我们介绍一种利用光学切片方法研究椎间盘纤维环中软骨细胞空间排列的方法。
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本文内容
摘要
摘要
椎间盘（IVD）退变是导致下腰痛的主要原因，对患者造成严重的功能障碍。要解析椎间盘退变机制并开发再生治疗策略，必须深入理解椎间盘的细胞生物学特性。其中，细胞在生理状态及退变过程中如何空间排布，仍是尚未解决的关键问题之一。由于椎间盘具有特殊的生物学特性且组织获取困难，使其分析极具挑战性。本研究探讨了纤维环中软骨细胞从早期胚胎发育到终末期退变过程中的空间组织规律。采用光学切片技术（Apotome），以牛胚胎组织作为动物模型，并结合接受脊柱手术的患者所获取的人椎间盘组织，进行高分辨率染色分析。在牛胚胎椎间盘中，软骨细胞初始密度极高，随着妊娠、生长和成熟过程，细胞数量逐渐减少；而在人椎间盘中，细胞密度则随着组织退变的进展而增加。与关节软骨中已观察到的现象类似，细胞簇的形成是晚期椎间盘退变的典型特征。
引言
椎间盘（IVD）是一种以软骨为基础的结构，其生化特性及细胞结构在初看之下，许多方面都与关节软骨相似1。事实上，椎间盘退变和关节软骨的骨关节炎（OA）均表现为因软骨磨损导致的关节间隙变窄、软骨下囊肿和骨赘形成，以及软骨下硬化2,3。尽管两者在表观上具有相似性，但其组织结构和功能角色却存在差异。关节软骨的基质主要由呈弓形排列的II型胶原网络构成，而椎间盘则由三种不同类型的组织组成：中央富含II型胶原的髓核承受轴向负荷，并将其传递至周围由致密排列的环状I型胶原纤维构成的纤维环。纤维环的功能是利用其纵向纤维的抗张强度，吸收由富含蛋白聚糖和水的髓核所传递的轴向压力。在每个髓核和纤维环的上下方，透明软骨终板则构成其与相邻椎体的连接结构4（图1）。
在关节软骨中，可观察到四种不同的空间软骨细胞排列模式：成对排列、单列、双列以及小簇或大簇5,6,7（图2）。这种排列模式的改变与骨....
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方案
为了分析胚胎发育和成熟过程，使用了牛的椎间盘。为了评估椎间盘退变，分析了人类样本。
人椎间盘（IVD）组织来自在蒂宾根大学医院骨科和蒂宾根BG创伤中心接受腰椎间盘退变、椎间盘突出或脊柱创伤手术的患者。研究开始前已获得伦理委员会的完全批准（项目编号 244/2013BO2）。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。所有方法均按照批准的指南进行。
牛组织样本来自巴伐利亚州卫生与食品安全局/上施莱斯海姆以及德国瓦尔特豪森的一家动物副产品加工工厂。已获得当地及兽医主管部门对死亡动物组织使用的批准。
1. 样本采集
- 人椎间盘组织：术中获取的椎间盘样本应立即置于含2% (v/v) 青霉素-链霉素和1.2% (v/v) 两性霉素B的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。4 °C保存，待后续处理。组织应在48小时内处理完毕。或者，可将组织在-20 °C保存数周。
- 牛椎间盘组织：确保在动物死亡后24小时内获取组织。
将死亡动物的椎间盘连同周围椎体整体切除。将组织冷冻后置于干冰上运输，并在-20 °C保存至后续处理。
注：如果仅计划进行荧光分析，且不进行ELISA或PCR等其他生化定量方法，则按以下说明进行组织固定。此步骤可使组织在需要处理前更长时间保存。为防止组织基质退化，若组织未立即冷冻，则应在取材后48小时内完成....
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结果
利用镶嵌图像，可以清晰地观察到椎间盘的结构，其纤维环内致密的胶原纤维网络以及较柔软的髓核均清晰可辨（图4）。在胚胎发育过程中，可观察到细胞密度持续下降（图5）。在牛椎间盘发育早期，纤维环中的细胞密度为11,435个细胞/mm²，髓核中为17,426个细胞/mm²，但这些数值在出生前迅速下降至纤维环1,011个细胞/mm²和髓核488个细胞/mm²。在成年牛中，纤维环的细胞密度为71个细胞/mm²，髓核为106个细胞/mm²。图6 A-B). 使用Apotome进行双通道成像可实现对空间分布三维结构的可视化图7).
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讨论
通过结合镶嵌成像和光学切片技术的荧光显微镜，我们评估了腰椎椎间盘纤维环在发育、成熟及退变过程中软骨细胞的空间分布。虽然退变组织可从因椎间盘退变接受脊柱手术的患者中获取，但对胚胎期和成熟阶段的分析则需使用模式生物（牛）。在胚胎早期发育阶段，纤维环中表现出较高的细胞密度。随着发育的进一步进行，在出生后生长和成熟过程中，细胞密度显著下降。在人类严重退变的椎间盘组织中，我们则定量观察到纤维环细胞密度的增加。
组织体积的快速增加，以及活跃分裂和具有生物合成活性的脊索细胞，可能是胚胎中观察到的细胞密度变化的可能原因25。然而，细胞密度在退变过程中再次增加的机制仍尚不明确。纤维环的退行性过程导致一系列病理改变，包括组织神经支配增加和炎症反应、基质降解酶和生长因子表达上调，以及细胞数量的变化26,27,28。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢原始出版物的共同作者提供的帮助与支持。我们感谢 Charlotte Emma Bamberger 协助获取阿波托姆图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 两性霉素B | 默克股份公司 德国 | A2942 | |
| SuperFrost Plus 黏附显微镜载玻片 | R. Langenbrinck，德国 | 03-0060 | |
| ApoTome | 卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国 | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 配备 MosaiX 模块 | 卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国 | ||
| CellMask 肌动蛋白示踪染料 | 赛默飞世尔科技公司，美国 | A57249 | |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems，美国 | CM3050S | |
| DAPI | 赛默飞世尔科技公司，美国 | D1306 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco，Life Technologies，德国 | 41966052 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich，美国 | 60004 | |
| 荧光显微镜 - Axio Observer Z1 配备 Axio Cam MR3 和 Colibri | 卡尔·蔡司显微成像有限公司，德国 | 3834000604 | |
| 甲醛 | 默克股份公司 德国 | 104002 | |
| Image J 1.53a，配备 Cell counter 插件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | 赛默飞世尔科技公司，美国 | A12380 | |
| 显微镜盖玻片 | R. Langenbrinck，德国 | 01-1818/1 | |
| PAP笔液体阻断剂 | 科学服务 德国GmbH | N71310 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich，美国 | P4333 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich，美国 | P5119 | |
| 手术刀 | pf医疗股份公司，德国 | 2023-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek，荷兰 | SA6255012 |
参考文献
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....
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重印与许可
