方法文章

DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略

6.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62598

⸱

2022年5月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Centre for Computational Biology, University of Birmingham, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 4Cancer Genetics and Evolution Laboratory, Cancer Research UK, Institute of Genetics & Molecular Medicine, The University of Edinburgh, 5Ribeirão Preto School of Physical Education and Sport, University of São Paulo, 6Health Sciences Department, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, 7Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 8Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 9Department of Clinical, Bromatological and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirao Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了利用微阵列技术获得的DNA甲基化数据的处理流程。该方案展示了从样本制备到数据分析的各个步骤。所有操作均进行了详细说明，视频中还演示了关键的操作步骤。

摘要

肥胖与生活方式直接相关，并与DNA甲基化改变有关，这些改变可能导致脂肪生成和脂质储存过程的异常，从而促进疾病的发展。本文展示了一项从受试者筛选到肥胖与非肥胖患者表观遗传数据分析的完整实验方案。该方案的所有步骤均在一项预试验研究中经过测试和验证。共有32名女性参与研究，其中15名根据体重指数（BMI）被归类为肥胖组（45.1 ± 5.4 kg/m2）；17名根据BMI被归类为非肥胖组（22.6 ± 1.8 kg/m2）。在线性回归分析中，肥胖组共鉴定出564个与脂肪质量相关的CpG位点，这些位点位于启动子区域。差异分析发现，在肥胖个体中存在470个低甲基化CpG位点和94个高甲基化位点。低甲基化最显著富集的通路包括RUNX、WNT信号通路以及缺氧反应通路。高甲基化通路则与胰岛素分泌、胰高血糖素信号通路和Ca2+相关。我们得出结论：该实验方案能够有效识别DNA甲基化模式及性状相关的DNA甲基化改变。这些甲基化模式可能与基因表达的改变相关，进而影响脂肪生成和脂质储存过程。我们的研究结果证实，致肥胖的生活方式可能促进人类DNA的表观遗传改变。

引言

大规模组学技术已越来越多地应用于慢性疾病的研究中。这些方法的一个显著特点是可向科学界提供大量生成的数据。因此，为了实现研究间的直接技术比较，对实验方案进行标准化的需求日益凸显。本研究提出了一种用于获取和分析DNA甲基化数据的标准化方案，并以一项试点研究作为应用示例。

现代人类生活方式以负能量平衡为主，导致脂肪组织过度积累，进而引发肥胖¹。多种因素加剧了肥胖率的上升，如久坐不动、高热量饮食和高压力的生活节奏。世界卫生组织（WHO）估计，2016年全球有19亿成年人肥胖，这意味着全球超过20%的人口体质指数（BMI）超过30 kg/m22。2018年最新数据显示，美国（USA）的肥胖患病率已超过42%3。

表观遗传学是指染色体区域通过结构上的适应来记录、传递或维持基因活性状态改变的机制4。DNA甲基化是一种可逆的化学修饰，发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸位点（CpG位点），形成5-甲基胞嘧啶-pG（5mCpG）。它可通过调控转录机器对DNA的可及性来调节基因表达5,6,7,8。在此背景下，明确哪些CpG位点与肥胖相关性状相关至关重要9。多种因素可促进或抑制特定位点的DNA甲基化。该过程所必需的酶，如DNA甲基转移酶10（DNMTs）和十一个易位蛋白（TETs），可在环境暴露条件下促进DNA的甲基化或去甲基化11。

近年来，随着人们对DNA甲基化研究的兴趣日益增长，选择最合适的分析策略以精确回答每个科学问题已成为研究人员关注的重点12,13,14。450K DNA甲基化芯片是目前最常用的方法，已在超过360篇出版物中用于确定DNA甲基化谱14，可检测位于已知基因中99%区域的多达485,000个CpG位点的甲基化状态15。然而，该芯片现已停产，被覆盖850,000个CpG位点的EPIC芯片所取代。本实验方案适用于450K和EPIC两种芯片平台16,17,18。

该方案在图1中以逐步形式展示，包括以下步骤：人群选择、取样、实验准备、DNA甲基化流程和生物信息学分析。本文展示了我们实验室开展的一项预实验研究，用以说明本方案各步骤的实施过程。

DNA甲基化微阵列流程：取样、制备、转化、扩增、分析。
图1：本方案的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

圣保罗大学里贝朗普雷图医学院大学医院（HCRP-USP）伦理委员会批准了本研究（CAAE：14275319.7.0000.5440）。所有参与者均签署了知情同意书，全部操作均遵循《赫尔辛基宣言》进行。

1. 人群与抽样

  1. 招募体重指数（BMI）>30 kg/m2 的受试者参与研究。本研究共纳入32名年龄在18至60岁之间的混合人群女性19。
    注：在HCRP-USP研究中，肥胖发生率在女性中较高20。肥胖组受试者（BMI ≥30 kg/m2，n = 15）来自HCRP-USP的代谢疾病门诊；非肥胖组受试者（BMI在18.5 kg/m2至24.9 kg/m2之间，n = 17）来自其他门诊，且无严重疾病；临床数据见表1。
  2. 排除孕妇、哺乳期妇女、吸烟者及饮酒者。

2. 人体测量与身体成分

  1. 使用200 kg电子人体测量秤测量受试者的体重。测量前需脱鞋并去除多余衣物。
  2. 使用刻度为0.5 cm的身高计评估身高。受试者需赤脚站立，双脚并拢，双臂自然垂于身体两侧21。
  3. 采用生物电阻抗分析仪获取体脂量（FM）信息。受试者需空腹12小时，并在排空膀胱后进行测量。测量时让受试者取仰卧位，双腿分开，双臂平行于身体且不接触躯干。要求受试者去除所有金属饰品22。
  4. 使用刻度为0.1 mm的不可伸缩卷尺测量腰围（WC）。将卷尺水平环绕于髋骨上方的腰部最窄处。测量在呼气末进行。根据美国疾病控制与预防中心（Centers for Diseases Control and Prevention, CDC）标准，女性腰围的临界值为88 cm23。

表1：人群特征。所有变量均符合参数检验条件（p > 0.05，Shapiro-Wilk检验），组间差异采用独立样本t检验进行评估，显著性水平定义为p < 0.05。*p < 0.0001。请点击此处下载该表格。

3. 生物材料的采集

  1. 按照先前所述方法，在禁食 12 小时后采集外周血24。
  2. 将全血样本 4 mL 收集至含抗凝剂（如 EDTA）的采血管中，并置于冰上保存以用于运输。

4. DNA 提取

  1. 将含有血液的每支试管在2,000 × g 条件下离心10分钟。收集约300 µL的白膜层（白色中间层）。
  2. 使用 commercially available 的仪器（见材料表）从外周血中提取DNA，方法如前所述25。用480 µL超纯H2O洗脱DNA。
  3. 使用荧光计测定DNA浓度和质量。通过1%琼脂糖凝胶分析评估其完整性25。于-80 ˚C冰箱中保存。

5. 甲基化分析前的准备

  1. 确保样本具有最低DNA浓度（理想的起始输入量为500 ng），但此步骤中不同样本的稀释比例可能有所不同。
  2. 某些试剂未包含在微阵列试剂盒中26，需单独购买27。
  3. 检查试剂盒是否包含实验过程中使用的所有试剂；这些试剂不可替代。检查所有试剂的有效期。确保试剂盒未提供的其他试剂和溶液也已备齐（95%甲酰胺/1 mM EDTA、0.1 N NaOH、无水乙醇、2-丙醇）。
    警告：甲酰胺为挥发性试剂，若使用新鲜产品可提高结果质量。甲酰胺和无水乙醇的完整性和质量至关重要，因其可能影响制造商建议的染色过程。所选醇类必须为适用于分子生物学分析的超纯级产品。
  4. 获得微阵列试剂盒后，下载芯片解码图谱（DMAPs）。这些文件在试剂盒发货后24–48小时内可在制造商网站获取，并在有效期截止后被移除28。请按以下步骤下载相关文件。
    1. 确保有可联网的计算机。使用软件解码文件客户端进行下载。
    2. 安装程序前，请确认计算机已获得机构允许的内外网络访问权限；解码文件客户端无安全限制。
    3. 使用“BeadChip访问”选项登录解码文件客户端软件。登录需使用MyIllumina用户ID和密码。需在该页面完成注册28。
    4. 登录解码文件客户端后，在软件主页的相应字段中输入以下信息28：条形码列表；盒子编号（Box Ids）列表；采购订单号（PO）；销售订单号（注意：勿包含数字后的字母）。
    5. 根据采购盒中的条形码编号选择需下载的DMAPs，并在对话框中指定保存DMAPs的目标路径。
    6. 点击按钮开始下载。
      注意：下载完成后，请确认下载的文件夹非空，并妥善保存文件，因其在将实验数据转换为强度数据文件（IDAT文件）的最后步骤中必不可少。超过有效期后，Illumina可能会从其在线数据库中删除DMAPs数据。

6. DNA甲基化分析流程

注意：DNA甲基化实验分为4天（图1）。请遵循制造商的建议和规格操作，以获得准确的结果。

  1. 第1天：亚硫酸氢盐处理
    1. 首先变性500 ng基因组DNA，然后加入转化试剂。执行此步骤时，请遵循亚硫酸氢盐和微阵列试剂盒的建议29。
    2. 使用制造商提供的标准浓度的亚硫酸氢盐转化试剂130 µL处理变性的DNA。
    3. 将离心管放入热循环仪中，进行16个循环：95 °C孵育30秒，50 °C孵育1小时。随后将热循环仪降温至4 °C，持续10分钟。
    4. 通过加入100 µL洗涤缓冲液并以最大速度离心30秒完成洗涤步骤。用户指南中未提供该缓冲液的浓度，制造商已标准化其体积。
      注意：该试剂随试剂盒提供，无需稀释或配制。
  2. 第2天：扩增——甲基化检测，手动方案
    1. 将杂交炉预热至37 °C，并使温度达到平衡。
    2. 在0.8 mL微孔板上贴上条形码标签。
    3. 在室温下解冻扩增试剂（多样本扩增混合液1、随机引物混合液和多样本扩增主混合液）（这些试剂随试剂盒提供，无需稀释或配制）。然后轻轻颠倒混匀至少10次，确保管内所有内容物充分混合。
    4. 将20 µL多样本扩增混合液1（MA1）分装至微孔板的各孔中。
    5. 将4 µL亚硫酸氢盐转化后的DNA样本从转化板转移至0.8 mL板的对应孔中。此时，在实验室追踪表上记录原始DNA样本的ID，与板孔相对应。
    6. 向含有多样本扩增混合液1（MA1）和DNA样本的每孔中加入4 µL 0.1 N NaOH。
    7. 用塑料密封膜密封微孔板。
    8. 涡旋震荡微孔板，以1,600 rpm速度混合试剂与样本1分钟。室温孵育10分钟后，小心移除密封膜。
    9. 向微孔板的每孔中加入68 µL随机引物混合液（RPM）。再向每孔中加入75 µL多样本扩增主混合液（MSM）（无需移除先前溶液）。使用新的密封膜覆盖微孔板。
      注意：请小心将微孔板与板架正确对齐并正确放置方向。
    10. 将密封后的微孔板以1,600 rpm速度涡旋震荡1分钟。在杂交炉中37 °C孵育20–24小时。
  3. 第3天：杂交——甲基化检测，手动方案
    1. 将金属加热块预热至37 °C。
    2. 在室温下解冻管内内容物。小心并轻柔地颠倒碎片化溶液（FMS）管至少10次，以充分混匀内容物。
    3. 小心将微孔板从杂交炉中取出。以280 x g短暂离心微孔板。
    4. 现在移除微孔板的密封膜。向每孔样本中加入50 µL碎片化溶液（FMS），并再次密封微孔板。以1,600 rpm速度涡旋震荡1分钟。
    5. 以280 x g离心微孔板数秒（进行短暂离心）。然后将密封的微孔板置于37 °C加热块上孵育1小时。
    6. 若决定暂停实验并将微孔板冷冻，则在室温下解冻后，以280 x g离心。若未冷冻，则跳过此步骤，直接进入步骤6.3.7。
    7. 让加热块继续预热至37 °C。
    8. 让洗涤缓冲液在室温下解冻。解冻后，颠倒至少10次以混匀内容物。
    9. 移除微孔板的密封膜。
    10. 向含有样本的每孔中加入100 µL沉淀溶液（PM1）。
    11. 再次用密封膜密封微孔板。
    12. 以1,600 rpm速度涡旋震荡1分钟。
    13. 在37 °C孵育5分钟。
    14. 然后，在280 x g下短暂离心1分钟。
      注意：为下一步骤将离心机设定为4 °C。
    15. 小心移除微孔板的密封膜并丢弃。
    16. 向每孔样本中加入300 µL 100%异丙醇。
    17. 使用新的密封膜极其小心地密封微孔板。注意不要摇晃微孔板。
    18. 颠倒微孔板至少10次，充分混匀所有内容物。
    19. 在4 °C孵育30分钟。
    20. 在4 °C、3,000 x g下离心20分钟。
      注意：在步骤6.3.20结束后，立即取出离心后的微孔板。
    21. 移除微孔板的密封膜并丢弃。
    22. 迅速将微孔板倒置，在吸水纸上倒出液体以去除上清液。然后在干燥区域的纸巾上轻敲微孔板以排尽液体。
    23. 用力敲击数次，持续1分钟或直至所有孔中无残留液体。
    24. 将微孔板倒置并敞口放置于室温下1小时。
      注意：预期在孔底可见蓝色沉淀。
    25. 将杂交炉预热至48 °C。
    26. 打开加热块进行预热。此过程需20分钟。
    27. 在室温下解冻重悬液、杂交液和洗涤液。颠倒至少10次。检查溶液中是否有盐析出。
    28. 向微孔板的每孔中加入46 µL重悬液、杂交液和洗涤液（RA1）。
      注意：任何剩余试剂必须保留用于染色和杂交步骤。
    29. 将密封膜贴于微孔板上。使用铝膜覆盖微孔板。用力按压以确保密封均匀。
    30. 检查所有孔是否已安全封闭，以避免蒸发。
    31. 小心将新密封的微孔板放入杂交炉中，在48 °C孵育1小时。
    32. 以1,800 rpm速度涡旋震荡1分钟。
    33. 以280 x g短暂离心。
    34. 将微孔板转移至95 °C加热块上孵育1小时。
    35. 通过将杂交（Hyb）室组合在一起准备Hyb室。向Hyb室的储液槽中加入400 µL润湿缓冲液（PB2）。立即盖上盖子。
    36. 将微孔板中的每个样本加载至微阵列的样本入口。
    37. 将含有微阵列的Hyb室插入件装入Hyb室中。交叉关闭Hyb室，以避免Hyb室发生位移。
      注意：Hyb室需在48 °C孵育至少16小时，但不超过24小时。
  4. 第4天：染色——甲基化检测，手动方案
    1. 用330 mL 100%乙醇重悬染色溶液4，获得最终体积350 mL。剧烈震荡染色溶液4瓶，确保完全重悬。室温保存。
      注意：染色溶液4可在2 °C至8 °C温度下保存最多2周。
    2. 从杂交炉中取出Hyb室，在打开前于实验台上冷却30分钟。
    3. 在Hyb室冷却期间，向两个洗涤容器中各加入200 mL洗涤缓冲液。请记住将每个容器标记为"洗涤缓冲液"（PB1和PB2）。
    4. 向微阵列对齐配件中加入150 mL洗涤缓冲液。
    5. 分离塑料垫片，必要时清洁玻璃。
    6. 为洗涤微阵列玻片，将金属环固定在网格上，并将滴液设备浸入含200 mL洗涤缓冲液的容器中，共10次。
    7. 从杂交室中取出所有插入件，并从插入件中取出每张阵列。移除密封膜。
      注意：取出过程中切勿触碰暴露的阵列。
    8. 从杂交室中取出微阵列玻片时，注意不要洒出任何液体。
    9. 在洗涤缓冲液（PB1）溶液中缓慢轻柔地洗涤微阵列，上下移动10次。转移到新鲜PB1溶液中，再次缓慢上下移动微阵列10次进行洗涤。
    10. 从容器中取出微阵列，确认无残留物。
    11. 在每张微阵列顶部使用透明垫片，并将垫片引导至对应位置。
      注意：请务必仅使用透明垫片，而非白色垫片。
    12. 将对齐条放置在对齐配件上。
    13. 在透明垫片上方放置一块玻璃背板；注意完全覆盖整个微阵列。然后将金属夹固定在流式室上。必要时，使用剪刀修剪流式室垫片的末端。
    14. 立即使用ddH2O清洗杂交室的储液槽，并用小清洁刷刷洗。确保储液槽中无任何润湿缓冲液残留。
    15. 进入下一步，即延伸和染色微阵列。
      注意：将所有流式室水平放置在实验台上。仅在完成整个染色步骤准备就绪后才重新操作。将重悬液、杂交液和洗涤液加热至20 °C至25 °C之间。轻柔混匀，直至溶液中无晶体可见。
    16. 按顺序将试剂放入试管架中。如有冷冻试剂，先在室温下放置，然后颠倒至少10次以混匀溶液。
    17. 将水循环器加水至适当水位。
    18. 打开泵，设定温度为44 °C。
    19. 清除附着在室架上的所有气泡。
    20. 使用温度探头对室架进行测试。所有测试位置的温度必须在44 °C ± 0.5 °C范围内。
      注意：以下步骤必须连续进行，不得中断。
    21. 当室架温度达到44 °C时，迅速将每个组件放入流式室中。
      注意：在以下步骤中，将所有试剂移液至背侧玻璃板。
    22. 移液150 µL重悬液、杂交液和洗涤液（RA1），然后孵育30分钟。重复此步骤共5次。
    23. 移液450 µL染色溶液1（XC1），孵育10分钟。
    24. 移液450 µL染色溶液2（XC2），孵育10分钟。
    25. 移液200 µL双色延伸主混合液（TEM），孵育15分钟。
    26. 移液450 µL 95%甲酰胺/1 mM EDTA，孵育1分钟。重复两次。
    27. 孵育5分钟。
    28. 将室架温度降至32 °C（见双色主混合液说明）。
    29. 移液450 µL染色溶液3（XC3），孵育1分钟。重复1次。
    30. 等待室架内温度达到正确值。
      注意：若需在染色过程结束后立即读取微阵列图像，此时应开启扫描仪。
    31. 现在移液250 µL高级双色主混合液（STM），随后孵育10分钟。
    32. 然后移液450 µL染色溶液3（XC3），孵育1分钟。重复1次。
    33. 等待5分钟后，加入250 µL抗染色双色主混合液（ATM），孵育10分钟。
    34. 现在移液250 µL高级双色主混合液（STM），随后孵育10分钟。
    35. 然后移液450 µL染色溶液3（XC3），孵育1分钟。重复1次。
    36. 等待5分钟。
    37. 加入250 µL抗染色双色主混合液（ATM），孵育10分钟。
    38. 加入450 µL微阵列染色溶液3（XC3），孵育1分钟，然后再次重复。
    39. 等待5分钟。
      注意：执行以下重复方案：步骤6.4.34、步骤6.4.35和步骤6.4.36；步骤6.4.37、步骤6.4.38和步骤6.4.39；步骤6.4.34、步骤6.4.35和步骤6.4.36。
    40. 现在立即从室架上取下流式室，并小心水平放置在实验台上。确保环境温度适宜。
    41. 6.4.41. 在洗涤容器中为每张微阵列加入310 mL洗涤液（PB1）。
    42. 移除金属夹和玻璃，最后取出微阵列。
    43. 将微阵列放置在染色架上，并放入含有10倍PB1溶液的洗涤容器中。确保条形码朝向操作者相反方向，且所有微阵列完全浸没。
    44. 缓慢轻柔地上下移动10次。每次应将微阵列完全从溶液中取出后再重新浸入。然后让其完全浸没5分钟。
    45. 剧烈震荡染色溶液4（XC4）试剂，确保完全重悬。将310 mL XC4加入洗涤容器中。
      注意：不要让溶液在洗涤容器中停留超过10分钟。
    46. 轻柔地将染色架移至另一含XC4的容器中。
    47. 缓慢轻柔地上下移动10次。确保微阵列完全从溶液中取出后再重新浸入。
    48. 然后让微阵列保持浸没状态5分钟。
    49. 将染色架从溶液中取出，放入试管架中，条形码朝上。
    50. 使用锁定镊子小心取出微阵列，并将其放置在架子上晾干。
    51. 使用真空干燥器在675 mm Hg（0.9 bar）下干燥50–55分钟。
    52. 使用乙醇清洁每张微阵列的背面。
      警告：避免触碰条带，且切勿让乙醇滴落在条带上。
    53. 进行微阵列成像。
    54. 小心将微阵列在室温下存入储存盒中。
      注意：微阵列图像必须在72小时内获取。

7. 生物信息学分析

注意：必须更改微阵列类型的某些属性（例如，arraytype = "450k" 应替换为 arraytype = "EPIC"）。ChAMP 分析流程的作者在该软件包的 Bioconductor 页面中详细描述了所有需要修改的字段30。

  1. 样本信息表
    1. 将 IDAT 文件转移至计算机，以进行生物信息学分析31。创建样本信息表以开展数据分析31。
      注意：该电子表格文件必须包含三列。第一列为 Sample_name，用于填写用于标识样本的名称或编号。第二列为 Sentrix_position，用于填写样本对应的 R01C01 位置，其中 R01 表示芯片的行，C01 表示列。第三列为必需的 Sentrix_ID，用于填写识别微阵列的编号，请确保填写正确的数字。可在样本信息表中添加其他信息作为变量值。在本实验中，包含了金属分析的数据。
  2. ChAMP 分析流程
    1. 在计算机上安装 RStudio（版本 4.0.2）以执行分析30。
      注意：确保计算机至少具有 8 GB 的 RAM。若 RAM 低于此值，数据分析将难以运行或导致程序崩溃。
    2. 安装完成后，打开 RStudio，并使用相应的命令行安装 ChAMP Bioconductor 软件包30（参见 补充材料 1）。
      注意：若安装结束时出现任何错误，请手动逐一安装 ChAMP 所需的依赖库26。
    3. 现在导入原始数据并执行分析。参见 补充材料 1。
      champ.load() 用于导入原始数据并执行过滤过程，排除检测 p 值较低的探针、多重比对位点、非 CG 探针、靠近 SNP 的 CpG 位点以及位于性染色体上的 CpG 位点。
      champ.impute() 默认执行 KNN 插补法。
      champ.QC 生成数据质量图（例如密度图）。
      champ.SVD 基于样本信息表中提供的元数据评估批次效应。
      champ.refbase() 执行细胞类型估计与校正。
      champ.DMP( ) 提取差异甲基化位点及性状关联结果（如脂肪质量），用于比较组间 DNA 甲基化水平，并根据 补充材料 1 中所示调整参数。
  3. 功能富集分析（String DB）
    注意：功能富集分析用于推断一组基因的生物学功能。
    1. 在 String 数据库中进行富集分析时，选择待富集的目标基因列表，并作为输入提交至： https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
    2. 在物种选项中选择 homo sapiens，然后点击 Search 按钮。
    3. 要进行富集分析，请点击 Analysis 按钮。
  4. GEO 数据提交
    1. 将数据存入公共数据库，例如 NCBI 的 GEO。首先，注册提交者账户。
      注意：完成 GEO 提交（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/）时，需下载元数据表格，其中包含整个实验及各个样本的描述性信息和实验方案。GEO 归档提交可在任意电子表格软件中创建。其次，将所有文库经 cell-ranger count 脚本生成的原始数据文件添加至目录中。IDAT 文件及相关文件或矩阵工作表应包含未归一化的数据。第三个文件夹为处理后的数据文件。矩阵表应为一个电子表格，包含最终归一化后的数值，可在不同行和样本间进行比较，并建议按照随附稿件中描述的方法进行处理。
    2. 将所有文库经 cell-ranger count 脚本生成的处理后数据文件放入目录中。使用 GEO 提交者的 FTP 服务器凭据，上传包含全部三个组成部分的目录。

结果

使用ChAMP分析流程后，经过所有筛选步骤（不合格的CpG位点、非CpG探针、靠近SNP的CpG位点、多重比对位点以及与X和Y染色体相关的CpG位点）共保留了409,887个探针用于后续分析；该流程示意图见图2。

生物信息学分析示意图；过滤、标准化、批次效应；数据处理方法。
图 2：生物信息学分析流程图。 请点击此处查看本图的放大版本。

此外，密度图显示所有样本在与质量控制步骤相关的 beta 分布上具有相似的密度。该分析评估了 beta 值的分布情况，并指出是否存在需要排除的样本。在本批次中，未根据此分析排除任何样本。

密度图，409887 个探针，β 分布分析，科学数据可视化。
图 3：通过 ChAMP 软件包获得的 β 值密度图。 请点击此处查看该图的放大版本。

采用奇异值分解（SVD）分析来验证显著影响DNA甲基化数据变异性的主成分。结果显示，BMI、WC（p < 1e10-5）和FM（p < 0.05）对数据变异性具有显著影响（图4）。

主成分显著性水平的奇异值分解 (SVD) 柱状图。
图 4：奇异值分解分析。 请点击此处查看此图的放大版本。

细胞类型估算结果显示，肥胖女性体内的自然杀伤细胞（NK）和B细胞比例均较高（图5）。

淋巴细胞百分比柱状图；非肥胖组 vs 肥胖组；显示粒细胞（GRAN）、CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞（MONO）、B细胞、NK细胞。
图5：采用Houseman方法估算的细胞组分。Gran：粒细胞。 CD4T：辅助性T细胞，淋巴细胞。CD8T：细胞毒性T细胞，淋巴细胞。Mono：单核细胞。B Cell：B淋巴细胞。NK：自然杀伤细胞，淋巴细胞。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的高清版本。

肥胖与非肥胖女性在细胞类型校正前后DNA甲基化水平存在差异。在对DNA甲基化数据进行细胞类型校正前，共检测到43,463个差异甲基化位点（DMPs），校正后仍有3,329个CpG位点具有显著差异。其中445个CpG位点位于基因间区（IGR），2,884个位于基因区内，且多数位于启动子区域（n = 1,438）。各区域分布分别为TSS1500（n = 612）、TSS200（n = 826）、5'UTR（n = 390）、第一外显子（n = 273）、基因体（body，n = 724）和3'UTR（n = 59）。结合Δβ值进行分析 <-0.05 和 >0.05，在肥胖个体与非肥胖个体相比中，有162个CpG位点呈低甲基化，576个CpG位点呈高甲基化（图6）。数据可在 GEO 数据库中获取，注册编号为 GSE166611。

通路富集图；低甲基化与高甲基化胞嘧啶，DMP维恩图，DNA甲基化。
图6：差异甲基化位点。 请点击此处查看此图的放大版本。

在甲基化研究中，可以评估不同组之间的甲基化差异，并找出与特定性状相关的CpG位点。在体脂量研究中，共发现13,222个CpG位点。其中，位于启动子区域的6,159个CpG位点与体脂量相关，包括470个高甲基化位点和94个低甲基化位点（图7），相应基因在这些位点上富集（表2）。

脂肪量DMPs维恩图；通路：RUNX、WNT、胰岛素信号传导，突出显示的甲基化过程。
图7：与脂肪量独立相关的低甲基化和高甲基化基因的启动子区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

表2：差异甲基化CpG位点基因的功能富集分析。 请点击此处下载该表格。

补充材料 1： 请点击此处下载该文件。

讨论

由于成本效益比较高，DNA甲基化芯片是检测DNA甲基化最常用的方法14。本研究描述了一项使用商业化微阵列平台的详细实验方案，用于评估在巴西队列中开展的一项预试验中的DNA甲基化水平。预试验获得的结果证实了该实验方案的有效性。图3展示了样本之间的可比性以及完全的亚硫酸氢盐转化效果32。

作为质量控制步骤，ChAMP 算法建议在过滤过程中排除某些 CpG 位点。排除探针的目的是提高数据分析的准确性并消除偏差。低质量的 CpG 位点（p 值低于 0.05）被去除，以消除数据集中的实验噪声。剩余的目标位点在密度图分析中均通过检测。Zhou33 指出，过滤靠近 SNP 的 CpG 位点非常重要，可避免错配、多态性胞嘧啶甲基化的误读，以及 I 型探针设计中的颜色切换问题34。此外，由于印记效应对 X 和 Y 染色体的影响不同，Heiss 和 Just35 强调了过滤这些探针的重要性，因为在女性样本中，杂交问题可能成为混杂因素35。

DMAPs 的有效期、甲酰胺的开启日期、绝对乙醇的分析质量以及总白细胞计数被认为是本实验方案中的关键步骤。

此外，根据我们的观察，细胞类型估计在进行生物信息学分析时至关重要。Houseman 方法执行细胞类型估计，如 Tian 的研究中所述30。该方法基于 473 个特异性 CpG 位点，可预测最重要细胞类型的百分比，例如粒细胞、单核细胞、B 细胞和 T 细胞36。我们使用了 ChAMP 软件包中推荐的函数 "myRefbase"。在完成估计后，ChAMP 算法将调整 beta 值，并从数据集中消除这一偏差。这一步骤在聚焦于肥胖的研究中尤为关键，因为该人群由于处于慢性炎症状态，白细胞组成存在显著差异。

我们仅针对常见PCR封膜的方法改进和故障排除修改了原始封膜方案。每次离心后，均更换新的封膜。我们无法使用标准的热封方法，因此改用铝箔包裹板子进行密封。

尽管商业检测试剂盒被认为是表观遗传学研究的金标准，但该实验方案的一个局限性在于试剂和设备依赖于单一品牌，可能导致特异性问题37,38,39,40。另一个局限性是缺乏能够指示实验是否按正确进程进行的监测指标41。

本实验方案的标准化为表观遗传学研究提供了重要指导，可减少实验过程中的人为误差，并实现不同研究之间的成功数据分析与结果可比性。

根据我们的结果，DNA甲基化实验适用于比较肥胖与非肥胖个体的研究43。此外，所提出的生物信息学分析可提供高质量的数据，可用于大规模研究。

通过SVD分析，我们发现与肥胖相关的性状（BMI、WC和FM）影响了DNA甲基化数据的变异性。一个重要的结果是，细胞类型估计表明，与非肥胖女性相比，肥胖女性的自然杀伤细胞（NK细胞）和B细胞比例更高（图5）。这些细胞数量的增加可能与这些个体存在的低度炎症状态有关44。我们观察到，肥胖患者在与脂肪质量相关的基因启动子区域存在低甲基化和高甲基化的CpG位点。其中大多数位点表现为低甲基化，这可能与这些个体体内活性氧（ROS）水平的自然升高有关。这种氧化应激状态可能促进二核苷酸位点上鸟嘌呤的扰动，形成8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG），从而产生5mCp-8-OHdG二核苷酸位点，并导致TET酶的募集。上述所有事件可能通过不同的作用机制共同促进DNA的低甲基化和高甲基化45。

此外，肥胖个体的脂肪生成速率似乎会增加，新细胞与旧细胞的比例约为10%46,47。表观遗传因素强调致肥胖环境的影响，可改变细胞的增殖和分化速率，促进脂肪组织的形成48。表观遗传改变还可能影响脂肪生成程序，促进或限制其发育过程。主要的转录因子（PPARγ 或 C/EBPα）或由表观遗传修饰酶的招募或排除所调控的、位于下游启动子区域的多蛋白复合物的组装，可通过高甲基化或低甲基化调节基因表达45。已有研究报道，PPARγ 通路可改变 WNT 通路，而本研究中发现该通路相关基因富集。尽管目前尚不清楚 WNT 信号在脂肪生成过程中如何发挥作用，但近期研究表明，其在脂肪细胞代谢中可能具有重要作用，尤其是在致肥胖条件下49。

披露

本文作者无任何利益冲突，且无任何财务信息披露。

致谢

我们感谢田源博士（tian.yuan@ucl.ac.uk）在解答有关 ChAMP 软件包所有疑问方面的支持。同时感谢吉列尔梅·特莱斯硕士（Msc.）对本文技术和科学问题所做出的贡献；他在表观遗传学以及视频采集与格式化技术方面提出了重要建议（guilherme.telles@usp.br）。耗材经费来源：圣保罗研究基金会（FAPESP）（#2018/24069-3）和国家科学技术发展委员会（CNPq：#408292/2018-0）。个人资助：圣保罗研究基金会（FAPESP：#2014/16740-6）以及高等教育人员发展协调办公室（CAPES：88882.180020/2018-01）。本研究数据将无限制地公开并免费提供。通讯作者请联系 NYN（电子邮件：nataliayumi@usp.br）或 CBN（电子邮件：carla@fmrp.usp.br）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇J.T. BakerB5924-03
琼脂糖凝胶KasviK9-9100
生物电阻抗检测Quantum BIA 450 Q - RJL System
乙二胺四乙酸（EDTA）Corning46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒ZymoResearch, Irvine, CA, USAD5001
甲酰胺SigmaF9037
FMS—片段化溶液Illumina11203428提供试剂
HumanMethylation450 BeadChipIllumina
Maxwell 仪器Promega, BrazilAS4500
MA1—多样本扩增 1 混合液Illumina11202880提供试剂
MicroAmp 光学粘性封膜Thermo Fisher Scientific201703982
MSM—多样本扩增主混合液Illumina11203410提供试剂
NaOHF. MAIA114700
PB1—用于BeadChips杂交前处理的试剂Illumina11291245提供试剂
PB2—杂交过程中使用的加湿缓冲液Illumina11191130提供试剂
2-丙醇Emsure10,96,34,01,000
RA1—重悬、杂交和洗涤溶液Illumina11292441提供试剂
RPM—随机引物混合液Illumina15010230提供试剂
STM—高效双色主混合液Illumina11288046提供试剂
TEM—双色延伸主混合液Illumina11208309提供试剂
超纯EDTAInvitrogen155576-028
带条形码的96孔反应板（0.1 mL）ByoSystems4346906
带条形码的96孔反应板（0.8 mL）Thermo Fisher ScientificAB-0859
XC1—XStain BeadChip 溶液1Illumina11208288提供试剂
XC2—XStain BeadChip 溶液2Illumina11208296提供试剂
XC3—XStain BeadChip 溶液3Illumina11208392提供试剂
XC4—XStain BeadChip 溶液4Illumina11208430提供试剂

参考文献

  1. Manna, P., Jain, S. Obesity, oxidative stress, adipose tissue dysfunction, and the associated health risks: causes and therapeutic strategies. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 13 (10), 423-444 (2015).
  2. World Health Organization. Obesity. , Available from: https://www.who.int/health-topics/obesity#tab=tab_1 (2017).
  3. Adult Obesity Facts. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html (2021).
  4. Bird, A. Perceptions of epigenetics. Nature. 396, (2007).
  5. Kouzarides, T. Chromatin modifications, and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  6. Berger, F. The strictest usage of the term epigenetic. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (6), 525-526 (2008).
  7. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory, and gene regulation. Current Biology. 26 (14), 644-648 (2016).
  8. Laker, R. C., et al. Transcriptomic and epigenetic responses to short-term nutrient-exercise stress in humans. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  9. Wahl, S., et al. Epigenome-wide association study of body mass index, and the adverse outcomes of adiposity. Nature. 541, 81-86 (2017).
  10. Jin, B., Robertson, K. D. DNA methyltransferases, DNA damage repair, and cancer. Epigenetic Alterations in Oncogenesis. 754, 3-29 (2013).
  11. Jang, H. S., Shin, W. J., Lee, J. E., Do, J. T. CpG and non-CpG methylation in epigenetic gene regulation and brain function. Genes. 8 (6), 148(2017).
  12. Shen, L., Waterland, R. A. Methods of DNA methylation analysis. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 10 (5), 576-581 (2007).
  13. Olkhov-Mitsel, E., Bapat, B. Strategies for discovery and validation of methylated and hydroxymethylated DNA biomarkers. Cancer Medicine. 1, 237-260 (2012).
  14. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA methylation analysis: choosing the right method. Biology. 5 (1), 3(2016).
  15. Yong, W. -S., Hsu, F. -M., Chen, P. -Y. Profiling genome-wide DNA methylation. Epigenetics & Chromatin. 9 (1), 1-16 (2016).
  16. Dugué, P. A., et al. Alcohol consumption is associated with widespread changes in blood DNA methylation: Analysis of cross-sectional and longitudinal data. Addiction Biology. 1, 12855(2021).
  17. Colicino, E., et al. Blood DNA methylation sites predict death risk in a longitudinal study of 12, 300 individuals. Aging. 14, 14092-14124 (2020).
  18. Karlsson, L., Barbaro, M., Ewing, E., Gomez-Cabrero, D., Lajic, S. Genome-wide investigation of DNA methylation in congenital adrenal hyperplasia. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 201, 105699(2020).
  19. Ribeiro, R. R., Guerra-Junior, G., de Azevedo Barros-Filho, A. Bone mass in schoolchildren in Brazil: the effect of racial miscegenation, pubertal stage, and socioeconomic differences. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 27 (4), 494-501 (2009).
  20. Filozof, C., et al. Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obesity Reviews. 2 (2), 99-106 (2001).
  21. Chadid, S., Kreger, B. E., Singer, M. R., Bradlee, M. L., Moore, L. L. Anthropometric measures of body fat and obesity-related cancer risk: sex-specific differences in Framingham Offspring Study adults. International Journal of Obesity. 44 (3), 601-608 (2020).
  22. Nicoletti, C. F., et al. DNA methylation pattern changes following a short-term hypocaloric diet in women with obesity. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1345-1353 (2020).
  23. Assessing Your Weight. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/healthyweight/assessing/index.html (2020).
  24. Giavarina, D., Lippi, G. Blood venous sample collection: Recommendations overview and a checklist to improve quality. Clinical Biochemistry. 50 (10-11), 568-573 (2017).
  25. Duijs, F. E., Sijen, T. A rapid and efficient method for DNA extraction from bone powder. Forensic Science International: Reports. 2, 100099(2020).
  26. Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol. , Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/infinium_assays/infinium_hd_methylation/infinium-hd-methylation-guide-15019519-01.pdf (2015).
  27. Serrano, J., Snuderl, M. Whole genome DNA methylation analysis of human glioblastoma using Illumina BeadArrays. Glioblastoma. , Humana Press. New York, NY. 31-51 (2018).
  28. Leti, F., Llaci, L., Malenica, I., DiStefano, J. K. Methods for CpG methylation array profiling via bisulfite conversion. Disease Gene Identification. 1706, 233-254 (2018).
  29. Noble, A. J., et al. A validation of Illumina EPIC array system with bisulfite-based amplicon sequencing. PeerJ. 9, 10762(2021).
  30. Tian, Y., et al. ChAMP: updated methylation analysis pipeline for Illumina BeadChips. Bioinformatics. 33, 3982-3984 (2017).
  31. Turinsky, A. L., et al. EpigenCentral: Portal for DNA methylation data analysis and classification in rare diseases. Human Mutation. 41 (10), 1722-1733 (2020).
  32. Tian, Y., et al. The Chip Analysis Methylation Pipeline. , Available from: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html (2020).
  33. Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22(2017).
  34. Wanding, Z., Triche, T. J., Laird, P. W., Hui, S. SeSAMe: reducing artifactual detection of DNA methylation by Infinium BeadChips in genomic deletions. Nucleic Acids Research. 46 (20), 123(2018).
  35. Heiss, J. A., Just, A. C. Improved filtering of DNA methylation microarray data by detection p values and its impact on downstream analyses. Clinical Epigenetics. 11, 15(2019).
  36. Houseman, E. A., et al. DNA methylation arrays as surrogate measures of cell mixture distribution. BMC Bioinformatics. 13, 86(2012).
  37. Valavanis, I., Sifakis, E. G., Georgiadis, P., Kyrtopoulos, S., Chatziioannou, A. A. A composite framework for the statistical analysis of epidemiological DNA methylation data with the Infinium human Methylation 450K BeadChip. IEEE Journal of Biomedical and Health Informatics. 18 (3), 817-823 (2014).
  38. Sun, N., Zhang, J., Zhang, C., Shi, Y., Zhao, B., Jiao, A., Chen, B. Using Illumina Infinium HumanMethylation 450K BeadChip to explore genomewide DNA methylation profiles in a human hepatocellular carcinoma cell line. Molecular Medicine Reports. 18 (5), 4446-4456 (2018).
  39. Moran, S., Arribas, C., Esteller, M. Validation of a DNA methylation microarray for 850,000 CpG sites of the human genome enriched in enhancer sequences. Epigenomics. 8 (3), 389-399 (2016).
  40. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  41. Lehne, B., et al. A coherent approach for analysis of the Illumina HumanMethylation450 BeadChip improves data quality and performance in epigenome-wide association studies. Genome Biology. 16 (1), 1-12 (2015).
  42. Wang, J., Zhang, H., Rezwan, F. I., Relton, C., Arshad, S. H., Holloway, J. W. Pre-adolescence DNA methylation is associated with BMI status change from pre- to post-adolescence. Clinical Epigenetics. 25, 64(2021).
  43. Maugeri, A. The effects of dietary interventions on DNA methylation: implications for obesity management. International Journal of Molecular Sciences. 21, 8670(2020).
  44. DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5133-5138 (2013).
  45. Kietzmann, T., Petry, A., Shvetsova, A., Gerhold, J. M., Görlach, A. The epigenetic landscape related to reactive oxygen species formation in the cardiovascular system. British Journal of Pharmacology. 174, 1533-1554 (2017).
  46. Chase, K., Sharma, R. P. Epigenetic developmental programs and adipogenesis: implications for psychotropic induced obesity. Epigenetics. 8 (11), 1133-1140 (2013).
  47. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453, 783-787 (2008).
  48. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289, 950-953 (2000).
  49. Bagchi, D. P., et al. Wnt/β-catenin signaling regulates adipose tissue lipogenesis and adipocyte-specific loss is rigorously defended by neighboring stromal-vascular cells. Molecular Metabolism. 42, 101078(2020).

重印与许可

标签

DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。