方法文章

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

DOI：

10.3791/62592

⸱

2021年6月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida albicans）ABC（ATP结合盒）蛋白Cdr1。设计了一种C端可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签，标签与Cdr1之间含有16个氨基酸残基的连接序列，以促进Cdr1的纯化及去垢剂筛选。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ABC转运蛋白的生化与生物物理表征的成功在很大程度上取决于异源表达系统的选择。在过去二十年中，我们开发了一种酵母膜蛋白表达平台，已用于研究多种重要的真菌膜蛋白。表达宿主 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ADΔΔ 缺失了七种主要的内源性 ABC 转运蛋白，且含有带有功能获得性突变的转录因子 Pdr1-3，该突变可实现外源膜蛋白基因在基因组中以单拷贝稳定整合后的组成型过表达 PDR5 基因座。多功能质粒载体的构建以及一步克隆策略的优化，使得异源ABC转运蛋白的快速、准确克隆、定点突变及表达成为可能。本文中，我们描述了一种新型可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签（即单体化的酵母增强型绿色荧光蛋白yEGFP3与六聚组氨酸亲和纯化标签的融合）的设计与应用，该设计旨在避免标签对目标蛋白功能的潜在干扰，并提高His标签与镍亲和树脂的结合效率。将mGFPHis标签与膜蛋白开放阅读框（ORF）融合，可通过聚丙烯酰胺凝胶观察实现蛋白的便捷定量，并检测仍保留mGFPHis标签的降解产物。我们展示了该特性如何促进去垢剂筛选以实现膜蛋白的有效溶解。同时提供了一种高效、快速且可靠的少量质粒膜蛋白制备方案，适用于C端标记的 白色念珠菌 多药外排转运蛋白 Cdr1 过表达于 S. cerevisiae ADΔΔ 的方法。该小规模质膜分离方案可在一个工作日内获得高质量的质膜。所制备的质膜可用于测定 Cdr1 及其突变体的酶活性。

引言

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从天然脂质环境中提取膜整合蛋白可能会显著影响其结构和功能1,2,3,4。生物膜复杂的脂质组成5确保了关键的蛋白质-脂质相互作用得以发生6。脂质维持膜蛋白的结构完整性，从而使其能够在目标膜区室中正常发挥功能7,8。因此，膜蛋白纯化过程中的关键第一步是从其天然环境中提取蛋白，同时不破坏其结构和/或功能。

膜蛋白结构表征存在诸多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，以及难以表达出足够数量正确折叠且具有功能的膜蛋白，以满足X射线晶体学或冷冻电子显微镜（cryo-EM）9,10,11,12的研究需求。膜蛋白表达系统主要有三种类型：同源表达系统9、异源表达系统13,14,15和体外（in vitro）表达系统16,17。由于许多表达系统表达水平较低或成本过高，目前仅有少数宿主成为生产膜蛋白的首选。这些宿主包括细菌宿主大肠杆菌（Escherichia coli）、酵母酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris），以及较高等真核生物如Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞系18。所有膜蛋白表达技术均有其优缺点；然而，酿酒酵母（S. cerevisiae）可能是目前研究最为深入、适用于膜蛋白生产的真核模式生物。它在基因工程、药物发现、合成生物学以及真核膜蛋白表达等方面具有高度的多功能性14,19,20,21。

在本研究中，一项已获专利的 S. cerevisiae 膜蛋白表达技术21 使用了，与 S. cerevisiae ADΔ14 和 ADΔΔ22 作为首选宿主（图1A），以过表达并研究主要的 白色念珠菌 多药外排泵 Cdr1。两者均 S. cerevisiae 菌株为AD1-8u的衍生株- 23 具有以下任一特征的 ura3 (ADΔ) 或两者 ura3 和 his1 (ADΔΔ) 基因被删除，以消除因非预期整合在该位点而产生的任何尿嘧啶或组氨酸原养型假阳性转化子 URA3 或 HIS1 基因组位点。7种主要多药外排泵的缺失23，如图所示 图1A, 使ADΔΔ对大多数外源性物质极为敏感。功能获得性突变转录因子Pdr1-3导致异源膜蛋白（如Cdr1，图中红色八边形）的组成型过表达 图1A) 在含有异源ORF的转化盒整合后（图1A) 在基因组水平 PDR5 位点（蓝色矩形在 图1A) 通过两次同源重组事件实现。可通过共聚焦显微镜确认C末端mGFPHis标签蛋白是否正确地定位于质膜图1A），His标签可用于镍亲和层析纯化该标记蛋白。克隆某些真菌ABC转运蛋白（例如， Candida krusei ABC1）插入 pABC3 衍生质粒中是不可行的，因为这些质粒无法被扩增 在 大肠杆菌 由于细胞毒性问题，这促使了膜蛋白一步克隆技术的开发14,24 在其N端或C端标记了各种亲和标签、表位标签或报告标签 S. cerevisiae ADΔΔ图1C). S. cerevisiae ADΔΔ菌株过表达各种 CDR1 通过使用多达五个、彼此重叠25 bp的独立PCR片段，也可高效地以此方法构建突变体（图1C）。采用该方案，可在极短时间内以较低成本高效地克隆、表达并表征大量目标ORF。每增加一个PCR片段，转化效率仅下降约2倍。

如有需要，还可通过引物设计便捷地调控表达水平，从而可预测地将表达水平调节至通常较高的组成型表达水平的0.1%至50%之间25。优化的多功能克隆载体pABC314的衍生物pABC3-XLmGFPHis26（图1B）包含HRV-3C蛋白酶切割位点（X；LEVLFQ|GP），该蛋白酶在4 °C下的活性优于常用的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶27。L为一个五氨基酸（GSGGS）连接肽，mGFP是酵母增强型绿色荧光蛋白变体yEGFP330的单体突变体（A206K）28,29，His则为一个三氨基酸连接肽（GGS）后接六组氨酸（HHHHHH）镍亲和蛋白纯化标签。

该表达技术已成功应用于药物发现及膜蛋白研究。利用此技术，首次解析了真菌唑类药物靶点S. cerevisiae Erg1131的结构。该技术还实现了对C. albicans Cdr132,33,34的详细表征，并构建了适用于半胱氨酸交联研究的半胱氨酸缺陷型Cdr1分子35，以验证未来可能获得的高分辨率结构。利用该表达平台，还深入研究了多种主要人类致病真菌中的ABC转运蛋白 (即C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei以及Fusarium solani种复合体)24,36,37,38,39。这使得研究人员构建出一系列过表达外排泵的S. cerevisiae菌株，并将其用于高通量筛选，从而发现了新型荧光外排泵底物尼罗红（Nile red）40，以及特异性41和广谱性14,33,42,43,44 外排泵抑制剂。该系统的应用还促成了氯吉兰（clorgyline）的发现，这是首个具有广谱活性的真菌多药外排泵抑制剂42。

要实现膜蛋白的完全溶解，并制备出不含内源性脂质的均一膜蛋白-胶束复合物，需要使用高浓度的去垢剂45。然而，不幸的是，这通常会导致膜蛋白失活5,8,45,46。去垢剂单体的性质及其在溶液中的聚集行为，受到疏水尾部物理性质的影响，包括烷基链的长度和分支结构、是否存在芳香核或氟代烷基侧链，以及聚氧乙烯单元的数量。因此，去垢剂筛选是确定最适合膜蛋白溶解与纯化的去垢剂类型的重要第一步。

C. albicans 是一种主要的人类真菌病原体，可导致免疫功能低下个体发生严重的、危及生命的侵袭性感染47，并且其可能对唑类抗真菌药物产生耐药性48,49。C. albicans 多药耐药的主要机制之一是 Cdr1 的过表达50，Cdr1 是一种位于质膜上的 ABCG 亚家族的 II 型 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白51。完整的真菌 ABCG 转运蛋白（由两个核苷酸结合域 [NBDs] 和两个跨膜域 [TMDs] 组成）通常被称为多向性药物耐药（PDR）转运蛋白，其特征为独特的倒置结构域拓扑结构 [NBD-TMD]2。PDR 转运蛋白仅存在于植物52,53 和真菌54 中。尽管其具有重要性，目前尚无 PDR 转运蛋白的结构被解析；尽管近期已解析出人类半分子 ABCG 转运蛋白的结构，从而帮助建立了 Cdr1 的首个初步模型33。然而，我们最近的实验证据表明，该模型可能存在缺陷，原因可能是真菌 PDR 转运蛋白具有特征性的不对称 NBDs，从而可能导致一种独特的转运机制。因此，获得 Cdr1 的高分辨率结构，不仅对于合理设计新型外排泵抑制剂（有助于克服外排介导的药物耐药性）至关重要，而且对于深入了解这一重要 ABC 转运蛋白家族的作用机制也具有重要意义。

本研究的目的是建立可靠的方案，用于在基因改造的S. cerevisiae表达宿主中表达、增溶和纯化Cdr1，最终目标是获得Cdr1的高分辨率结构。在此过程中，设计了一种可被蛋白酶切割的mGFPHis双标签（图1B），该标签通过一段16个残基的连接序列与Cdr1的C末端分隔，从而改善了连接的6x His亲和标签与镍亲和树脂的结合，并实现了在活细胞中以及整个纯化过程中对Cdr1表达水平的监测。此外，还建立了一种可重复的小规模酵母质膜蛋白制备方案，其中含有约10%的C. albicans Cdr1（根据SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色估算），可用于Cdr1的生物化学表征。

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方案

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1. 制备新鲜或冷冻的感受态ADΔ和ADΔΔ细胞菌种

  1. 用单个酵母菌落接种25 mL的2x YPCD培养基[即2x YPD；2% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 蛋白胨，4% (w/v) 葡萄糖，0.079% (w/v) 完全补充混合物(CSM)]35，在30 °C、200转/分钟(rpm)振荡条件下过夜(o/n)培养16小时。
  2. 用25 mL 过夜培养物接种225 mL的2x YPCD培养基，并检测细胞在600 nm处的光密度(OD600)；OD600通常约为0.5–1.0。
    注意：在此阶段，请确保后续转化实验所需的所有材料均已准备就绪。
  3. 继续在30 °C、200 rpm振荡条件下培养约6–8小时，直至细胞密度达到OD600约6–8。
    注意：除非另有说明，以下所有步骤均在室温(RT)下进行。
  4. 在3,000 x g条件下离心3分钟，收集处于对数生长期的细胞。
  5. 用无菌的双蒸水(ddH2O)将细胞重悬并洗涤两次（即先用200 mL，再用20 mL）。
  6. 在3,000 x g条件下离心3分钟，收集细胞。
  7. 在冰上将细胞沉淀缓慢重悬于X mL的FCC溶液[5% (w/v) 甘油，10% (v/v) 二甲基亚砜(DMSO)]中（即每分钟加入1份，共30等份，持续30分钟）（其中X = OD600；例如，若OD600 = 6，则用6 mL重悬；若OD600 = 3，则用3 mL重悬）。
    注意：正确的FCC溶液组成对转化成功至关重要。
  8. 转化前将细胞置于冰上保存2小时，或分装后储存于-80 °C备用。
    注意：ADΔ和ADΔΔ细胞对冷冻极为敏感。因此，必须缓慢降温至-80 °C：将装有50–600 µL细胞分装液的冰冻微量离心管放入塑料储存盒中（室温RT）。将该盒放入较大的聚苯乙烯容器中（室温RT），并用匹配的聚苯乙烯盖子封好，然后将容器放入-80 °C冰箱中。
    ​警告：缓慢冷冻对细胞存活至关重要。

2. 将 CaCDR1-XLmGFPHis 转化至 ADΔ 和 ADΔΔ 中，并通过菌落 PCR 和 DNA 测序验证正确转化子

注意：质粒 pABC3-CDR1-mGFPHis 是通过 Lamping 等人（2010）55 中详细描述的传统克隆策略构建的，如图 1B所示。野生型C. albicans CDR1 以 PacI/NotI 片段的形式从质粒 pABC3-CaCDR1A-GFP14 中分离，并克隆至 pABC3-XLmGFPHis26 中。

  1. PCR 扩增整个 CDR1 使用高保真DNA聚合酶和引物对PDR5-pro/PDR5-ter扩增的转化盒35 使用1-10 ng的pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis作为DNA模板，或者 alternatively，消化2 µ用10 U限制性内切酶将pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis完全消化 AscI 在 37 °C (图1A，B).
    注意： CDR1 转化盒（图 1A) 包括 PDR5 启动子 - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 终止子 - URA3 筛选标记 - PDR5 下游区段
  2. 进行琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶中回收约8 kb的转化盒。
    注意：对约 8 kb 的凝胶纯化 CaCDR1 转化盒可去除任何可能未被消化的质粒DNA，从而避免产生错误的转化子——这些转化子可能将完整的质粒而非线性化的转化盒整合到基因组中 PDR5 基因座
  3. 将所需量的鲑鱼精子载体DNA（2 mg/mL；10 mM Tris，1 mM EDTA；pH 7.5）置于沸水浴中变性10分钟，随后置于冰上保存。煮沸鲑鱼精子DNA时应使用螺旋盖试管，以防止管盖松开。
  4. 混合 50 µ变性鲑鱼精子DNA的L值为14 µL 转化盒（500–2,000 ng），并保留 64 µ将DNA混合物置于冰上保存，直至进一步使用。
    注意：使用 10 ng 的一种 E. coli-酵母穿梭质粒（例如 pYES2）作为阳性转化对照（图2B).
  5. 将新鲜或经5分钟快速解冻的冻存感受态细胞重悬于30 °C 水浴并将其分为 50 µ1.5 mL 微型离心管中的等分试样。
  6. 通过离心收集细胞，在微型离心机中以最大速度（18,000 × g）离心1分钟 g).
  7. 移除上清液，将细胞沉淀置于室温。
  8. 每次转化时，混合 296 µ260种组合（RT） µ50% (w/v) 聚乙二醇（PEG 3350）溶液 36 L µ1 M 醋酸锂（LiAc）溶液，通过反复吹打混匀，加入适量的 64 µ冰浴中的DNA混合物，体积为L。
  9. 立即向50 µL感受态细胞沉淀等分试样。
  10. 将细胞沉淀重悬于 360 µ用移液器充分涡旋震荡约30秒，将PEG-LiAc-DNA混合物混匀。
  11. 将细胞混合物在 30 °C 下孵育 °37°C 水浴 1 小时。
    注意：ADΔ 和 ADΔΔ 细胞在30℃下转化效果更佳 °C 而非 42 °C35.
  12. 在18,000 x g下收获细胞 g 10 秒。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 80 µ升 ddH₂O2O.
  13. 将细胞涂布于CSM-URA琼脂平板上35 [即 0.67% (w/v) 无氨基酸酵母氮源基础培养基、0.077% (w/v) 缺尿嘧啶的 CSM、2% (w/v) 葡萄糖和 2% (w/v) 琼脂]
  14. 在30℃下孵育平板2-3天 °待尿嘧啶原养型转化子明显可见后，继续培养。
    注：预期每微克质粒DNA可获得约100个转化子 µ约 8 kb 的线性 CaCDR1 转化盒和约 4 x 104 每微克DNA的转化子数 µg pYES2
  15. 挑取五个独立的转化子，将其划线接种于新鲜的CSM-URA平板上，以分离尿嘧啶原养型转化子与未转化宿主细胞的残留物。
  16. 通过在YPG-琼脂平板[1%（w/v）酵母提取物、2%（w/v）蛋白胨、2%（v/v）甘油和2%（w/v）琼脂]上培养转化子，去除可能存在的 petite 突变体（图 2D).
    注意：小菌落突变体的线粒体功能缺陷，因此无法在非发酵性碳源上生长。这类突变体非常常见 S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ 和 ADΔΔ 特别容易获得微小表型。
  17. 进行酵母菌落PCR，确认至少三个独立转化子已正确整合至基因组 PDR5 基因座 (图1C通过扩增整个约 8 kb 的片段 CaCDR1 使用经过优化的特定DNA聚合酶扩增来自不纯DNA模板来源的PCR产物的转化盒。采用一组结合在整合位点外侧的引物。 µL ddH₂O 中的细胞悬液等分试样2O）以单菌落来源的DNA为模板。
    注意：这种特定的DNA聚合酶能够从完整的酵母细胞中可靠地扩增约8 kb的PCR片段。然而，为了实现可靠的扩增，需要进行45个PCR循环，并且必须将酵母细胞重悬于OD600 1-10 在 ddH₂O 中2O.
  18. 通过1 μL DNA琼脂糖凝胶电泳确认正确的约8 kb PCR扩增产物 µPCR 反应的 L 部分。
  19. 去除10 μL扩增引物过量产物 µ按照制造商的说明，在测序之前，取PCR反应的L部分，用单链DNA外切核酸酶和磷酸酶的酶混合物处理DNA样品，再使用适当的引物对处理后的DNA样品部分进行完整ORF的测序。

3. 小规模酵母质膜分离方案

  1. 培养酵母细胞
    1. 将单个酵母菌落接种于10 mL YPD培养基中，于30 °C、200 rpm振荡培养约7–8小时。
    2. 取10 mL预培养液接种至40 mL YPD培养基中，30 °C过夜（约16小时）振荡培养（200 rpm），直至细胞密度达到OD600为1–3。
  2. 收集酵母细胞
    1. 在4 °C、4,200 × g条件下离心5分钟，收集40 OD单位（ODU；例如，OD600为1时1 mL = 1 ODU）的对数生长期细胞。
    2. 用冰冻的无菌ddH2O洗涤细胞两次（分别为40 mL和1 mL；每次洗涤后在4 °C、4,200 × g离心5分钟）。
    3. 将细胞沉淀重悬于1 mL冰冻的无菌ddH2O中，并将细胞悬液转移至预冷（置于冰上）的1.5 mL微量离心管中。
    4. 在4 °C、3,300 × g条件下离心3分钟，收集细胞。
    5. 吸除上清液。
    6. 将细胞沉淀重悬于0.5 mL匀浆缓冲液[HB；50 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 20% (v/v) 甘油；pH 7.5]中，该缓冲液需新鲜添加1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。
      注：PMSF需现用现加，因其遇水后迅速失活。
      注意：PMSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有强腐蚀性并对组织有破坏作用，可能造成不可逆的眼部损伤。
    7. 将细胞悬液置于-80 °C保存或 立即使用。
  3. 质膜的分离
    1. 若细胞已冷冻，则在冰上解冻约1小时。
    2. 向0.5 mL细胞悬液中加入冰冻的直径为0.5 mm的玻璃珠，使总体积达到1 mL。
    3. 以最大振荡强度涡旋振荡1分钟，随后在冰上冷却3分钟，重复此过程共6个循环，以破碎细胞。
    4. 用加热的手术刀片在管底打一小孔。
    5. 将装有破碎细胞匀浆的离心管插入另一预冷的1.5 mL微量离心管中，低速（约200 rpm）离心10秒，使匀浆液从管底小孔流出。
      注：此步骤可确保玻璃珠保留在原管中。
    6. 在4 °C、5,156 × g条件下离心5分钟，去除细胞碎片、未破碎细胞及细胞核。
    7. 将450 µL上清液转移至冰冻的1.5 mL微量离心管中，并加入额外1 mL含新鲜PMSF（1 mM）的冰冻HB缓冲液。
      ​注：此稀释步骤对高质量回收质膜蛋白至关重要。
    8. 在4 °C、17,968 × g条件下离心1小时，收集质膜沉淀，并通过反复吹打将其重悬于100 µL新鲜添加1 mM PMSF的HB缓冲液中。在释放100 µL HB前，先用100 µL移液枪头轻轻搅拌细胞沉淀，以充分松散沉淀，确保质膜均匀分散。
    9. 使用适用于含还原剂和去垢剂缓冲液的蛋白定量试剂盒测定质膜制备物的蛋白浓度。
    10. 将质膜样品置于-80 °C保存，或置于冰上以供立即使用。

4. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

  1. 组装用于制备聚丙烯酰胺凝胶的装置。
  2. 配制两块分离胶（7%聚丙烯酰胺），混合2.1 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、3 mL 4×分离胶缓冲液（1.5 M Tris，0.4%十二烷基硫酸钠[SDS]（w/v）；pH 8.8）和6.9 mL ddH2O。加入8 µL四甲基乙二胺（TEMED）和60 µL 10%过硫酸铵（APS）以引发丙烯酰胺的聚合反应。
    注意：丙烯酰胺/双丙烯酰胺具有高毒性，可引起皮肤刺激、周围神经病变，且为致癌物。TEMED若吞咽或吸入有害。APS若吞咽有害，可引起严重的眼部和皮肤刺激。
  3. 将约4–5 mL上述混合液倒入已组装的凝胶装置中，加至距离顶部约2 cm处。
  4. 小心地在上层覆盖约1–2 mL 0.1% SDS，以形成平整的弯月面。
  5. 室温下静置约60分钟，使聚丙烯酰胺凝胶充分凝固。
  6. 配制两块浓缩胶的混合液：混合0.5 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 mL 4×浓缩胶缓冲液（0.5 M Tris，0.4% SDS（w/v）；pH 6.8）和6.9 mL ddH2O。加入2 µL TEMED和30 µL 10% APS以引发丙烯酰胺聚合。
  7. 从已聚合的分离胶上移除0.1% SDS层，并用ddH2O冲洗，以去除残留的SDS。
  8. 将浓缩胶混合液倒入分离胶上方。
  9. 插入梳子，并清除梳子周围的气泡。
  10. 室温下静置约60分钟，使浓缩胶充分凝固。
  11. 取出梳子，并用水冲洗加样孔。将凝胶放入电泳槽中，并用1×电泳缓冲液（24.8 mM Tris，190 mM甘氨酸，0.1% SDS）加至电泳槽顶部。
    注意：1×电泳缓冲液由储存于室温的10×缓冲液母液（248 mM Tris，1.9 M甘氨酸，1% SDS（w/v）溶于ddH2O）稀释配制而成。
  12. 取5–10 µL质膜样品（即10–20 µg蛋白），与等体积的2×蛋白上样染料[120 mM Tris-HCl（pH 6.8）、20%甘油、0.02%溴酚蓝、4% SDS、200 mM二硫苏糖醇（DTT）]混合，立即加入电泳槽中浸没于运行缓冲液的加样孔中。
    注意：DTT若吞咽有害，可引起严重的眼部和皮肤刺激。
    注意：配制10 mL 2×蛋白上样染料，分装后于-20 °C保存。混合后的样品切勿加热，应立即上样，以避免GFP标签变性，从而确保凝胶内荧光信号可被检测。
  13. 在单独的加样孔中加入蛋白分子量标准品（分子量范围10–245 kDa），以便估算各蛋白条带的大小。
  14. 以200 V进行电泳，直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部（通常需45–55分钟）。
  15. 使用凝胶成像系统检测凝胶内的GFP荧光（激发波长475–485 nm，发射波长520 nm）。
  16. 完成凝胶内荧光成像后，将凝胶置于约10–20 mL蛋白凝胶固定液（40%乙醇，10%乙酸）中，室温轻柔振荡固定15分钟。
  17. 用10 mL ddH2O冲洗凝胶两次，每次10分钟；随后将凝胶置于10 mL胶体考马斯亮蓝染色液中，室温轻柔振荡染色约1小时，以显色蛋白条带。
  18. 为更清晰地观察蛋白条带，可在成像前用约20 mL ddH2O脱色一次或两次，每次约1小时。

5. Cdr1 ATP酶活性的测定 57

  1. 稀释质膜样品 >2.2 mg/mL 至 1-2 mg/mL，在 HB 中。
  2. 将ATP酶测定混合液（75 mM MES-Tris，75 mM 硝酸钾，0.3 mM 钼酸铵，7.5 mM 叠氮化钠；pH 7.5）和Mg-ATP（28.8 mM 三磷酸腺苷二钠盐，28.8 mM MgCl₂）置于相同温度下平衡2；pH 7.0）至 30 °C in a 30 °C 恒温培养箱
    警告：叠氮化钠具有高毒性。
    注意：确保所有缓冲液储备液和瓶子均不含磷酸盐；即用 1% (vol/vol) HCl 清洗玻璃器皿，并用 ddH₂O 多次冲洗。2此外，应将其与其他可能残留洗涤剂中常见磷酸盐痕迹的玻璃器皿分开存放。
  3. 加入90 µL 含或不含 Cdr1-ATP酶抑制剂（20 µ将寡霉素（M）加入96孔微孔板的各个孔中。
    注意：该实验需设三个重复。
  4. 加入5 µL 的分离质膜（约 5-10） µg蛋白）或磷酸盐标准品（0-100 nmol Pi）加入微孔板的相应孔中。
    注意：将第一列和最后一列保留用于两组独立的磷酸盐标准品。
  5. 开始实验，加入25 µL 预热的 28.8 mM Mg-ATP（终浓度 6 mM）加入各孔中，用多通道移液器混匀后于 30 °C 孵育 °30 分钟，30 °C
  6. 通过加入130 μL终止反应 µ1.6% 的 L-抗坏血酸钠、1% 的十二烷基硫酸钠（SDS）、12% 的钼酸铵溶于 6 M 硫酸中的显色试剂溶液
    警告：浓硫酸与水剧烈反应，具有腐蚀性，可能造成皮肤和肺部损伤。
  7. 室温孵育10分钟。
  8. 使用微孔板读数仪在 750 nm 处测定微孔板各孔的吸光度。
    ​注意：显色反应（即还原型磷钼酸复合物生成蓝色染料）的孵育时间必须严格控制在10分钟，因为蓝色染料的生成会随时间持续进行，这对检测结果的准确性至关重要。
  9. 通过从无寡霉素存在时的总ATP酶活性中减去寡霉素存在时的ATP酶活性，计算获得Cdr1特异性ATP酶活性（即寡霉素敏感型ATP酶活性）。

6. 小规模去垢剂筛选

  1. 将过表达 Cdr1-mGFPHis 的细胞的质膜制备物（即 2.5 mg 质膜蛋白）与 GTED-20 缓冲液 [10 mM Tris、0.5 mM EDTA、20 % (w/v) 甘油；pH 7.5；新鲜添加 1 mM PMSF] 混合，并加入 5 mg 待测去垢剂，使总体积达到 0.5 mL，并含有 1% (w/v) 去垢剂。
  2. 在 4–8 °C 下，使用旋转装置旋转混合物 2 小时。
  3. 在 4 °C 下以 141,000 × g 离心 1 小时。
  4. 将含有已溶解组分的上清液转移至新的微量离心管中。
  5. 向不溶性沉淀部分加入 0.5 mL 含 2% (w/v) SDS 的 GTED-20 缓冲液，在摇床培养箱中 30 °C 过夜孵育，以提取所有去垢剂不溶性膜蛋白。
  6. 通过 SDS-PAGE 分析并比较上清液和已溶解沉淀部分。
  7. 在考马斯亮蓝染色前，对含有 GFP 标签蛋白的凝胶进行胶内 GFP 荧光成像并拍照，并使用成像系统定量表达水平。
  8. 将可溶性膜蛋白组分用于后续应用，例如荧光尺寸排阻色谱法（FSEC）58，以鉴定合适的去垢剂。

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结果

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转化频率较高 S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 转化子/微克）是使用 pYES2 实现的（图2B）。与预期一致，无DNA（即ddH₂O）对照组2O仅）对照未产生任何转化子，而1 µg线性化 CDR1-mGFPHis 转化盒（图1A) 获得约 50 个转化子（图 2C采用优化的 ADΔΔ 转化方案。 CDR1-mGFPHis 转化子还通过其在非发酵性碳源上的生长能力进行检测，以排除任何可能的线粒体功能缺陷的小菌落突变体。三个（黄色圆圈； 图 2D) 在测试的25个尿嘧啶原养型转化子中，无法在YPG琼脂平板上生长的被排除在进一步研究之外。新构建的菌株ADΔΔ-CDR1-mGFPHis所表达的Cdr1-mGFPHis正确地定位于质膜（

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讨论

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尽管膜蛋白的结构分析已取得最新进展，但目前尚无Cdr1或任何其他PDR转运蛋白的三维结构。因此，了解Cdr1的结构及其生化特征至关重要，这不仅有助于合理设计新型药物以克服外排介导的耐药性，还将揭示ABC蛋白一个重要亚家族的功能机制。

膜蛋白结构表征的主要要求之一是以X射线晶体学或冷冻电镜所需的数量表达正确折叠且完整的膜蛋白。在选择表达系统时，重要的标准包括操作的简便性、生长速率和成本，以及表达具有翻译后修饰蛋白的能力，这些修饰对蛋白的功能和/或稳定性可能至关重要61,62。

在过去的二十年中 S. cerevisiae 膜蛋白表达技术60 已优化14 以促进目标膜蛋白的一步法克隆24 在N端或C端标记了各种亲和标签、表位标签或报告标签，并且在需要时，其...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者们衷心感谢新西兰马斯登基金（项目编号 UOO1305）以及泰国曼谷朱拉隆功大学医学院提供的项目经费（M. Niimi）。他们感谢奥塔哥大学为 G. Madani 提供的博士奖学金。作者们还希望感谢斯特凡·劳瑟教授及其同事阿米尔·阿佩尔鲍姆博士和戴瓦纳亚加巴里亚蒂·维纳亚甘博士，在 G. Madani 于德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所（MPIMP）为期六个月的访问期间所提供的支持与指导。作者们同时感谢德国学术交流中心（DAAD）为 G. Madani 提供的研究资助（项目编号 57381332），以支持其访问 MPIMP。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)Sigma-AldrichM3671
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 (Tris 碱；超纯)Merck77-86-1
2,2-二癸基丙烷-1,3-双-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceNG310SLMNG
2,2-二己基丙烷-1,3-双-β-D-葡萄糖吡喃糖苷AnatraceNG311SOGNG (MNG-OG)
2,2-二辛基丙烷-1,3-双-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceNG322SDMNG
4-反式-(4-反式-丙基环己基)-环己基 α-D-麦芽糖吡喃糖苷Glycon Biochemicals GmbHD99019-CPCC-α-M
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (37.5:1)Bio-Rad1610148
乙酸 (冰醋酸)Merck64-19-7
琼脂Formedium 009002-18-0
钼酸铵Sigma-Aldrich13106-76-8
过硫酸铵 (APS)Bio-Rad1610700
ATP 二钠盐sigma-AldrichA-6419
溴酚蓝SERVA Electrophoresis GmbH34725-61-6
CHAPSAnatraceC316S
CHAPSOAnatraceC317S
CSMFormediumDCS0019
CSM 缺尿嘧啶FormediumDCS0161
环己基-1-丁基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceC324SCYMAL-4
环己基-1-庚基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceC327SCYMAL-7
环己基-甲基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceC321SCYMAL-1
皂苷Sigma-Aldrich11024-24-1
二硫苏糖醇 (DTT)Roche Diagnostics10197785103
DMSOMerck67-68-5
乙醇Merck459836
乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA; Titriplex III)Merck6381-92-6
ExoSAP-IT PCR 产物纯化试剂Applied Biosystems78205外切酶与磷酸酶的混合物
葡萄糖Formedium50-99-7
甘油Merck56-81-5
甘氨酸MerckG8898
HEPESFormedium7365-45-9
盐酸Merck1003172510
KOD Fx NeoTOYOBO CoKFX-201用于可靠的菌落 PCR
乙酸锂 (LiAc)Sigma-Aldrich546-89-4
六水合氯化镁sigma-AldrichM2393
MESFormedium145224-94-8
n-癸酰-N-羟乙基-葡萄糖酰胺AnatraceH110SHEGA-10
n-癸酰-N-甲基-葡萄糖酰胺AnatraceM320SMEGA-10
n-癸基-磷酰胆碱AnatraceF304SFos-choline-10
n-癸基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceD322SDM
n-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐AnatraceAZ312SAnzergent 3-12
n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物AnatraceD360SLDAO
n-十二烷基-α-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceD310HAα-DDM
n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceD310Sβ-DDM
n-壬基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷AnatraceN324SNG
n-壬基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceN330SNM
n-十八烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐AnatraceAZ318SAnzergent 3-18
n-辛基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐AnatraceAZ308SAnzergent 3-8
n-辛基-磷酰胆碱AnatraceF300SFos-choline-8
n-辛基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷AnatraceO311SOG
n-十四烷基-磷酰胆碱AnatraceF312SFos-choline-14
n-十四烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceT315STDM
n-十三烷基-磷酰胆碱AnatraceF310SFos-choline-13
n-十三烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceT323S-
n-十一烷基-β-D-麦芽糖吡喃糖苷AnatraceU300SUM (UDM)
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 (TEMED)Sigma-AldrichT9281
辛基苯氧基聚乙氧基乙醇Sigma-Aldrich9002-93-1TRITON X-100
寡霉素Sigma-Aldrich75351
蛋白胨Formedium3049-73-7
苯甲基磺酰氟 (PMSF)Roche Diagnostics329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA 聚合酶New England BiolabsM0535S高保真 DNA 聚合酶
聚乙二醇 (PEG 3350)Sigma-Aldrich25322-68-3
聚氧乙烯山梨醇单油酸酯Sigma-Aldrich9005-65-6TWEEN 80
硝酸钾Sigma-AldrichP8394
蛋白检测试剂盒Bio-Rad5000122RC DC 蛋白检测试剂盒 II
QC 胶体考马斯亮蓝染色液Bio-Rad1610803
Prism Ultra 蛋白分子量标准 (10-245 kDa)AbcamAB116028
叠氮化钠Sigma-Aldrich71289
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich151-21-3SDS
钠-L-抗坏血酸 BioXtraSigma-Aldrich11140
蔗糖单十二烷酸酯AnatraceS350SDDS
硫酸Sigma-Aldrich339741
酵母提取物Formedium008013-01-2
不含氨基酸的酵母氮源基础FormediumCYN0402
 仪器（类型）
离心机  (Eppendorf 5804)Eppendorf
离心机 (Beckman Ultra)Beckman
离心机 (Sorvall RC6)Sorvall
FSEC 装置（配备荧光检测器、自动进样器和组分收集器的 NGC 层析中压系统）Bio-Rad
凝胶成像 (GelDoc EZ 成像仪)Bio-Rad
微孔板读数仪 (Synergy 2 多功能检测)BioTek Instruments
PCR 扩增仪 (C1000 Touch)Bio-Rad
电源 (PowerPac)Bio-Rad
SDS-PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)Bio-Rad
摇床培养箱 (Multitron)Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life SciencesGE17-5172-01
紫外/可见分光光度计 (Ultraspec 6300 pro)Amersham BioSciences UK Ltd

参考文献

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ABC mGFPHis

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