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方法文章

大鼠静息态功能磁共振成像数据的采集

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DOI：

10.3791/62596

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2021年8月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Geisel School of Medicine at Dartmouth, 3National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health, 4University of Guelph

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种使用低剂量异氟烷联合低剂量右美托咪定获取大鼠稳定静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）数据的方法。

摘要

静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）已成为研究大脑在静息、无任务状态下功能活动的一种日益流行的方法。本方案描述了一种用于获取静息态fMRI数据的临床前存活实验方法。通过联合使用低剂量异氟烷与持续输注α2肾上腺素受体激动剂右美托咪定，可在保持脑网络功能完整性的同时，实现稳定且高质量的数据采集。此外，该方法允许大鼠自主呼吸，并维持接近正常的生理状态。在本方法基础上，可将其他成像序列与静息态扫描相结合，构建麻醉状态稳定长达5小时的实验方案。本方案详细介绍了设备设置、大鼠在麻醉四个不同阶段的生理监测、静息态扫描的采集、数据质量评估、动物恢复过程，以及数据后处理分析的简要讨论。该方法可广泛应用于多种临床前啮齿类动物模型，有助于揭示静息状态下脑网络的改变。

引言

静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）用于测量大脑在静息状态下、未执行特定任务时的血氧水平依赖（BOLD）信号。这些信号可用于测量不同脑区之间的相关性，从而确定神经网络内的功能连接。由于rs-fMRI具有非侵入性，且对患者配合度要求较低（相较于基于任务的功能磁共振成像），因此在临床研究中被广泛应用，尤其适用于多样化的患者群体1。

技术进步使得静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）可应用于啮齿类动物模型，以揭示疾病状态背后的机制（详见参考文献2的综述）。临床前动物模型，包括疾病模型或基因敲除模型，能够实现广泛的人类无法适用的实验操作，研究还可利用死后样本进一步增强实验效果2。然而，由于限制动物运动和减轻应激反应均存在困难，啮齿类动物的磁共振成像通常在麻醉状态下进行。麻醉剂根据其药代动力学、药效学及分子靶点的不同，会影响脑血流量、脑代谢，并可能影响神经血管耦合通路。

人们已做出大量努力，开发能够保护神经血管耦合和脑网络功能的麻醉方案3,4,5,6,7,8。我们此前报道了一种麻醉方案，该方案联合使用低剂量异氟烷和低剂量α2肾上腺素能受体激动剂右美托咪定9。采用此种麻醉方法的大鼠在接受胡须刺激时，在已知的投射通路相关脑区（腹外侧和腹内侧丘脑核、初级和次级躯体感觉皮层）表现出显著的BOLD反应；同时，大规模的静息态脑网络，包括默认模式网络10,11和突显网络12，也能够被稳定检测到。此外，该麻醉方案允许对同一只动物进行多次成像，这对于纵向监测疾病进展以及实验干预的效果具有重要意义。

本研究详细介绍了所涉及的实验装置、动物准备以及生理监测流程。特别是，我们描述了特定的麻醉阶段，以及在每个阶段中扫描数据的采集过程。每次静息态扫描结束后均对数据质量进行评估。讨论部分还简要概述了扫描后的分析方法。对于希望探索在大鼠中应用静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）潜力的研究实验室，本方案将具有重要参考价值。

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方案

所有实验均在9.4 T磁共振成像仪上进行，并已获得达特茅斯学院机构动物护理与使用委员会的批准。此外，已获得录制和展示本视频及下图中所用动物的额外许可。

1. 扫描前的准备工作

  1. 皮下输注管路
    1. 将23 G针头部分从包装中取出，确保针尖保持无菌。
    2. 牢固握住针头的接口部位，使用剃刀片在针杆与接口连接处划痕。
    3. 在划痕正下方用针头夹固定针杆，并轻轻将针杆从接口处折断。
    4. 将针杆的1/3长度（钝端）插入预先灭菌的PE50管路中，管路长度需足以从药物泵延伸至磁体孔洞内的动物体内。
  2. 右美托咪定与阿替美唑的稀释
    1. 在透明无菌玻璃瓶中，将0.5 mL浓度为0.5 mg/mL的右美托咪定盐酸盐原液与9.5 mL无菌生理盐水混合，配制稀释溶液（稀释后浓度 = 0.025 mg/mL）。
    2. 在透明无菌玻璃瓶中，将0.1 mL浓度为5 mg/mL的阿替美唑原液与9.9 mL无菌生理盐水混合，配制稀释溶液（稀释后浓度 = 0.05 mg/mL）。
  3. 扫描参数
    1. 使用表1中列出的参数设置扫描序列。

2. 第一阶段麻醉：动物诱导与准备

  1. 准备工作
    1. 确保所有设备均已开启并正常运行，包括氧气和空气混合器、加热垫以及主动排风系统（见图1）。
    2. 将加热系统的温度设定为37.5 °C。
  2. 动物麻醉诱导
    1. 将动物（90日龄雄性Sprague Dawley大鼠）放入诱导室，使用含30%氧气的空气中加入2.5%异氟烷进行麻醉诱导。
      注：可使用不同年龄范围及两种性别的动物。
    2. 当动物进入麻醉状态后，将其从诱导室中取出，称重，并将其置于准备区域加热垫上的鼻罩中（异氟烷浓度维持在2.5%）。
  3. 动物准备
    1. 在每只眼睛上涂抹眼用润滑软膏，以防止角膜干燥。
    2. 通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度。
    3. 使用电推剪在动物背部下腰部区域（即尾部正上方）剃除一个2"×2"的方形区域。
    4. 使用25 G针头，在腹部右下象限进行腹腔（i.p.）注射，给予0.015 mg/kg的右美托咪定溶液（例如，300 g的大鼠注射0.18 mL）。
    5. 将异氟烷气流从准备区域切换至动物固定架。
    6. 将动物转移至动物固定架中，将其门齿牢固地置于咬合杆上方并卡入其中，推动鼻罩覆盖鼻部以确保密合。
      注：若鼻罩未能覆盖下颌，可使用石蜡膜轻轻固定下颌闭合，同时密封鼻罩周围。
    7. 将呼吸监测垫置于大鼠肋弓下方的腹部区域，并调整其位置，直至呼吸波形显示每次呼吸的深波谷居中（见图2中的呼吸波形）。
    8. 使用生理监测软件监测动物呼吸频率。当呼吸频率低于40次/分钟（bpm；约在注射右美托咪定后5分钟）时，进入下一阶段麻醉。

3. 第二阶段麻醉：动物准备

  1. 将耳杆插入耳道，以在动物固定架中稳定大鼠头部。放置到位后，向前拉动咬杆，并确认头部不会移动。根据需要重新调整鼻罩和石蜡膜（见图3a）。
  2. 将温度探头插入预先润滑的一次性探头套中。轻柔地将温度探头插入直肠约½英寸，并用医用胶带将其固定在尾根部。
  3. 将脉搏血氧仪探头夹置于后肢足跖部，确保光源位于足底（掌侧）。
    注意：探头夹旋转可能影响信号；因此，制作一个支架以保持足爪和探头夹直立可提高稳定性。另请注意，在大鼠体温未恢复至正常前，血氧饱和度可能较低（<95%）。
  4. 根据大鼠体重计算输注速率，以输注0.015 mg/kg/h的右美托咪定（例如，300 g大鼠的输注速率为0.18 mL/h）。
  5. 将药物泵设定为按计算所得的输注速率进行推注。
  6. 用无菌稀释后的右美托咪定溶液填充一支3 mL注射器，并将针头尖端插入已灭菌的输液管路开口端（该管路从药物泵延伸至动物固定架，皮下针头已预先连接）。填充管路，并将注射器固定于药物泵的注射器架中。
  7. 推动推块前进，直至接触活塞，使药物从针头端排出，确保输液管路完全充满。
  8. 使用酒精棉片清洁剃毛区域，去除散落的毛发。
  9. 捏起尾根部上方约两个手指宽度的皮肤，将输液管针头的1/3插入帐篷状皮肤中。
  10. 用一段3"宽的医用胶带将针头固定在皮肤上。再用第二段宽医用胶带覆盖第一层，横跨大鼠身体，并粘贴至动物固定架两侧（见图4）。
    注意：必须牢固固定铁磁性针头，以防止扫描过程中发生移动，这一点至关重要。
  11. 开始皮下输注右美托咪定。
  12. 在大鼠鼻梁上放置一块纱布，为线圈提供一个平整的支撑面。使用不会干扰MRI信号的纸质胶带，将线圈固定在大鼠头部，并使其对准脑部中心（见图3b,c）。
  13. 使用实验室胶带将动物固定架内的所有管线和电缆固定，并检查所有生理信号是否稳定（见图2）。
  14. 用纸巾覆盖动物，并用实验室胶带将其固定在动物固定架上。若使用空气加热系统，需用塑料膜包裹整个固定架以保留热空气。
  15. 将动物推入磁体孔内，并调节磁场。

4. 第三阶段麻醉：解剖扫描采集

  1. 将异氟烷浓度降低至1.5%，使呼吸频率稳定增加至约45–50次/分钟。在整个解剖扫描过程中保持此浓度。
  2. 使用FLASH定位扫描确保脑部与磁体等中心对齐（图5a）。如有必要，重新调整动物位置并重复扫描。
  3. 运行更高分辨率的RARE定位扫描，并利用该扫描结果对齐15个矢状切片，切片中心覆盖全脑（从左到右，图5b）。
  4. 利用中间矢状切片，将中心轴向切片对准前连合交叉处（表现为一个暗点，图5c）。记录该切片的偏移值，供后续静息态扫描使用。
  5. 使用FLASH和RARE轴向扫描序列各采集23个切片，以辅助在扫描后分析中将图像配准至公共空间。
  6. 使用PRESS序列对全脑范围进行匀场。

5. 第4阶段：静息态扫描数据采集

  1. 完成解剖扫描后，将异氟烷浓度降低至 0.5% 至 0.75%，并调整至动物呼吸频率为每分钟 60–65 次。在开始静息态扫描前，至少维持此状态 10 分钟，以确保生理稳定。
  2. 当生理状态稳定时（呼吸频率为每分钟 60–75 次，无喘息或不规则现象，核心体温为 37.5 ± 1.0 °C，血氧饱和度 ≥ 95%），使用与解剖学轴向序列相同的切片偏移，采集 15 层 EPI 扫描图像。
  3. 每次静息态扫描完成后，使用独立成分分析（ICA）对数据进行质量检查，将信号分解为空间和时间成分。
  4. 至少获取三次高质量的静息态扫描数据。

6. 扫描后恢复

  1. 扫描完成后，将异氟烷浓度增加至 2%，并停止皮下右美托咪定输注。
  2. 将动物固定架从磁体孔中取出，解开动物包裹物，并移除耳杆、温度探头、脉搏血氧仪夹及右美托咪定注射针头。
  3. 使用带有 25 G 针头的 1 mL 注射器，将稀释后的阿替美唑溶液按 0.015 mg/kg 剂量注射到大鼠后肢肌肉中（例如，300 g 大鼠注射 0.09 mL）。
  4. 将大鼠放回饲养笼中，置于加热垫上，并持续监测直至动物能够自主活动。

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结果

每次静息态扫描后，使用独立成分分析法（ICA；示例脚本包含在补充文件中）评估稳定性。图6展示了静息态扫描中成分输出的示例。图6a显示了一次高稳定性扫描中的信号成分。注意，从空间分布上看，该成分具有明显的区域性。在空间成分下方的时间进程中，信号稳定且不可预测，提示为真实的脑活动。底部的功率谱主要表现为低频成分。图6b展示了与图6a同一扫描中的一个代表噪声的成分。注意其空间成分缺乏区域性、时间进程呈现高频特征，以及功率谱中存在高频峰值。最后，图6c展示了一次麻醉不稳定的扫描中的成分。其时间进程波动且不规则。当出现这种情况时，通常需要改进麻醉方案，常见的是改进鼻罩的密封性和废气的清除。

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讨论

动物在生理和物理状态上的稳定性是获取高质量静息态数据的关键。本方案通过四个不同的麻醉阶段来实现稳定性。在进入下一个麻醉阶段之前，必须确保动物已达到设定的生理阈值；由于该方法依赖于生理自身调节机制，不同个体动物在每个麻醉阶段所需的时间可能略有差异。我们的经验表明，在每个阶段投入更多时间，比在未给予大鼠充分生理稳定时间的情况下仓促推进前期阶段更为高效。实现稳定性的关键因素包括鼻罩的贴合度以及适当的废气清除。

正确密封的鼻罩和有效的废气清除系统可使动物保持稳定，呼吸节律均匀，血氧饱和度水平稳定。如果出现喘息、呼吸间隔不规则、屏气或血氧饱和度下降等情况，应设法改善鼻罩的密封性和废气清除效果。鼻罩应贴合紧密，但不应压迫鼻梁。必要时需定制专用鼻罩。我们制造商提供的原始鼻罩排气阀过小，因此我们改用 Falcon 管，并在靠近动物的位置连接更大口径的密封负压管路，从而显著改善了呼出 CO2 的清除效果，使血氧饱和度保持稳定。如实验方案中所述，可用石蜡膜包裹下颌及鼻罩边缘，但若包裹过紧，可能限制呼吸并导致动物状态不稳定。此外，耳杆和咬齿杆位置不当不仅会影响成像所需头部的稳定性，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家药物滥用研究所（NIDA）的资助［DJW、EDKS 和 EMB 获得了授予 Alan I. Green 的 R21DA044501 项目资助，DJW 还获得了授予 Alan J. Budney 的 T32DA037202 项目资助］以及国家酒精滥用和酒精中毒研究所（NIAAA）的资助［Emily D. K. Sullivan 获得了 F31AA028413 项目资助］。此外，本研究还得到了达特茅斯学院精神病学 Raymond Sobel 讲席教授 Alan I. Green 的捐赠基金的支持。

Hanbing Lu 由美国国立卫生研究院（NIH）药物滥用研究所院内研究计划资助。

作者谨此致谢并纪念已故的 Alan I. Green。他对共病领域的坚定奉献促成了作者之间的合作。我们感谢他的指导与教诲，这些将令人深切怀念。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
9.4T MRIVarian/BrukerVarian 升级版，配备 Bruker 控制台并运行 Paravision 6.0.1 软件
空气-氧气混合器SechristModel 3500CP-G
功能神经影像分析（AFNI）NIMH/NIH版本 AFNI_18.3.03自由获取地址：https://afni.nimh.nih.gov/
动物育幼箱RAPID BiomedicalLHRXGS-00563带咬杆、鼻锥和耳棒的大鼠固定器
动物生理监测 && 门控系统SAIIModel 1025兼容磁共振的系统，包括血氧饱和度、温度、呼吸及光纤脉搏血氧测定附加装置
阿替美唑盐酸盐Patterson Veterinary07-867-7097硕腾，制造商货号 #10000449
陶瓷磁共振成像安全剪刀MRIequip.comMT-6003
剪刀Patterson Veterinary07-882-1032Wahl 修边修剪器组合套装，制造商货号 #09990-1201
右美托咪定（盐酸右美托咪定）Patterson Veterinary07-893-1801Dechra 兽药产品，生产厂家货号#17033-005-10
数字直肠体温计套MedlineMDS9608
FMRIB 软件库FMRIBMELODIC 版本 3.15免费获取地址：https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki
加热垫Cara Inc.Model 50
直型止血钳Kent ScientificINS750451-2
异氟烷Patterson Veterinary07-893-1389Patterson 私人标签，制造商货号 #14043-0704-06
异氟烷蒸发器VetEquip 公司911103
实验室胶带，3/4"VWR International89097-990
23号针头BD305145塑料轮毂已移除
Parafilm 实验室用膜Patterson Veterinary07-893-0260Medline Industries Inc.，制造商货号 #HSFHS234526A
平面表面线圈BrukerT126092cm
聚乙烯管布雷因特里科学公司PE50 50英尺0.023" （内径），0.038" （外径）
Puralube 眼用软膏Patterson Veterinary07-888-2572Dechra 兽用产品，生产厂家货号 #211-38
斯普拉格-多利大鼠Charles River400 SAS SD
无菌0.9%生理盐水溶液Patterson Veterinary07-892-4348Aspen Vet，制造商货号 #14208186
无菌酒精消毒片MedlineMDS090735
手术胶带，1" (3M Durapore)MedlineMMM15381Z3M 医疗保健， "宽型医用胶带"
外科白色纸胶带，1/2" (3M Micropore)MedlineMMM153003M 医疗保健
1 mL 带 25 号针头的注射器BD309626
3 mL注射器BD309657
带排气功能的诱导与废气清除系统VetEquip 公司9421022升诱导室，带主动废气清除系统
411724omega 流量计
931600清除立方体， "真空"
921616鼻锥，非重复呼吸

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