从胚胎发育到退变的椎间盘光学切片与可视化

摘要

我们介绍一种利用光学切片方法研究椎间盘纤维环中软骨细胞空间排列的方法。

摘要

椎间盘（IVD）退变是导致下腰痛的主要原因，对患者造成严重的功能障碍。要解析椎间盘退变机制并开发再生治疗策略，必须深入理解椎间盘的细胞生物学特性。其中，细胞在生理状态及退变过程中如何空间排布，仍是尚未解决的关键问题之一。由于椎间盘具有特殊的生物学特性且组织获取困难，使其分析极具挑战性。本研究探讨了纤维环中软骨细胞从早期胚胎发育到终末期退变过程中的空间组织规律。采用光学切片技术（Apotome），以牛胚胎组织作为动物模型，并结合接受脊柱手术的患者所获取的人椎间盘组织，进行高分辨率染色分析。在牛胚胎椎间盘中，软骨细胞初始密度极高，随着妊娠、生长和成熟过程，细胞数量逐渐减少；而在人椎间盘中，细胞密度则随着组织退变的进展而增加。与关节软骨中已观察到的现象类似，细胞簇的形成是晚期椎间盘退变的典型特征。

引言

椎间盘（IVD）是一种以软骨为基础的结构，其生化特性及细胞结构在初看之下，许多方面都与关节软骨相似¹。事实上，椎间盘退变和关节软骨的骨关节炎（OA）均表现为因软骨磨损导致的关节间隙变窄、软骨下囊肿和骨赘形成，以及软骨下硬化^2,3。尽管两者在表观上具有相似性，但其组织结构和功能角色却存在差异。关节软骨的基质主要由呈弓形排列的II型胶原网络构成，而椎间盘则由三种不同类型的组织组成：中央富含II型胶原的髓核承受轴向负荷，并将其传递至周围由致密排列的环状I型胶原纤维构成的纤维环。纤维环的功能是利用其纵向纤维的抗张强度，吸收由富含蛋白聚糖和水的髓核所传递的轴向压力。在每个髓核和纤维环的上下方，透明软骨终板则构成其与相邻椎体的连接结构⁴（图1）。

在关节软骨中，可观察到四种不同的空间软骨细胞排列模式：成对排列、单列、双列以及小簇或大簇^5,6,7（图2）。这种排列模式的改变与骨关节炎（OA）的发生和发展相关^8,9。软骨细胞的空间组织还反映了软骨的一种直接功能特性，即其刚度，这凸显了基于图像分级方法的功能相关性^10,11。这些模式还可通过临床上已有的技术进行识别¹²。由于椎间盘（IVD）与关节软骨之间存在相似性，可以推测IVD中也存在特征性的软骨细胞排列模式。细胞簇的形成也是在退变的IVD中观察到的现象^13,14。

在尝试分析椎间盘（IVD）中细胞的空间组织时，必须克服一些技术上的困难，而这些困难在研究关节软骨时并不存在：

首先，与主要由II型胶原组成的均质透明软骨相比，椎间盘组织本身的处理要困难得多。椎间盘的主要纤维成分为I型胶原，这使其更难以制备出薄的组织学切片。在透明关节软骨中，由于组织具有"玻璃样"特性，即使较厚的切片也易于分析；而椎间盘的I型胶原网络在光学上具有高度不透性。因此，强背景噪声是椎间盘组织学中常见的问题。一种快速且经济的方法是使用光学切片装置，例如Apotome系统。在这种Apotome系统中，一个网格被插入到传统荧光显微镜的照明光路中。在网格前方放置一块平面平行玻璃片，该玻璃片来回倾斜，从而将网格投影到图像中的三个不同位置。对于每个z轴位置，生成并叠加三幅带有投影网格的原始图像。通过专用软件，可以计算并去除离焦光线。其基本原理是：如果网格可见，则该信息处于焦内；否则被视为离焦。利用该技术，可在合理的时间内获得清晰聚焦且高分辨率的图像。

其次，来自人类供体的组织难以获取。在进行全膝关节置换术时，手术过程中可获得关节的整个表面用于进一步分析。尽管双动关节的骨关节炎也是一种全关节疾病，但软骨质量仍存在明显的局灶性差异，通常关节的某些区域仍然保持完整，例如由于该区域负荷减轻所致。这种情况在椎间盘（IVD）中有所不同，椎间盘手术通常仅在椎间盘整体已遭破坏时才进行。从手术室获取的人体供体组织通常高度碎片化，在进行进一步分析前，必须将组织正确归类为椎间盘三种软骨类型中的一种。为了能够对较大组织切片进行更详细的分析，并研究椎间盘的胚胎发育过程，因此有必要选择一种动物模型生物。

在选择此类模式生物时，重要的是要具备一种在解剖结构和尺寸、机械负荷、细胞群体以及组织构成方面均与人类椎间盘具有可比性的系统。针对本研究所介绍的技术，我们建议使用牛腰椎间盘组织：人类椎间盘的一个关键特性是在成熟过程中髓核内脊索细胞的丢失，这导致其再生能力较低。然而，在许多模式生物中，脊索细胞可终生存在。少数会丢失脊索细胞的动物（如绵羊、山羊或软骨营养不良犬）其椎间盘（IVD）明显小于人类椎间盘。只有牛的腰椎间盘在矢状径上与人类椎间盘具有可比性¹⁵。

导致椎间盘早期退变的一个关键因素是过度的机械负荷。站立状态下牛腰椎椎间盘内的压力约为0.8 MPa，此时脊柱呈水平排列。令人惊讶的是，这些压力值与直立人类腰椎椎间盘内压力（0.5 MPa）相当^15,16。此外，牛椎间盘中的水分和蛋白聚糖含量也与年轻人的椎间盘（IVD）相似¹⁷。因此，尽管四足动物运动节段的实际运动模式可能与两足行走的人类有所不同，但在总体负荷和椎间盘特性方面，牛比其他常用的椎间盘动物模型（如绵羊和狗）更接近人类生物学特征。

在本实验方案中，我们介绍了一种技术，用于从早期胚胎发育到终末期退变的整个过程中，分析椎间盘（IVD）软骨细胞空间组织结构变化的方法。

方案

为了分析胚胎发育和成熟过程，使用了牛的椎间盘。为了评估椎间盘（IVD）的退变，分析了人类样本。

人类椎间盘组织取自于图宾根大学医院骨科手术部及图宾根BG创伤中心因腰椎间盘退变、椎间盘突出或脊柱创伤而接受手术的患者。研究开始前已获得完整的伦理委员会批准（项目编号：244/2013BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。所有方法均按照批准的指南进行。

牛组织样本来自巴伐利亚州卫生与食品安全局/上施莱斯海姆以及德国瓦尔特豪森的一家动物副产品加工工厂。已获得当地及兽医主管部门关于使用死亡动物组织的批准。

1. 样品采集

1. 人椎间盘组织：术中获取的椎间盘样本应立即置于含2% (v/v) 青霉素-链霉素和1.2% (v/v) 两性霉素B的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。4 °C保存，待后续处理。组织应在48小时内处理完毕。或者，可将组织在-20 °C保存数周。
2. 牛椎间盘组织：确保在动物死亡后24小时内获取组织。
   将死亡动物的椎间盘连同周围椎体整体完整切除。将组织冷冻后置于干冰上运输，并在-20 °C保存，待后续处理。
   ​注意：如果仅计划进行荧光分析，且不进行ELISA或PCR等其他生化定量方法，则按以下说明进行组织固定。此步骤可使组织在需要处理前更长时间保存。为防止组织基质退化，若组织未立即冷冻，则应在取材后48小时内完成固定。

2. 样品制备

1. 在室温下解冻冷冻组织。当用手轻轻按压组织时已感觉不到冰晶时，立即进行组织处理。
   注意：在培养皿中使用DMEM进行组织制备。
2. 根据胶原密度和排列方向等宏观特性，确定人椎间盘（IVD）组织的来源部位（纤维环、中间区、髓核或软骨终板）。
3. 取包含牛椎间盘及其相邻两个椎体的运动节段，使用手术刀（15号刀片）从软骨下骨整体剥离椎间盘。
   1. 使用两把解剖镊子翻转椎间盘，以便更好地接触中心区域。进行解剖操作时，应最后切除髓核，因为髓核比纤维环更薄、易撕裂，且不易以完整形态分离。
   2. 识别软骨的不同区域。
   3. 使用手术刀（20号或22号刀片）从整个椎间盘中切取目标区域。也可选用冷冻切片机刀片。
      注意：由于牛椎间盘通常作为脊柱的一部分整块获取，因此可进行整体处理，这有助于更准确地识别不同类型的软骨。按照上述方式解剖时，软骨终板将保留在椎体上。若需研究该区域，最好使用凿子沿略弯曲的切线方向将其从下方骨组织上分离下来。
4. 若胚胎的顶臀长小于20 cm，应整体处理胚胎，以保持椎间盘组织的结构完整性。此种情况下不得对椎体进行任何解剖分离。
5. 当椎间盘已整体切除后，识别软骨的不同区域。
   1. 在室温下使用乙二胺四乙酸（EDTA）（20% (w/v)；pH = 7.4）进行脱钙处理。根据样本大小选择适当体积，确保整个组织完全浸没于EDTA中。
   2. 每日更换脱钙液，处理时间最长可达5天，具体取决于组织大小。
   3. 使用20号针头检测脱钙效果，若针头可无明显阻力地刺入椎体，则表明脱钙成功。
      注意：每日更换脱钙液至关重要，可防止螯合剂EDTA饱和，从而维持反应效率，同时避免细菌定植。

3. 样本年龄、完整性和退变程度的分级

1. 根据临床信息以及X射线和磁共振成像¹⁸（图3），将人椎间盘组织分为以下五类之一。
   注：I类：使用来自急性脊柱创伤、无椎间盘退变影像学征象的纤维环组织作为接近健康的样本。
   II类：使用病程少于4周、具有临床症状患者的中间区域组织，以说明急性炎症伴早期退变的情况。
   III类：使用因髓核脱出接受手术、但症状持续时间超过4周的患者组织，以描述炎症反应已有时间影响组织和细胞的情况。
   IV类：对于中度椎间盘退变，选择因退行性椎间盘疾病接受椎体间融合术时获取的纤维环组织，且磁共振成像Pfirrmann评分为3或4分¹⁹。
   V类：对于终末期退变过程，选择因退行性椎间盘疾病接受椎体间融合术时获取的纤维环组织，且磁共振成像Pfirrmann评分为5分。
2. 根据动物的发育阶段/年龄将牛组织分为八个类别之一，如表1所示。
   1. 根据Keller提出的公式，依据胚胎顶臀长计算妊娠年龄：
      妊娠年龄（月）=
      ​注：妊娠前4周的动物顶臀长为0.8–2.2 cm²⁰。

4. 组织固定

1. 在4 °C条件下，用样品体积10倍的4%（w/v）甲醛溶液（溶于磷酸盐缓冲液，PBS）过夜固定样品。
   注意：甲醛溶液从各个方向渗透组织的速度约为1 mm/小时。对于非常小或非常大的样品，可能需要调整固定时间。
2. 将组织保存在4 °C的PBS中，直至后续处理。

5. 组织学切片

1. 将样本包埋于冷冻切片机旋钮上的水溶性包埋介质中。
   1. 将组织放置在旋钮上，使其形成轴向切面，或垂直于I型胶原片层的切面（例如正中矢状切面）。
      注意：组织必须完全被包埋介质覆盖。
2. 使用标准冷冻切片机对包埋的组织进行切片，人源样本切片厚度为 70 µm，牛源样本切片厚度为 40 µm。
   注意：切片厚度的差异是由于完整的牛椎间盘组织与高度退变的人组织在结构完整性上的不同所致。
3. 将切片收集到玻璃载玻片上。
   1. 使用疏水笔在组织切片周围画圈。
   2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗切片 3 次，以去除水溶性包埋介质。

6. 荧光染色

1. 在 PBS 中加入 60 µL 的 1% (v/v) DAPI（最大激发波长 358 nm，最大发射波长 461 nm）以及 1% (v/v) 肌动蛋白追踪染色剂（Actin Tracking staining，最大激发波长 540 nm，最大发射波长 565 nm），室温孵育 5 分钟。
   注意：此处描述的染色方案旨在利用 DAPI 核染色（蓝色）显示细胞核，利用肌动蛋白追踪染色（红色）显示细胞质。由于胶原纤维的存在，椎间盘组织在绿色荧光通道具有较强的自发荧光。本方案中添加至切片的液体体积适用于约 5 mm × 5 mm 大小的切片；对于更大的切片，需相应增加液体用量。所有操作应在无直射日光且光线昏暗的环境中进行，以防止染料褪色。
2. 用移液器移除染色液，并每次使用 60 µL PBS 洗涤三次。
3. 加入适量封片介质，并用盖玻片覆盖切片。
   ​注意：加盖盖玻片时应确保无气泡残留。最佳操作方式是先将盖玻片一端接触载玻片边缘，再缓慢放下盖玻片，使其自然覆盖。

7. 显微成像与图像处理

1. 将带有染色切片的载玻片放置在显微镜的样品台上。
   注意：由于椎间盘（IVD）中致密的I型胶原网络，散射光使得组织在常规荧光显微镜下难以观察。解决此问题的一种方法是采用结构光照明显微技术进行光学切片。该方法还可实现对整个样本在两个通道（蓝色和红色）中的三维投影。建议使用结构照明模式，并结合10倍物镜的Mosaic模式，以获得样本的整体概览以及个别结构的三维重建图像。
2. 启动结构照明设备。
   1. 使用合适的荧光显微镜、荧光滤光片和适当的照明条件，进行单视野成像。
      注意：调整所有所用滤光片的曝光时间，以标准化图像采集过程。为获得更高分辨率下样本的真实表征，可使用更高倍率的物镜（例如20倍）对切片进行成像。
   2. 使用与荧光显微镜兼容的图像优化软件，对图像进行后期处理，优化其强度和亮度。
3. 为整体观察切片，使用马赛克成像技术
   1. 从工具栏面板中打开采集设置（点击 6D-采集）。
   2. 调整马赛克设置（在 MosaiX Register 中），定义将用于拼接成一幅整体概览图像的视野图像的行列数量。
   3. 点击 设置 ，并调整各个图像瓦片的焦点校正。
      注意：对于较大的组织切片，几乎不可能使整个组织表面处于同一焦平面上。可通过“MosaiX采集”功能在不同焦平面获取图像瓦片。
   4. 要开始图像瓦片的采集，请点击 开始。
   5. 使用软件内置的拼接功能（拼接 按钮），以20%的重叠率对采集的图像瓦片进行拼接。
   6. 使用与荧光显微镜兼容的图像优化软件，对图像进行后期处理，优化其强度和亮度。
4. 为分析软骨细胞的空间组织结构，使用软件中集成的3D功能。
   1. 调整z轴堆栈设置。定义扫描参数：通过激活 开始/停止 按钮，设定z轴的起始和终止位置以及切片间距。
      注意：软件将自动计算切片数量。
   2. 要开始z轴图像堆栈的采集，请点击 开始。
   3. 使用与荧光显微镜兼容的图像优化软件，对图像进行后期处理，优化其强度和亮度。
5. 以与图像处理软件兼容的文件格式导出图像。
   ​注意：可将3D重建结果导出为单独的图像文件，和/或导出为交互式3D模型，或以视频格式保存。

8. 细胞模式识别与密度评估

1. 在合适的图像处理程序中打开整个组织切片的导出拼接图像。
2. 通过在图像中定义 500 µm × 500 µm 的感兴趣区域，确定用于细胞密度评估的区域。
   注意：所有图像质量不达标的图块均应排除在分析之外。
3. 识别单个细胞形态。
   注意：单个细胞定义为完全被周围基质包绕的独立细胞；成对细胞定义为两个相邻且彼此靠近（<25 µm）的细胞，其通过各自的基质相互连接（见图2）；串状结构定义为至少三个软骨细胞呈线性排列（从细胞核中心起 <25 µm），这些细胞被完整的基质包绕，且各细胞之间可见基质连接；细胞簇则指多个细胞彼此直接相邻（<25 µm），并共同包埋于一个缺乏基质的大陷窝中。
4. 使用细胞计数插件对细胞形态进行定量分析。
   注意：细胞质染色可作为验证方法，用于识别不同的空间分布模式。
5. 通过将计数所得的细胞数除以所选感兴趣区域的面积，计算细胞密度。

结果

通过镶嵌图像，可以清晰地识别椎间盘（IVD）的结构，其中纤维环内致密的胶原纤维网络与较柔软的髓核形成对比（图4）。在胚胎发育过程中，细胞密度呈持续下降趋势（图5）。在椎间盘发育早期，牛纤维环中的细胞密度为11,435个细胞/mm²，牛髓核中为17,426个细胞/mm²；而至出生时，这些数值迅速下降至1,011个细胞/mm²（牛纤维环）和488个细胞/mm²（牛髓核）。在成年牛中，观察到的细胞密度分别为71个细胞/mm²（纤维环）和106个细胞/mm²（髓核）（图6 A-B）。利用Apotome进行双通道成像，可实现对空间结构三维构型的可视化（图7）。

讨论

通过结合镶嵌成像和光学切片技术的荧光显微镜，我们评估了腰椎椎间盘纤维环在发育、成熟及退变过程中软骨细胞的空间分布。虽然退变组织可从因椎间盘退变接受脊柱手术的患者中获取，但对胚胎期和成熟阶段的分析则需使用模式生物（牛）。在胚胎早期发育阶段，纤维环中表现出较高的细胞密度。随着发育的进一步进行，在出生后生长和成熟过程中，细胞密度显著下降。在人类严重退变的椎间盘组织中，我们则定量观察到纤维环细胞密度的增加。

组织体积的快速增加，以及活跃分裂和具有生物合成活性的脊索细胞，可能是胚胎中观察到的细胞密度变化的可能原因²⁵。然而，细胞密度在退变过程中再次增加的机制仍尚不明确。纤维环的退行性过程导致一系列病理改变，包括组织神经支配增加和炎症反应、基质降解酶和生长因子表达上调，以及细胞数量的变化^26,27,28。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	默克股份公司  德国	A2942
SuperFrost Plus 黏附显微镜载玻片	R. Langenbrinck，德国	03-0060
ApoTome	卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国	462000115
AxioVision Rel. 4.8 配备 MosaiX 模块	卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国
CellMask 肌动蛋白示踪染料	赛默飞世尔科技公司，美国	A57249
冷冻切片机	Leica Biosystems，美国	CM3050S
DAPI	赛默飞世尔科技公司，美国	D1306
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco，Life Technologies，德国	41966052
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich，美国	60004
荧光显微镜 - Axio Observer Z1 配备 Axio Cam MR3 和 Colibri	卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国	3834000604
甲醛	默克股份公司  德国	104002
Image J 1.53a，配备 Cell counter 插件	美国国立卫生研究院（NIH）
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	赛默飞世尔科技公司，美国	A12380
显微镜盖玻片	R. Langenbrinck，德国	01-1818/1
PAP笔液体阻断剂	科学服务  德国GmbH	N71310
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich，美国	P4333
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich，美国	P5119
手术刀	pf医疗股份公司，德国	2023-01
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek，荷兰	SA6255012