用于分析 念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备

从原生脂质环境中提取整体膜蛋白会显著影响其结构和功能1、2、3、4。生物膜⁵的复杂脂质组成确保了至关重要的蛋白质-脂质相互作用可能发生^6。脂质保持膜蛋白的结构完整性，从而使它们能够在膜室目标^7，8正确运作。因此，膜蛋白纯化的关键第一步是从其原生环境中提取蛋白质，而不影响其结构和/或功能。

膜蛋白的结构存在许多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，难以以X射线晶体学或低温电子显微镜（Cryo-EM）9、10、11、12所需的数量表达适当折叠和功能膜蛋白。膜蛋白表达系统有三种类型:同源^性9、异质13、14、15和体外表达系统16、17。许多表达系统的表达水平往往很低，或成本过高，因此只有少数宿主成为生产膜蛋白的首选。它们包括细菌宿主，大肠杆菌，酵母S.塞雷维西亚和皮希亚面食，和更高的真核生物，如Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞系^18。所有膜蛋白表达技术各有优缺点:然而，S.Cerevisiae也许是研究得最好的真核模型有机体，适合膜蛋白的生产。它具有高度多功能性，在基因工程、药物发现、合成生物学和真核膜蛋白^{14、19、20、21}的表达方面具有很强的应用性。

在这项研究中，使用了一项获得专利的S.cerevisiae膜蛋白表达技术^21，以S.Cerevisiae AD+14和^AD+22为首选宿主（图1A），以过度表达和研究主要的C.藻类多药排泄泵Cdr1。S. cerevisiae菌株均为 AD1-8u^-23的衍生物，具有ura3 （AD+） 或ura3及其1 （AD+） 基因，以消除任何通过URA3或HIS1基因组洛奇的不需要整合产生的假阳性尿素或组织丁原体转化剂。图1A中指出的7种主要多药排泄物泵²³的删除，使得AD+对大多数异种生物非常敏感。功能增益突变转录因子Pdr1-3通过两个同源重组事件整合了基因组PDR5点的异质-ORF转化盒（图1A）后，导致Cdr1（图1A中的红色八角形）等异质膜蛋白的构成过度表达。C-终端mGFPHis标记蛋白的适当等离子膜定位可以通过共聚焦显微镜（图1A）确认，他的标签可用于标记蛋白质的镍亲和纯化。然而，将一些真菌ABC运输机（例如，坎迪达·克鲁塞ABC1）克隆成pABC3衍生质粒是不可能的，因为它们由于细胞毒性而无法在大肠杆菌中传播。这促使膜蛋白^14、24的单步克隆的发展^，这些蛋白在N-或C终点站被标记为具有各种亲和力、表位或记者标签，直接进入S.Cerevisiae AD+（图1C）。塞雷维西亚AD+菌株过度表达各种CDR1突变体也可以有效地创建这种方式，使用多达5个单独的PCR片段重叠25个基点（图1C）。利用此协议，许多感兴趣的ORF可以在很短的时间内以低成本和高效率进行克隆、表达和定性。每增加一个 PCR 片段，转化效率只会降低 ±2 倍。 

如果需要，表达水平也可以很容易地通过入门设计操纵，以可预测地将表达水平调低到通常高，构成表达水平^{25的0.1%-50%}之间。优化的，多功能的， pABC3¹⁴衍生克隆载体， pABC3 - XLmGFPHis²⁶ （图 1B）包含一个 HRV - 3C 蛋白酶位点（ X :列夫夫克|GP），一种蛋白酶，在4°C下表现优于常用的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶^27。L是一种五氨基酸（GSGGS）链接器，mGFP是一种单体突变体（A206K）28、29版酵母增强绿荧光蛋白变异yEGFP3^{3 30，}而他的是一个三氨基酸连结剂（GGS），其次是六异丁（HHHHH）镍亲和蛋白纯化标签。

这种表达技术已成功地应用于药物发现和膜蛋白的研究。真菌偶佐尔药物靶点的第一个结构，S.塞雷维西亚Erg11^31，是利用这项技术解决的。它还使C.藻类Cdr1^32，33，34的详细特征和创建一个赛斯坦缺乏Cdr1分子³⁵适合赛尔坦交叉链接研究，以验证任何未来的高分辨率结构。许多其他ABC运输机从主要的人类真菌病原体（即， C. 阿尔比肯斯，坎迪达格拉布拉塔，坎迪达奥里斯，坎迪达克鲁塞，坎迪达使用，隐球菌新福尔曼斯，阿斯珀吉卢斯富米加图斯，青霉素马内菲，和富萨里姆索拉尼物种复合体）也已使用这个表达平台24，36，37，38，39详细研究。这使得在高通量屏幕上使用的S.cerevisiae菌株的面板能够过度表达的污水泵，从而发现新型荧光浮流泵基材尼罗河红色⁴⁰和特异^性41和广谱14、33、42、43、44 efflux泵抑制剂。该系统的使用也使发现木糖线作为同类广谱真菌多药排泄泵抑制剂^42。

膜蛋白的完全溶化和创建无内源脂质的同质膜蛋白-鼠类制剂，需要高洗涤剂浓度^45。但不幸的是，这也经常灭活膜蛋白^{5，8，45，46。}洗涤剂单体的特性和溶液中的聚合受疏水尾部的物理特性、烷基链的长度和分支、芳香核或氟烷基侧链的存在或聚氧乙烯单元的数量的影响。因此，洗涤剂筛选是确定最适合膜蛋白溶解和纯化的洗涤剂的重要第一步。

C.藻类是人体免疫功能低下的主要真菌病原体，可引起严重、危及生命的侵入性感染⁴⁷种，可对偶祖抗真菌药物产生抗药性48、49。C.藻类耐多药性的主要机制之一是Cdr1⁵⁰的过度表达，这是位于等离子膜中的ABCG亚家庭II型ATP绑定盒式（ABC）运输机^51。全尺寸真菌 ABCG 运输机（由两个核苷酸结合域 [NBD] 和两个跨膜域 [TMD] 组成） 更通常被称为全热带耐药性 （PDR） 运输机，其特点是其独特的倒置域拓扑 [NBD-TMD]_2.PDR运输机只在^{植物52，53}和真菌⁵⁴发现。尽管PDR运输机的重要性，没有结构，虽然结构为人类半尺寸ABG运输机最近已经解决，这有助于创造Cdr1³³的第一个试探性模型。然而，我们最近的实验证据表明，这种模型存在缺陷，可能是因为真菌PDR运输机具有特有的不对称性NBD，很可能形成一种独特的运输机制。因此，Cdr1 的高分辨率结构既需要合理设计有助于克服以埃夫卢斯为媒介的耐药性的新颖的 efflux 泵抑制剂，又需要深入了解这一重要的 ABC 运输机系列的行动机制。

本研究的目的是为转基因 的S.Cerevisiae 表达宿主的Cdr1表达、溶解和纯化制定可靠的协议，最终目的是为Cdr1获得高分辨率结构。作为此过程的一部分，一个蛋白酶可切割的 mGFPHis 双标签 （图 1B）设计与 16 残渣链接器分离标签从 Cdr1 的 C 总站， 这改善了附加的 6x 他的亲和力标签与镍亲和树脂的结合， 并使监测 Cdr1 表达水平在活细胞和整个净化过程中.还开发了含有约 10%C.藻类 Cdr1（根据SDS-PAGE之后库马西染色估计）的小规模酵母血浆膜蛋白制剂的可重复协议，可用于Cdr1的生化表征。

1. 准备新鲜或冷冻的转化库存，使AD+和AD+细胞具有能力

1. 接种 25 mL 的 2 倍 Ypcd [即 2 倍 Ypd; 2% （w/v） 酵母提取物， 2% （w/v） 丙酮， 4% （w/v） 德克斯特罗斯）， 0.079% （w/v） CSM （完全补充混合物）]³⁵ 介质与单个酵母菌落和孵育过夜 （o/n） 16 小时在 30 °C 与摇晃在 200 转每分钟 （rpm）.。
2. 接种 225 mL 的 2x YPCD 介质与 25 mL o/n 培养，并检查细胞光学密度在 600 nm （OD_600）:OD₆₀₀ 通常是 +0.5-1.0。
   注:在此阶段，请确保以下转换实验所需的所有材料都随时可用。
3. 在 30 °C 下将培养体再生长 6-8 小时，在 200 rpm 时摇晃，直到细胞密度达到_{OD 600} +6-8。
   注:除非另有说明，否则以下步骤在室温 （RT） 下执行。
4. 以 3，000 x g 的离心法收获这些对数相细胞，使用 3 分钟。
5. 重新使用无菌双蒸馏水（ddH₂O;即200 mL，然后是20ml）清洗细胞两次。
6. 以 3，000 x g 的采收细胞 3 分钟。
7. 慢慢地（即，每分钟添加30个等量的冷冻合格细胞（FCC）溶液，30分钟）将细胞颗粒重新用于FCC的X mL [5%（w/v）甘油， 10% （v/v） 二甲基硫氧化物 （DMSO）] 在冰上 （其中 X = OD_600;例如， 如果 OD₆₀₀ = 6 重吸在 6 毫升， 或者如果 OD₆₀₀ = 3 重吸在 3 毫升） 。
   注:正确的 FCC 组合对于转型成功至关重要。
8. 在转化前将细胞放在冰上 2 小时，或在 -80 °C 下储存阿利库特，直到需要为止。
   注意:AD+和AD+细胞对冷冻非常敏感。因此，细胞必须慢慢冷却到-80°C:将含有50-600微L细胞的冰冷微中心管放入塑料储物盒（RT）中。将盒子放在一个较大的聚苯乙烯容器 （RT） 中，并用合适的聚苯乙烯盖关闭容器。然后，将容器放入 -80 °C 冰柜中。
   警告:缓慢冷冻对细胞存活至关重要。

2. 与CACDR1-XLmGFPHis的AD+和AD+的转化，以及通过菌落PCR和DNA测序确认正确的转化剂

注:Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis 是使用传统克隆策略创建的，详细描述在 Lamping 等人，2010^{年 55，}并图1B中说明。野生型C.藻类CDR1被分离为PacI/不是我碎片从质粒pABC3-CACDR1A-GFP¹⁴和克隆成pABC3-XLmGFPHis^26。

1. PCR 放大整个CDR1转换盒式磁带，使用高保真DNA聚合酶和底漆对 PDR5 亲/PDR5-ter³⁵使用 1-10 ng pABC3-CACDR1-XLmGFPHis 作为 DNA 模板或， 或者，消化 2 μg 的 pABC3-CACDR1-XLmgFPHis 完成与 10 U 限制酶AscI 在 37 °C （图 1A，B）.
   注 :CDR1 转换盒式磁带（图1A）包括 PDR5 发起人 - CACDR1-mGFPHis - PGK1 终结者 - URA3 选择标记 - PDR5 下游区域。
2. 执行玫瑰凝胶电泳和凝胶提取 +8 kb 转换盒式磁带。
   注:凝胶净化 +8 kb CaCDR1 转换盒式磁带可去除任何可能未消化的质粒 DNA，这可能导致具有整个质粒的不正确的变压器，而不是集成在基因组 PDR5 位置的线性转化盒式磁带。
3. 在沸水中洗澡10分钟，在冰上保持10分钟，使所需的鲑鱼精子携带DNA（2毫克/毫升;10mM Tris，1mM EDTA;pH 7.5）变性。使用螺丝盖管煮鲑鱼精子DNA，以避免打开盖子。
4. 将 50 μL 的变性鲑鱼精子 DNA 与 14 μL 的转化盒式磁带（500-2，000 ng）混合，并将 64 μL 的 DNA 混合物保留在冰上，直至进一步使用。
   注:使用10 ng大肠杆菌-酵母梭质粒（如pYES2）作为正变换控制（图2B）。
5. 在 30 °C 的水浴中，重新使用新鲜或冷冻的合格细胞快速解冻 5 分钟，并将它们分成 1.5 mL 微中心管中的 50 微升小块。
6. 以离心的方式在微富中以最大速度（18，000 x g）收获细胞1分钟。
7. 取出超高纳特，将细胞颗粒保留在RT。
8. 对于每次转换，通过重复管道将 296 μL 组合 （RT） 混合到 260 μL 的 50% （w/v） 聚乙烯乙二醇 （PEG 3350） 和 36 μL 的 1 M 醋酸锂 （LiAc） 中，并加入适当的 64 μL 冰冷 DNA 混合物。
9. 立即将适当的混合物添加到 50 μL 称职的细胞颗粒阿利库特中。
10. 通过彻底涡旋约 30s，在 PEG-LiAc-DNA 混合物的 360 μL 中重新吸收细胞颗粒。
11. 将细胞混合物在 30 °C 的水浴中孵育 1 小时。
    注意:AD+和AD+细胞在30°C时比在^42°C35时转换得更好。
12. 以 18，000 x g 的 10s 收获细胞。丢弃超高分子，在 ddH₂O 的 80 μL 中重新使用细胞颗粒。
13. 将细胞扩散到CSM-URA琼脂板^35[ 即0.67%（w/v）酵母氮碱，无氨基酸，0.077%（w/v）CSM减去尿素，2%（w/v）葡萄糖和2%（w/v）琼脂]。
14. 在 30 °C 下孵育板 2-3 天，直到尿素原营养变异剂清晰可见。
    注:预计每 μg 线性 +8 kb CaCDR1 转换盒式磁带的 100 个变压器和每 μg pYES2 的 +4 x⁴ 变压器。
15. 挑选五种独立的变压剂，并将其铺在新鲜的CSM-URA板上，将尿素原体变压剂与未转化宿主细胞的残余物分离。
16. 通过在 YPG-agar 板上种植变压剂 [1% （w/v） 酵母提取物、2% （w/v） peptone、2% （v/v） 甘油和 2% （w/v） agar] （图 2D）来去除任何可能娇小的突变体。
    注:小突变体有缺陷的线粒体，因此不能在不可发酵的碳源上生长。它们在 塞雷维西亚⁵⁶中很常见。 塞雷维西亚 AD+ 和 AD+ 特别容易获得娇小的表型。
17. 执行酵母菌落PCR，并确认至少三个独立的变压剂被正确集成到基因组 PDR5 蝗虫（图1C）通过放大整个+8 kb CaCDR1 转换盒与特定的DNA聚合酶，优化放大PCR产品从不纯的DNA模板来源。使用一组在集成站点外绑定的引物和从单个菌落中提取的 1 μL 细胞悬浮物（在 ddH₂O 中）作为 DNA 模板。
    注:这种特殊的DNA聚合酶可靠地放大了从完整的酵母细胞中提取的+8kb PCR片段。但是，要进行可靠的放大，需要 45 个 PCR 周期，酵母细胞必须在 DDH₂O 中的 OD₆₀₀ 1-10 中重用。
18. 通过 PCR 反应 1 μL 部分的 DNA 阿加罗斯凝胶电泳确认正确的 +8 kb PCR 放大产品。
19. 在使用经过处理的 DNA 样本的一部分使用适当的引物对整个 ORF 进行测序之前，根据制造商的说明，用单链 DNA 外阴道酶和磷酸酶的酶混合物从 PCR 反应的 10 μL 部分中取出多余的放大引物。

3. 小尺度酵母血浆膜分离协议

1. 生长酵母细胞
   1. 在 30 °C 的 YPD 10 mL 中预先培养一个酵母菌群，在 7 -8 小时时，在 200 rpm 时摇晃。
   2. 用 10 mL 预培养接种 40 mL 的 YPD 介质，并在 30 °C o/n （+16 h） 下孵育细胞，在 200 rpm 时摇晃，直到细胞密度达到 OD₆₀₀ 的 1-3。
2. 收获酵母细胞
   1. 在 4，200 x g的对数相单元（ODU; 例如，OD₆₀₀的 1 × 1 ODU）中收获 1 mL，在 4 °C 下收获 5 分钟。
   2. 用冰冷无菌 ddH₂O（即 40 mL，然后是 1 mL）两次重复和清洗细胞;在 4，200 x g 的台阶之间以 4，200 x g 在 4 °C 下以 5 分钟采集细胞。"
   3. 将颗粒重新沉积在 1 mL 的冰冷无菌 ddH₂O 中，并将细胞悬浮液转移到预冷却（冰上）1.5 mL 微中心管中。
   4. 在 4 °C 下以 3，300 x g 为 3 分钟收获细胞。
   5. 吸气超人。
   6. 将细胞颗粒重新用于 0.5 mL 均质缓冲器 [HB;50 mM Tris， 0.5 m EDTA， 20% （v/v） 甘油; pH 7.5] 新鲜补充 1 mM 苯甲基硫化物 （PMSF）。
      注意:始终添加 PMSF 新鲜，因为 PMSF 在接触水中后会迅速失活。
      警告:PMSF是一种血清蛋白酶抑制剂，对组织具有极强的腐蚀性和破坏性。它可能会导致不可逆转的眼睛损伤。
   7. 将电池悬架存储在 -80 °C 或立即使用。
3. 等离子膜的分离
   1. 如果冷冻，将冰上的细胞解冻1小时。
   2. 在 0.5 mL 电池悬架上加入直径为 0.5 mm 的冰冷硅珠，总体积达到 1 mL。
   3. 以最大震动强度打破6个漩涡周期的细胞，持续1分钟，在冰上穿插3分钟的冷却期。
   4. 用加热的手术刀刀片在管子底部打一个薄洞。
   5. 通过安装在另一个冰冷的 1.5 mL 微中心管中，通过 10 s 低速（+200 rpm）旋转将断裂的细胞同质化收集到管子底部。
      注:这确保了硅珠保留在原始管中。
   6. 在 4 °C 下将细胞同质化 5，156 x g， 以 5 分钟去除细胞碎片、未断裂的细胞和细胞核。
   7. 将 450 μL 超高分子转移到冰冷的 1.5 mL 微中心管中，并添加额外的 1 mL 冰冷 HB，并辅以新鲜 PMSF （1 mM）。
      注:此稀释步骤对于高质量等离子膜蛋白的恢复至关重要。
   8. 在 4 °C 下以 1 1 小时 1 美元收集等离子体膜，通过重复管道将等离子膜颗粒重新注入 100 μL 的 HB 中，新鲜补充 1 mM PMSF。在释放 100 μL 的 HB 和上下移液之前，用 100 μL 移液器尖端搅拌细胞颗粒，从而松开细胞颗粒，使适当的等离子膜均质化。
   9. 用与含有降压剂和洗涤剂的缓冲剂相容的蛋白质检测试剂盒测量等离子膜制剂的蛋白质浓度。
   10. 将等离子膜储存在 -80 °C 或保持在冰上立即使用。

4. 硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

1. 组装用于准备聚丙烯酰胺凝胶的仪器。
2. 对于两个分离凝胶（7% 聚丙烯酰胺），混合 2.1 mL 的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，3 mL 的 4 倍分离缓冲器 （1.5 M Tris， 0.4% 硫酸钠 [SDS] （w/v）; pH 8.8） 和 6.9 mL 的 ddH₂O. 添加 8 μL 四甲基二胺 （TEMED） 和 60 μL 的 10% 渗透铵 （APS） 启动丙烯酰胺聚合。
   警告:丙烯酰胺/双丙烯酰胺毒性极强。它引起皮肤刺激，周围神经病变，是致癌物质。如果吞咽或吸入，TEMED 是有害的。如果吞咽，APS 是有害的。它会导致严重的眼部和皮肤刺激。
3. 将这种混合物的 +4-5 mL 倒入组装的凝胶装置中，距离顶部高达 ±2 厘米。
4. 小心地将 +1-2 mL 的 0.1% SDS 层叠加在上面，以创建平面半月板。
5. 允许聚丙烯酰胺设置为 +60 分钟在 RT。
6. 通过混合 0.5 mL 的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，为两种凝胶准备堆叠凝胶混合物， 1 mL 的 4 倍堆叠缓冲器 （0.5 M Tris， 0.4% SDS （w/v）; pH 6.8） 和 6.9 mL 的 ddh₂O. 添加 2 μL 的 TEMED 和 30 μL 的 10% APS，以启动丙烯酰胺的聚合。
7. 从聚合分离凝胶中取出 0.1% SDS 层，用 ddH₂O 冲洗以去除 SDS 的痕迹。
8. 将堆叠凝胶混合到分离凝胶上。
9. 将梳子放入堆叠凝胶中，并从梳子周围去除任何气泡。
10. 允许堆叠凝胶设置为 +60 分钟在 RT。
11. 取下梳子，用水冲洗凝胶槽。将凝胶放入凝胶罐中，用 1 倍运行缓冲器（24.8 m Tris、190 mglycine、0.1% SDS）将凝胶罐填充到顶部。
    注:从存储在 RT 的 10 倍缓冲库存（248 m M Tris、1.9 M 甘氨酸、1% SDS（w/v） ddH₂O）中准备 1x 运行缓冲器。
12. 混合 5-10 μL 等离子膜样品（即 10-20 μg 蛋白质），具有等量的 2 倍蛋白质加载染料 [120 mM Tris-HCl （pH 6.8）、20% 甘油、0.02% 溴酚蓝色、4% SDS、200 mM 二甲醚 （DTT）]，并立即加载到淹没在运行缓冲器中的单独凝胶槽中。
    警告: 如果吞咽， Dtt 是有害的。它会导致严重的眼部和皮肤刺激。
    注:制作 10 mL 库存 2 倍蛋白质加载染料，在 -20 °C 下储存。 不要加热混合样品，但立即将它们加载到单独的凝胶槽中，以便 GFP 标签不会变性，并且可以检测到凝胶内荧光信号。
13. 将蛋白质分子量标记（10-245 kDa 范围）加载到单独的插槽中，以便对单个蛋白质片段进行大小估计。
14. 在 200 V 下执行凝胶电泳，直到蓝色装载染料到达凝胶底部（通常为 45-55 分钟）。
15. 使用凝胶成像系统检查凝胶内 GFP 荧光（激发和发射波长分别为 475-485 nm 和 520 nm）。
16. 在凝胶内荧光成像后，在 RT 的 15 分钟内，通过在 +10-20 mL 蛋白凝胶固定溶液（40% 乙醇、10% 醋酸）中温和搅拌凝胶来修复蛋白质。
17. 用 10 mL 的 ddH₂O 冲洗凝胶两次 10 分钟，并将凝胶放入 10 mL 胶体库马西污渍溶液中，在 RT 轻轻摇晃 1 小时，可视化蛋白质带。
18. 为了改善蛋白质带的可视化，在与凝胶成像系统记录图像之前，先用 ddH₂O 的 ±20 mL 将凝胶除污一次或两次，然后再进行 +1 h 的记录。

5. Cdr1 ATPase 活动^{57 的}确定

1. 稀释血浆膜样品>2.2毫克/mL至1-2毫克/mL在HB。
2. 均衡ATPase检测鸡尾酒（75mM MES-Tris，75mM硝酸钾， 0.3 mM 铵甲酸酯，7.5 mM 钠阿齐德;pH 7.5） 和 Mg-ATP（28.8 mM ATP 二恶英盐，28.8 mM MgCl_2;pH7.0）至 30°C 在 30°C 孵化器中。
   警告:阿齐德钠是剧毒的。
   注:确保所有缓冲库存和瓶装无磷酸盐:即，用 1% （vol/vol） HCl 清洗玻璃器皿，然后用 ddH₂O 冲洗几次。此外，将其与其他可能含有磷酸盐痕迹的玻璃器皿分开，这些玻璃器皿通常存在于用于洗涤玻璃器皿的洗涤剂中。
3. 加入90微升的检测鸡尾酒，无论是否含有Cdr1-ATPase抑制剂（20 μM的寡霉素），加入96井微提亚板的单独井中。
   注:检测以三重执行。
4. 将分离的等离子体膜（+5-10 μg 蛋白）或磷酸盐标准（0-100 nmoles Pi）加入微提亚板的适当井中。
   注:保留两组单独的磷酸盐标准的第一列和最后一列。
5. 开始检测时，将预热 28.8 mM Mg-ATP（6 mM 最终浓度）的 25 μL 加入多通道移液器到单独的油井中，并在 30 °C 下孵育 30 分钟。
6. 通过添加 130 μL 开发试剂（1.6% L-ascorbate 钠、1% SDS、12% 6M 硫酸中的铵聚氨酯）来停止反应。
   注意:浓缩硫酸与水发生剧烈反应。它是腐蚀性的，可能会导致皮肤和肺部损伤。
7. 在 Rt 孵育 10 分钟。
8. 用微提亚板读卡器阅读 750 nm 的微提亚板井的吸收量。
   注:坚持蓝色染料开发的10分钟潜伏时间（即减少磷-摩尔腺复合物）对检测精度至关重要，因为蓝色染料的开发会随着时间的而继续。
9. 在没有寡霉素的情况下，将在存在寡霉素的情况下的 ATPase 活性从总 ATPase 活性中减去，从而获得 Cdr1 特定的 ATPase 活性（即对寡霉素敏感的 ATPase 活性）。

6. 小尺度洗涤剂屏幕

1. 将细胞过度表达Cdr1-mGFPHis的血浆膜制剂（即2.5毫克血浆膜蛋白）与GTED-20缓冲器[10mM Tris] 0.5 m M EDTA， 20 % （w/v） 甘油; pH 7.5; 新鲜补充 1 mM PMSF] 含有 5 毫克的测试洗涤剂， 达到总体积 0.5 mL 补充 1% （w/v） 洗涤剂.
2. 将混合物在 4-8 °C 下旋转 2 小时，并配有旋转装置。
3. 将混合物在 141，000 x g 下离心，在 4 °C 下离心 1 小时。
4. 将含有溶解材料的超高纳特转移到新鲜的微中心管中。
5. 在不溶性颗粒分数中加入 0.5 mL GTED-20 缓冲器，辅以 2% （w/v） SDS，并在摇晃的培养器中以 30 °C o/n 孵育，以提取所有洗涤剂不溶膜蛋白。
6. 通过 SDS-PAGE 分析和比较超高分子和溶化颗粒分数。
7. 在库马西染色之前，拍摄含有 GFP 标记蛋白质的凝胶，用于凝胶内 GFP 荧光，并使用成像系统量化表达水平。
8. 使用可溶膜蛋白分数用于下游应用，如荧光大小排除色谱 （FSEC）⁵⁸ 来识别合适的洗涤剂。

使用 pYES2（图 2B）实现了S. cerevisiae AD+的高频率转换 （+4 x10 4变压剂/μg）。不出所料，无DNA（即仅限ddH2O）控制没有给出变压剂，线性CDR1-mGFPHis转换盒式磁带（图1A）的1微克给+50变压器（图2C）与优化的AD+转换协议。CDR1-mGFPHis变压剂还测试了它们在不可发酵碳源上生长的能力，以消除任何可能有缺陷线粒体的娇小突变体。三（黄色圆圈:图2D）在测试的25种尿素原体变异剂中，YPG琼脂板不能生长，经进一步调查后被丢弃。新创建的菌株AD+-CDR1-mGFPHis所表达的Cdr1-mGFPHis在等离子体膜（图1A）中正确定位，并表达在足够的水平，用于Cdr1的结构和功能特征（图3）。优化后的双标签 （图1B）的设计还能够在 Cdr1-mGFPHis 的镍亲和度纯化后删除 mGFPHis 双标签，以防止标签在下游应用中可能受到干扰。然而，初步结果表明， Cdr1 和 HRV - 3C 蛋白酶裂口部位之间的 3 个氨基酸连接器可能需要扩展才能实现更快、更有效的。最近也报告了类似的观察结果，为 N 终端标记核苷运输机Escherichia 大肠杆菌NupC ，这需要一个 15 ，而不是最初设计的 3 氨基酸连接器，以有效地的洗涤剂（ DDM ）溶解 NupC 绑定到镍亲和树脂59 。HRV - 3C 部位的 5 个氨基酸连接器 C - 终端可防止 mGFPHis 双标签与附加的感兴趣的蛋白质的模具干扰，我们以前曾观察到C . 功利 SABC运输机 Cdr139 。yEGFP3-A206K突变的产生是为了防止高蛋白浓度28的人工GFP-分化，mGFP和他的镍亲和力标签之间的另外3个氨基酸连接器确保了他标签的适当表面暴露，以最大限度地提高标记蛋白与镍亲和树脂的结合效率（数据未显示）。

图1:酵母膜蛋白表达平台，用于真菌血浆膜输送机的高效克隆和表达。 （A） 由 PDR5 发起人（蓝色 ）、CDR1（ 红色）C-最终标记为 XLmGFPHis（绿色 ）、PGK1 终结者（橙色 ）、URA3 选择标记（浅蓝色）和 PDR5 下游区域（蓝色）组成的转换盒用于转换表达主机 S.cer 通过在基因组 PDR5 点进行整合。功能增益突变转录因子 Pdr1-3 导致等离子膜中 Cdr1（红色八角形）的构成过度表达（参见下面的共聚焦显微镜图像）。（B） 普拉斯米德pABC3-XLmGFPHis，可用于传统的克隆策略或PCR模板，以产生一个转换盒式磁带。质粒 pABC3-XLmgfpHis 在 pABC3-GFP14 上的改进列在质粒图下方。（C） 另一种更有效的单步克隆策略，以整合AD+基因组 PDR5 点的转化盒式磁带。ORF（红色）可以使用与左臂重叠的引物（箭头）放大PCR（蓝色; PDR5 发起人）和右臂（绿色; XLmgfphis-PGK1-URA3-PDR5 下游） 碎片。如果需要，可以通过入门设计将突变（黑线）引入ORF。指示 PDR5 点正确集成的同源重组事件由交叉冲线指示。（D） 可用于真菌多药排泄泵功能特征的全细胞检测。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:与 CDR1-mGFPHis 转换盒的AD+转换和消除娇小的AD+-CDR1-mGFPHis变压器。 在CSM-URA板上孵育转化的AD+细胞，在30°C下孵育出乌拉西原营养素转化剂，为期3天。（A） 负控制（无DNA）。（B） 正控制（10 ng pYES2）。（C） CDR1-mGFPHis 变压剂 （1 微克脱氧核糖核酸）。（D） 在 YPG 附板上测试 AD+-CDR1-mGFPHis 变压剂，以检测娇小的表型。由于线粒体有缺陷而无法生长在 YPG 琼脂板上的娇小变压器被黄色包围。 请单击此处查看此图的较大版本。

GFP 荧光是 Cdr1 表达水平的可靠测量标准，因为 Cdr1-mGFPHis （步骤 3.3.9） 和凝胶荧光信号 （图 3A）之间存在线性关系。在该项目中，为快速生成用于血浆膜蛋白生化特性的优质小尺度等离子膜制剂开发了可重复的优化工作流程。可产生近0.5毫克等离子膜蛋白（图3C:左图），显示最高的Cdr1 ATPase活性（+400 nmol/min/mg:图3C:右图）当打破40ODU的对数相（OD600nm的1-3）细胞（以0.5mL的HB重新悬浮）与相同的体积（即0.5兆L）的硅珠和6周期的漩涡1分钟的最大震动强度，然后3分钟的冰上冷却期。破损周期数的进一步增加（第 3.3.3 步）降低了分离等离子膜制备的质量（Cdr1 ATPase 活性从 170 nmol/min/mg 降至 +60 nmol/min/mg;未显示数据）。虽然从断裂周期较多的细胞中分离出来的血浆膜样本的SDS-PAGE蛋白模式仅略有差异（数据未显示），但10个或更多断裂周期后Cdr1 ATPase活动减少近3倍的原因可能是:（一） Cdr1因暴露在高温下而部分变性:ii） 转化后修改，如磷酸化或脱磷剂:或由 iii） 增加分离的等离子体膜囊泡与其他细胞器的膜分数交叉污染。在 0.5 mL 的 HB 中打破 40 个 ODU 的细胞产生了最高质量的等离子体膜（即每 10 μg 的血浆膜蛋白质中 Cdr1 最多;图3B）具有最高的 Cdr1 ATPase 活动 （图 3C;右图） 。较高的（>40 ODU/0.5 mL的HB）或更低（20 ODU/0.5mL的HB）细胞密度降低了分离等离子膜的ATPase活性（图3C:右图），虽然，它们的产量增加的比例增加细胞密度（图3C:左图）。因此，40 ODU/0.5 mL 的 HB 是隔离血浆膜最高质量的最佳细胞密度。因此，使用优化的协议进行等离子膜制剂的小规模隔离，使Cdr1特定ATPase活动（+300 nmol/min/mg）高2-3倍:图3C:右图）与最初获得的 Cdr1 特定 ATPase 活动（+100 nmol/min/mg;未显示的数据）相比。这些ATPase活动也明显高于任何先前报告的Cdr1 ATPase活动（100-200 nmol/min/mg），这些活动是通过更劳动密集型和耗时的大型等离子膜制备协议14，41，60获得的。

从生物膜中提取膜蛋白的最常见方法是用洗涤剂溶解。然而，挑战在于找到一种合适的洗涤剂，对蛋白质稳定性和/或折叠特性最小有害。用 mGFPHis 标记蛋白质有助于筛选，以选择最佳洗涤剂用于蛋白质提取。材料表中总共列出了31种洗涤剂，它们具有各种特性，测试了它们从S.Cerevisiae AD+-CDR1-mGFPHis细胞的粗等离子膜中溶化Cdr1的能力。一组具有代表性的16种测试洗涤剂（A-Q）的结果显示在图3D中。通道 T、P 和 S 包含洗涤剂溶解（步骤 6.2）和洗涤剂不溶颗粒（P: 在GTED-20的0.5mL，2%SDS;步骤6.5）和洗涤剂可溶性超高纳坦（S:步骤6.4）分后，通过超精压分离在141，000克。所需的洗涤剂应尽可能使Cdr1-mGFPHis溶化，而不改变其结构和/或功能。粗等离子体膜蛋白（5毫克/兆升）溶解2小时，1%（w/v）洗涤剂（T）和可溶性（P）分馏分的溶性（P）成分由SDS-PAGE（图3D）分析，随后还通过荧光检测尺寸排除色谱（FSEC）58（图4）进行分析。我们确定，Cdr1 的高效溶化需要 2:1 （w/w） 的最低洗涤剂与蛋白质比率。事实上，为了确定Cdr1-mGFPHis溶化所需的最佳洗涤剂（DDM）浓度，对洗涤剂（x CMC）的关键小鼠浓度和洗涤剂/膜蛋白比（w/w）进行了调查。使用DDM的固定浓度为10倍或80倍的CMC时，观察到Cdr1-mGFPHis的溶液效率存在巨大差异。溶解效率在 40% 到 80% 之间，或 60% 到 90% 之间，具体取决于各种溶解实验中使用的粗等离子膜的数量。然而，选择洗涤剂与蛋白质的比例为≥2（w/w），无论使用多少血浆膜蛋白，都取得了可重复的好结果，>85%的Cdr1-mGFPHis被溶化。因此，如果使用更常见的方法，简单地选择1%或2%（w/v）洗涤剂来使Cdr1-mGFPHis等膜蛋白溶化，则保持洗涤剂与蛋白质的比例高于2（w/w）是很重要的[即，使用1%（即10毫克/毫升）洗涤剂时，将血浆膜蛋白浓度保持在5毫克/mL以下]。

图3:Cdr1-mGFPHis表达水平的量化，小规模等离子膜隔离协议的优化，Cdr1-mGFPHis的洗涤剂屏幕。左侧显示相同 0.7% 聚丙烯酰胺凝胶的库马西染色和凝胶内荧光 SDS-PAGE 图像。车道 1 到 6 装载了 0.75、1.5、3、6、12 和 24 μg 的 AD+-CDR1-mGFPHis 等离子体膜蛋白。Cdr1-mGFPHis 用红色箭头表示。M = 精密加蛋白质标记。mGFP 荧光强度（右图所示）在整个浓度范围内是线性的，并且背景荧光极小。（B） 细胞密度在破裂时对分离等离子膜质量的影响。库马西染色聚丙烯酰胺凝胶 （7%） 的等离子膜蛋白质样品 （10 μg） 和绿色荧光信号的 Cdr1 - mgfphis 的同一凝胶之前库马西染色。M = 精密加蛋白质标记。车道1、3、5和7是AD+的等离子膜蛋白，2、4、6和8号通道是AD+-CDR1-mGFPHis的等离子膜蛋白，分别从20、40、60和80ODU细胞中分离出来。Cdr1-mGFPHis 用红色箭头表示。下面列出了绿色荧光信号的相对百分比。（C） 细胞密度在断裂时对分离等离子体膜的产量和Cdr1-mGFPHis的ATPase活性的影响。在左侧，细胞密度（ODU/0.5 mL HB）对从AD+和AD+-CDR1-mGFPHis（Cdr1）细胞中分离的血浆膜蛋白量的影响。在右侧，细胞密度对从AD+-CDR1-mGFPHis细胞中分离出来的等离子体膜Cdr1 ATPase活性的影响。（D） 溶液混合物 （T: 0.5 mL） 的 10 微升的样板 SDS-PAGE，溶液后颗粒 （P: 0.5 mL），以及AD+-CDR1-mGFPHis（顶部）和Cdr1-mGFPHis的凝胶内荧光（S;0.5 mL）的洗涤剂溶液粗等离子膜蛋白（顶部）和凝胶内荧光，在库马西染色同一凝胶（底部）之前。M = 宽MW预染色蛋白梯（245、180、135、100、75、63和48kDa波段;180 kDa和75 kDa频段分别用红色和绿色箭头表示）。车道 A 到 L 和 N 到 Q 是 T， S， 和 P 分数 DM （A）， β - ddm （B）， α - ddm （C）， Tdm （D）， Lmng （E）， Ogng （F）， Og （G）， LDAO （H）， 赫加 （I）， 梅加 （J）， 特里顿 - x100 （K）， 查普斯 （L）， Nm （N）， 特温 80 （O）， 福斯 - 乔林 - 13 （P） 和 Sds （Q）， 分别。缩写在材料表中定义。请单击此处查看此图的较大版本。

根据洗涤剂筛选结果（图3D）、DDM（B和C）和福斯-巧克力-13（P）似乎是Cdr1-mGFPHis溶化的最佳洗涤剂。然而，使用福斯-胆碱-13似乎导致Cdr1-mGFPHis（图3D中的P）的部分蛋白解。LMNG （E）、PCC-α-M（未显示）和可能还有 DM （A） 是下一个最好的洗涤剂。洗涤剂屏幕还显示，葡萄糖苷OGNG（F）和OG（G）、CHAPS（L）、NM（N）和安泽根（未显示）是Cdr1-mGFPHis溶解的不良选择，因为大量蛋白质存在于不溶性颗粒分数中（图3D）。SDS 标号 Cdr1-XLmGFPHis，这就是为什么在 Q 车道上看不到绿色荧光信号（图3D）。

FSEC 还评估了洗涤剂溶解血浆膜蛋白（步骤 6.4 超高）是否适合适当折叠的原生 Cdr1-mGFPHis 颗粒的溶解性。图4中显示了从AD+-CDR1-mGFPHis（2毫克/mL）溶解1%洗涤剂中获得的100微升粗等离子膜蛋白的色谱图示例。9 mL 的峰值以 15.5 mGFPHis 表示在空隙体积中偏出的聚合 Cdr1-mGFPHis，而正确溶化和正确折叠的 Cdr1-mGFPHis 粒子则以高斯形状的峰值表示，其速度为 15.5 mL。12 至 14 mL 的宽肩脱粒体积可能含有定义较差的 Cdr1-mGFPHis 鼠颗粒和/或指示部分误折叠或蛋白质聚合。麦芽糖和LMNG提取蛋白质的色谱图显示，大多数Cdr1-mGFPHis在15.5 mL处作为形状良好的高斯峰，在14mL（图4A）稍早的肩部松去。这些样品在空量中没有Cdr1-mGFPHis。空白示例是缓冲器加 DDM 控制，不提供 mGFP 信号。图4B中的色谱图突出了糖头组类型对洗涤剂溶解Cdr1-mGFPHis颗粒质量的重要性。含洗涤剂的葡萄糖（OG、NG、OGNG）的表现比含有洗涤剂的蔗糖（DDS）差，而含有洗涤剂的麦芽糖（NM、DMNG、DDM）的表现则更差。Cdr1-mGFPHis 溶解与含葡萄糖的洗涤剂，作为聚合 （OG） 或宽聚合峰值 （NG， OGNG）， 这是预期从 Cdr1-mGFPHis 沉淀在 OGNG （F） 和 OG （G） 在图 3D观察到的颗粒分数的很大比例。虽然 DMNG 色谱图（绿色;图4B）在质量上类似于DDM色谱图（蓝色;图4B），DDM较高的峰值表明，DMNG溶化Cdr1-mGFPHis的很大一部分实际上可能已变性。图4C显示了Zwitterionic福斯-胆碱（福斯-胆碱-8，福斯-巧克力-10）的FSEC色谱， Fos-choline-13）和两种非离子洗涤剂（数字素、Triton-X100）和图4D显示，装载量是福斯-巧克力-8、-10和-13和DDM染色体质量的两倍（200微升）。只有数字素（橙色;图4C）给一个类似的色度图DDM（蓝色;图4C）而且，虽然Fos-choline-13给出了一个对称的锐利形状的峰值，但它的出路体积（14 mL）再次明显低于DDM（15.5 mL）。总体而言，具有12或13碳残留的长非沥青侧链的洗涤剂的溶解性明显提高:例如，DDM > DM > NM（12、10 或 9 碳）、福斯胆碱-13 > 10 > 8（13、10 或 8 碳））和 LMNG > DMNG > OGNG（12、10 或 8 碳）。因此，与具有 12 或 13 碳的较长疏水尾部的洗涤剂相比，具有小于 12 碳的疏水尾部的洗涤剂更不适合 Cdr1-mGFPHis 的溶解剂， 和非离子洗涤剂（DDM，LMNG）似乎一般更适合溶解Cdr1-mGFPHis比zwitterion洗涤剂（图3D，图4）。

图4:使用FSEC对Cdr1-mGFPHis溶解剂进行洗涤剂筛选。 100 微升溶解 AD+-CDR1-mGFPHis 粗浆膜（2 毫克/mL）的色谱图，使用 Superose 6 增加 10/300 GL 尺寸排除列指示和分离 1% 的洗涤剂。色谱图描绘了收集的放射缓冲器的一列体积 （CV; 25 mL） 的相对 mGFP 荧光单元 （FU）。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可透露的。