gambiae胚胎显微注射DNA构建体以产生转基因蚊子的方法。
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摘要
摘要
胚胎显微注射技术对于多种昆虫物种的分子和遗传学研究至关重要。该技术能够以稳定且可遗传的方式，将编码目的基因及优良性状的外源DNA片段导入昆虫生殖系。由此获得的转基因品系可用于研究外源DNA表达所导致的表型变化，以回答基础科学问题，或用于实际应用。尽管该技术原理简单，但需要研究者具备耐心并经过反复练习，才能掌握高效操作所需的技能。本文展示了一种针对非洲疟蚊Anopheles gambiae胚胎的显微注射方法。其目标是通过显微注射将外源DNA递送至胚胎中，使其被发育中的生殖细胞（极细胞）所吸收。注射的DNA若表达转座酶、整合酶、重组酶或其他核酸酶（例如CRISPR相关蛋白Cas），可触发一系列反应，促使该DNA共价插入染色体中。利用这些技术所获得的转基因An. gambiae已广泛应用于免疫系统组分、与吸血相关的基因以及嗅觉系统元件的基础研究。此外，这些技术还被用于培育具有特定性状的An. gambiae品系，这些性状可能有助于控制疟原虫的传播。
引言
显微注射技术自20世纪初以来已被用于对生物体进行实验性操作1。该技术已被用于研究基本的生物学功能，和/或在目标生物体中引入重要的生物学改变。显微注射技术尤其受到媒介生物学研究者的关注，并被广泛应用于媒介基因组的改造2-11。节肢动物媒介中的转基因实验通常旨在通过降低媒介的适应性或增强其对所传播病原体的抗性，从而使媒介传播病原体的效率降低。蚊子可传播多种人类病原体，对全球范围内的发病率和死亡率具有显著影响。Anopheles 属蚊子传播人类疟疾寄生虫病原体 Plasmodium spp. 。针对Anopheles 蚊子的基因工程实验旨在更深入地理解其生物学特性，并降低其作为媒介的传播能力，以推动新型疟疾根除策略的开发。
在全球范围内引起最多疟疾感染的蚊媒属于Anopheles gambiae种复合体。然而，大多数成功的转基因实验都是在印度次大陆的疟疾媒介Anopheles stephensi上进行的。尽管已存在大量实验室驯化的Anopheles gambiae品系，但文献中报道的转基因Anopheles gambiae spp.品系数量远不及Anopheles stephensi。人们认为，与Anopheles stephensi相比，Anopheles gambiae胚胎更难进行显微注射并实现成功的转基因，但造成这些差异的原因尚不清楚。本方案描述了一种通过显微注射实现Anopheles gambiae胚胎转基因的、已被证实持续有效的方法。该方案基于Hervé Bossin和Mark Benedict先前开发的方法12，并增加了一些额外的细节和改进，这些改进已被证明可提高转基因效率。
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方案
1. 准备受微注射的蚊子
- 将约100只雄性和200-300只羽化后1-2日龄的雌性成蚊放入一个笼子（~5000 cm3）中，使其交配2天13。
- 交配期结束后，使用人工饲血装置提供2 mL血液，或根据昆虫饲养室的操作惯例使用活体麻醉动物为蚊子提供血餐14。次日再提供第二次血餐，以确保所有已交配的雌蚊都有机会吸血，并使部分吸血的蚊子完全吸饱。
- 在第二次血餐后的2-4天内收集蚊子的胚胎。
注意：幼虫期的营养对成虫的健壮性和繁殖适应性至关重要。有关健康昆虫的饲养方法，请参见Benedict等（2020）14。当使用人工饲血器或活体麻醉动物喂养蚊子时，产卵量未观察到显著差异。可采用昆虫饲养室中常规用于Anopheles gambiae的方法。
2. 胚胎制备
- 使用吸虫器将20-30只雌蚊放入一个透明的50 mL锥形管中，该锥形管已被带锯切割成两端开口，一端覆盖乳胶牙科膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸（图1）。
注意：蚊子会将卵产在滤纸上，尼龙网可确保滤纸牢固固定。蚊卵呈圆柱形，长约500 µm，最宽处直径约200 µm，前后两端逐渐变细（图2）。 - 将装有蚊子的管子放入盛有双蒸水（ddH2O）的小型（60 mm × 15 mm）培养皿中，并将管子和培养皿置于28 °C的培养箱中孵育45分钟（图3）。
- 从培养箱中取出管子，将其插入一个空的饲养笼中。轻轻敲击管子，使蚊子飞出，待所有蚊子飞出后将管子从笼中移除。
- 当管子中无蚊子后，拧开底部环，取下尼龙网，并用镊子小心地将带有卵的滤纸从管中取出。将滤纸放入一个塑料培养皿（100 mm × 15 mm）中，培养皿内含一层用ddH2O润湿的滤纸。
- 观察卵的状态。当卵老化至呈浅灰色时（图4），即可用于后续的排列操作。
- 若卵仍为白色，则将其放回培养箱，并每隔5分钟检查一次颜色。白色卵较为脆弱，容易破裂，注射后存活率低，导致孵化率下降。
- 呈深灰色或黑色的卵已过度老化，不可使用。
3. 胚胎排列
- 用剃刀裁剪一块尼龙印迹膜（2 cm × 1 cm），确保边缘整齐。
注意：如果边缘不平整，卵在注射过程中将无法牢固地附着在膜上。 - 将膜放置在玻璃上 将膜用一张滤纸（2 cm × 2 cm）覆盖，滤纸略小于膜，留出约 1 mm 的膜边缘不被覆盖（图5).
注意：使用前确保显微镜载玻片清洁，并使用洁净的镊子操作膜滤器。 - 用去离子水润湿滤纸2O型卵在长时间干燥后会死亡。
注意：不要在纸片上滴加过多水分，否则胚胎在注射过程中会移动，但需确保有足够的水分以防止胚胎干燥图6A，B）。可用滤纸吸去多余的水分. - 用画笔（0号）轻轻将30–50枚胚胎转移至膜的边缘。在载玻片上轻轻滚动胚胎，使卵垂直排列于膜上，腹面（凸面）朝上。
- 将所有卵子朝向同一方向排列，以便在显微注射显微镜下观察时，卵子的后端（较尖的一端） 图6A，B）处于下压位置，并与针头形成约15°的夹角（图6C). 用卵（30–50枚）沿膜的整个边缘排列，并将载玻片置于显微镜下进行注射。
注意：仔细挑选卵子。弃去白色（过嫩或未发育）或深灰色（过老，易导致针头断裂）的卵子，以及形态异常的卵子图7). 确保滤纸始终保持湿润.
4. DNA 提取
- 使用无内毒素的质粒DNA大提试剂盒，按照制造商提供的操作说明，纯化用于注射的质粒DNA。
- 将DNA重悬于PCR级水中，在4 °C条件下，于冷冻离心机中以17,100 × g 离心30分钟。随后，将上清液 转移至新的洁净1.5 mL离心管中。小心使用微量移液器操作，避免将柱中不需要的颗粒物质转移。
- 使用十分之一体积的3 M醋酸钠和两倍体积的100%乙醇对DNA进行第二次沉淀。
- 将DNA重悬于300–500 µL PCR级水中，使质粒终浓度达到1000 ng/µL。将质粒混合物加入注射缓冲液中，使质粒终浓度为300–400 ng/µL，并分装为10–20 µL每份。
注意：DNA可在-20 °C保存。若含有RNA组分，显微注射用分装样品应保存于-80 °C；否则可保存于-20 °C。注射混合液中DNA浓度不得超过800 ng/µL，否则因黏度过高会导致注射针头堵塞。
5. 针头准备
- 使用程序化微量移液器拉制仪拉制10 cm石英毛细管，以制备针头。
- 在显微镜下检查针头，确保尖端成型良好。应确保程序化拉制仪的设置能使针尖在距末端约0.5 mm处开始逐渐变细，并最终形成细尖（见图6）。容易断裂的针头通常 taper 段过长。
注意：具体条件可能因针头拉制仪型号而异（作者可根据请求提供其所用程序化拉制仪的设置参数，但因期刊限制，无法提及特定品牌）。针头也可手工拉制，但该技术需要大多数实验室不具备的操作技能。
6. 胚胎显微注射
- 使用微加载尖端将 2 µL DNA 混合物注入针头中。将针头插入针头架，并连接自动压力泵管路（图 8）。
- 重要提示：调整针头位置，使其与载玻片平面成 15° 角（图 8）。
- 通过轻轻触碰第一个卵来打开针尖，并将针尖插入卵的后极，插入深度 ≤ 10 µm，进行注射。成功的注射会导致卵内细胞质出现轻微移动。
- 使用显微镜同轴载物台控制装置移动至下一个卵，继续注射。
- 为确保针尖保持通畅且未堵塞，在进入另一个胚胎前按下“注射”按钮，并观察针尖开口处形成的小液滴。
- 如果针头发生堵塞，按下“清除”按钮以疏通针头，并重复液滴观察测试。若针尖开口略有扩大，可根据需要调整压力，以确保液滴大小保持较小。
- 每根针头可注射约 40–50 个卵。
注意：务必始终保持滤纸湿润。对针头保持足够的回压以维持通畅。若针头无法疏通，则必须更换新针头。使用具有同轴控制功能的显微镜进行胚胎定位、针头插入和注射操作将更为便捷（图 9）。
- 完成注射后，将卵冲洗到铺有滤纸并盛有 50 mL 去离子 H2O 的玻璃容器中（图 10）。
注意：胚胎通常在注射后 2 天开始孵化，可能需要 3–5 天时间。孵化出的一龄幼虫必须立即转移（每日检查两次）至含有水和食物的洁净容器中。
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结果
Carballar-Lejarazú 等人5的研究中展示了本文所述显微注射方案的一个代表性应用实例。该研究旨在将一个自主型基因驱动系统插入实验室品系 G3 的An. gambiae种系中。该系统被设计用于靶向该物种第三号染色体上的cardinal同源位点（Agcd），该位点编码一种血红素过氧化物酶，可催化3-羟基犬尿氨酸转化为眼色素（ommochrome）生物合成的最后一步产物——黄色眼色素（xanthommatin）（图11）。携带纯合基因驱动的蚊子为cardinal基因功能缺失型突变体，其幼虫、蛹及新羽化的成虫均表现为红眼表型。含有该驱动系统的质粒pCO37可在An. gambiae nanos基因同源物的调控元件控制下表达Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）内切酶，同时在An. gambiae U6基因启动子控制下表达一段23个核苷酸的向导RNA（gRNA），并包含一...
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讨论
随着CRISPR/Cas9等精确且灵活的基因工程技术的日益普及，转基因生物的构建比以往更加直接和稳定。这些工具使研究人员能够创建转基因蚊媒品系，在实现对病原体不敏感（种群修饰）或可遗传不育（种群抑制）等理想特性方面已非常接近目标。然而，为了开发出尽可能安全且稳定的转基因蚊虫，还需创建并评估更多的转基因品系，以筛选出最适合开展野外研究的最优品系。本文所述方案可提高冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）转基因个体的制备效率，从而推动更多适用于种群修饰与种群抑制策略的候选品系的开发。
本文所述的显微注射操作使用了在常规进行蚊虫或其他节肢动物媒介显微注射的实验室中可能已具备的设备和材料。在整个实验流程中保持对细节的关注至关重要。如果在选择优质卵子等步骤上仓促行事，或省略如第二次DNA沉淀等关键步骤，将会影响实验结果，导致孵化率降低和转化效率下降。此外，若在蚊虫饲养过程中未加以细致管理，操作中也会遇到诸多困难。在过度拥挤的环境中饲养或营养不足的蚊虫所产的卵数量较少且质量较差14，这将造成显微注射工作流程中的瓶颈，延长...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Drusilla Stillinger、Kiona Parker、Parrish Powell和Madeline Nottoli在蚊虫饲养方面提供的帮助。本研究由加州大学欧文分校疟疾倡议项目提供资金支持。AAJ是加州大学欧文分校的Donald Bren讲席教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x 显微注射缓冲液 | - | - | 1 mM NaHPO4 缓冲液，pH 6.8，50 mM KCl |
| 印迹膜（Zeta-Probe GT 基因组检测印迹膜） | 伯乐（Bio-Rad） | 整齐地切成 2x1 cm 的片状 | |
| 50 ml 锥形管（一次性离心管，聚丙烯） | Fisher Brand | 末端切割 | |
| 去离子水或双蒸馏水（ddH20) | Mili-Q | 在洗瓶中 | |
| 解剖显微镜 | Leica | Leica MZ12 | 用于胚胎定位 |
| 镊子 | 5号大小 | ||
| 玻璃容器 | Pyrex | 编号 3140 | 125 x 65 |
| 载玻片 | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 毫米 |
| 培养箱 | Barnsted 实验室线 | 型号 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| 乳胶牙科薄膜 | Crosstex International | 19302号 | |
| 显微注射仪 | Sutter Instrument | XenoWorks 数字显微注射仪 | |
| 微量移液器吸头 | Eppendorf | 20 µL 微量移液器吸头 epT.I.P.S. | |
| 显微操作仪 | Sutter Instrument | XenoWorks 微操作仪 | |
| 微量移液器 | Rainin | 20 µL | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument | Sutter P-2000 微量移液器拉制仪 | |
| 显微镜 | Leica | DM 1000 LED 或 M165 FC | 用于显微注射 |
| 最小纤维滤纸 | Fisher Brand | No. 05-714-4 | 厚层析纸 |
| 蚊子 | MR4，BEI资源 | 冈比亚按蚊，交配后的成年雌蚊，羽化后4-5天内吸血 | |
| NaHPO4 缓冲液 | 1 mM，pH 6.8 | ||
| 尼龙网 | |||
| 画笔 | 布利克 | 05831-7040 | 细，4/0号 |
| 培养皿 | 塑料，（60×15 mm，90×15 mm） | ||
| 乙酸钠 | 3M | ||
| 石英玻璃毛细管 | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | 带细丝，1 mm 外径， ID 0.7 10 厘米长度 |
| PCR级水 | 罗氏 | 03315843001 |
参考文献
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- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587(2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
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- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
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