Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

摘要

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles gambiae胚胎显微注射DNA构建体以产生转基因蚊子的方法。

摘要

胚胎显微注射技术对于多种昆虫物种的分子和遗传学研究至关重要。该技术能够以稳定且可遗传的方式，将编码目的基因及优良性状的外源DNA片段导入昆虫生殖系。由此获得的转基因品系可用于研究外源DNA表达所导致的表型变化，以回答基础科学问题，或用于实际应用。尽管该技术原理简单，但需要研究者具备耐心并经过反复练习，才能掌握高效操作所需的技能。本文展示了一种针对非洲疟蚊Anopheles gambiae胚胎的显微注射方法。其目标是通过显微注射将外源DNA递送至胚胎中，使其被发育中的生殖细胞（极细胞）所吸收。注射的DNA若表达转座酶、整合酶、重组酶或其他核酸酶（例如CRISPR相关蛋白Cas），可触发一系列反应，促使该DNA共价插入染色体中。利用这些技术所获得的转基因An. gambiae已广泛应用于免疫系统组分、与吸血相关的基因以及嗅觉系统元件的基础研究。此外，这些技术还被用于培育具有特定性状的An. gambiae品系，这些性状可能有助于控制疟原虫的传播。

引言

显微注射技术自20世纪初以来已被用于对生物体进行实验性操作¹。该技术已被用于研究基本的生物学功能，和/或在目标生物体中引入重要的生物学改变。显微注射技术尤其受到媒介生物学研究者的关注，并被广泛应用于媒介基因组的改造^2-11。节肢动物媒介中的转基因实验通常旨在通过降低媒介的适应性或增强其对所传播病原体的抗性，从而使媒介传播病原体的效率降低。蚊子可传播多种人类病原体，对全球范围内的发病率和死亡率具有显著影响。Anopheles 属蚊子传播人类疟疾寄生虫病原体 Plasmodium spp. 。针对Anopheles 蚊子的基因工程实验旨在更深入地理解其生物学特性，并降低其作为媒介的传播能力，以推动新型疟疾根除策略的开发。

在全球范围内引起最多疟疾感染的蚊媒属于Anopheles gambiae种复合体。然而，大多数成功的转基因实验都是在印度次大陆的疟疾媒介Anopheles stephensi上进行的。尽管已存在大量实验室驯化的Anopheles gambiae品系，但文献中报道的转基因Anopheles gambiae spp.品系数量远不及Anopheles stephensi

方案

1. 准备受微注射的蚊子

1. 将约100只雄性和200-300只羽化后1-2日龄的雌性成蚊放入一个笼子（~5000 cm³）中，使其交配2天¹³。
2. 交配期结束后，使用人工饲血装置提供2 mL血液，或根据昆虫饲养室的操作惯例使用活体麻醉动物为蚊子提供血餐¹⁴。次日再提供第二次血餐，以确保所有已交配的雌蚊都有机会吸血，并使部分吸血的蚊子完全吸饱。
3. 在第二次血餐后的2-4天内收集蚊子的胚胎。
   ​注意：幼虫期的营养对成虫的健壮性和繁殖适应性至关重要。有关健康昆虫的饲养方法，请参见Benedict等（2020）¹⁴。当使用人工饲血器或活体麻醉动物喂养蚊子时，产卵量未观察到显著差异。可采用昆虫饲养室中常规用于Anopheles gambiae的方法。

2. 胚胎制备

1. 使用吸虫器将20-30只雌蚊放入一个透明的50 mL锥形管中，该锥形管已被带锯切割成两端开口，一端覆盖乳胶牙科膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸（图1）。
   注意：蚊子会将卵产在滤纸上，尼龙网可确保滤纸牢固固定。蚊卵呈圆柱形，长约500 µm，最宽处直径约20....

结果

Carballar-Lejarazú 等人⁵的研究中展示了本文所述显微注射方案的一个代表性应用实例。该研究旨在将一个自主型基因驱动系统插入实验室品系 G3 的An. gambiae种系中。该系统被设计用于靶向该物种第三号染色体上的cardinal同源位点（Agcd），该位点编码一种血红素过氧化物酶，可催化3-羟基犬尿氨酸转化为眼色素（ommochrome）生物合成的最后一步产物——黄色眼色素（xanthommatin）（图11）。携带纯合基因驱动的蚊子为cardinal基因功能缺失型突变体，其幼虫、蛹及新羽化的成虫均表现为红眼表型。含有该驱动系统的质粒pCO37可在An. gambiae nanos基因同源物的调控元件控制下表达Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）内切酶，同时在An. gambiae U6基因启动子控制下表达一段23个核苷酸的向导RNA（gRNA），并包含一.......

讨论

随着CRISPR/Cas9等精确且灵活的基因工程技术的日益普及，转基因生物的构建比以往更加直接和稳定。这些工具使研究人员能够创建转基因蚊媒品系，在实现对病原体不敏感（种群修饰）或可遗传不育（种群抑制）等理想特性方面已非常接近目标。然而，为了开发出尽可能安全且稳定的转基因蚊虫，还需创建并评估更多的转基因品系，以筛选出最适合开展野外研究的最优品系。本文所述方案可提高冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）转基因个体的制备效率，从而推动更多适用于种群修饰与种群抑制策略的候选品系的开发。

本文所述的显微注射操作使用了在常规进行蚊虫或其他节肢动物媒介显微注射的实验室中可能已具备的设备和材料。在整个实验流程中保持对细节的关注至关重要。如果在选择优质卵子等步骤上仓促行事，或省略如第二次DNA沉淀等关键步骤，将会影响实验结果，导致孵化率降低和转化效率下降。此外，若在蚊虫饲养过程中未加以细致管理，操作中也会遇到诸多困难。在过度拥挤的环境中饲养或营养不足的蚊虫所产的卵数量较少且质量较差¹⁴，这将造成显微注射工作流程中的瓶颈，延长.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 显微注射缓冲液	-	-	1 mM NaHPO4 缓冲液，pH 6.8，50 mM KCl
印迹膜（Zeta-Probe GT 基因组检测印迹膜）	伯乐（Bio-Rad）		整齐地切成 2x1 cm 的片状
50 ml 锥形管（一次性离心管，聚丙烯）	Fisher Brand		末端切割
去离子水或双蒸馏水（ddH20)	Mili-Q		在洗瓶中
解剖显微镜	Leica	Leica MZ12	用于胚胎定位
镊子			5号大小
玻璃容器	Pyrex	编号 3140	125 x 65
载玻片	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 毫米
培养箱	Barnsted 实验室线	型号 150	28 °C
KCl			50 mM
乳胶牙科薄膜	Crosstex International	19302号
显微注射仪	Sutter Instrument		XenoWorks 数字显微注射仪
微量移液器吸头	Eppendorf		20 µL 微量移液器吸头 epT.I.P.S.
显微操作仪	Sutter Instrument		XenoWorks 微操作仪
微量移液器	Rainin		20 µL
微移液管拉制仪	Sutter Instrument	Sutter P-2000 微量移液器拉制仪
显微镜	Leica	DM 1000 LED 或 M165 FC	用于显微注射
最小纤维滤纸	Fisher Brand	No. 05-714-4	厚层析纸
蚊子	MR4，BEI资源		冈比亚按蚊，交配后的成年雌蚊，羽化后4-5天内吸血
NaHPO4 缓冲液			1 mM，pH 6.8
尼龙网
画笔	布利克	05831-7040	细，4/0号
培养皿			塑料，（60×15 mm，90×15 mm）
乙酸钠			3M
石英玻璃毛细管	Sutter Instrument	No. QF100-70-10	带细丝，1 mm 外径，  ID 0.7 10 厘米长度
PCR级水	罗氏	03315843001