嗜碱性粒细胞活化试验在过敏诊断中的应用

摘要

嗜碱性粒细胞活化试验是一种补充性 体外 基于流式细胞术检测特定刺激下嗜碱性粒细胞活化标志物，用于评估IgE介导的过敏反应的诊断试验。

摘要

嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）是一种补充性的体外诊断方法，可用于评估由IgE介导的食物、昆虫毒液、药物以及某些类型的慢性荨麻疹过敏反应，可作为临床病史、皮肤试验（ST）和特异性IgE（sIgE）检测的辅助手段。然而，该技术在诊断流程中的作用存在较大差异，尚不明确。

嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）基于通过流式细胞术检测嗜碱性粒细胞对过敏原/药物交联IgE激活的反应，以测定其活化标志物（如CD63、CD203c）。该检测可作为避免进行受控激发试验 以确诊过敏反应的有用且互补的工具，尤其适用于经历严重危及生命反应的患者。通常情况下，当出现以下情形时应考虑进行BAT检测：i）该过敏原/药物在皮肤试验（ST）中产生假阳性结果；ii）缺乏可用于皮肤试验或特异性IgE（sIgE）检测的过敏原/药物来源；iii）患者的临床病史与皮肤试验或sIgE检测结果不一致；iv）患者的症状提示皮肤试验可能引发全身性反应；v）在考虑进行受控激发试验（CCT）以确认致敏过敏原/药物之前。该检测的主要局限性包括：敏感性欠佳，尤其是在药物过敏中；需在样本采集后24小时内完成检测；以及各实验室在操作流程、试剂浓度和细胞标志物选择方面缺乏标准化。

引言

IgE介导的过敏诊断基于临床病史、皮肤试验（STs）、血清特异性IgE（sIgE）定量检测，以及在必要且有指征时进行的受控激发试验（CCTs）^1,2,3,4,5,6然而，临床病史可能并不可靠，因为可能存在信息不准确的情况，且激发试验和结膜激发试验并非无风险的操作，在出现严重危及生命反应的受试者中可能属于禁忌。^1,2,3,4,5,6这些问题，加上经验证的商用荧光酶免疫测定法仅能检测少数过敏原和药物的sIgE，凸显了其他方法的重要作用 体外 功能检测，例如嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）。

方案

该方案的实施遵循赫尔辛基宣言原则，并已获得当地伦理委员会（Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga，西班牙）的批准。所有受试者均接受了关于研究内容的口头说明，并签署了相应的知情同意书。

注意：本方案详细描述了作者日常使用的嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）操作流程。然而，该方法并非标准化流程，与其他作者发表的方案存在差异。主要的方案修改包括刺激缓冲液中使用IL-3、刺激物孵育时间、终止嗜碱性粒细胞脱颗粒的方法以及流式细胞术分析策略。此外，不同商业来源的BAT试剂盒均包含制造商推荐的特定操作步骤。

1. 样品制备

1. 采集外周血至9 mL肝素抗凝管中，并将样本置于室温（RT）下旋转保存，直至实验方案需要时使用。
2. 标记5 mL流式管用于阴性对照（2管）、阳性对照（2管）以及不同浓度的过敏原/药物（每种过敏原/药物浓度各1管）。将试管放置于试管架中，确保试管完全贴合、不会滑动。
3. 在双蒸水中配制刺激缓冲液，含2%（v/v）HEPES、78 mg/L NaCl、3.7 mg/L KCl、7.8 mg/L CaCl₂、3.3 mg/L MgCl₂、1 g/L HSA。调节pH至7.4，并加入IL-3至终浓度为2 ng/mL。通常配制100 m....

结果

使用变应原或药物进行嗜碱性粒细胞活化试验（BAT），可用于研究IgE依赖性超敏反应。为获得最佳结果，应至少在两个最佳浓度下测定嗜碱性粒细胞的反应性³⁴，其活化通过细胞表面CD63的上调来显示。此外，在使用变应原的情况下，为确认嗜碱性粒细胞的反应性，还应通过检测多个递减浓度变应原下的反应性来分析嗜碱性粒细胞的敏感性¹¹⁴。该检测可确定诱导50%嗜碱性粒细胞发生反应的变应原浓度（EC50），该值可表示为“CD-sens”¹⁴¹。最近有研究提出，通过计算剂量-反应曲线下的面积（AUC）来同时评估嗜碱性粒细胞的反应性和敏感性⁵⁸。

用于分析BAT结果的流式细胞术策略如图1和图2所示，包括：从SSC-FSC图中圈选淋巴细胞（步骤1），从淋巴细胞群体中圈选CCR3⁺

讨论

BAT 是一种用于评估 IgE 介导的过敏反应的互补性体外诊断试验，已被证明在诊断由不同诱因（如药物、食物或吸入物）引起的过敏反应以及某些类型的慢性荨麻疹中具有实用价值。通常在以下情况下应考虑进行 BAT 检测：i）过敏原/药物在皮肤试验（ST）中产生假阳性结果；ii）过敏原/药物无法用于皮肤试验或特异性 IgE（sIgE）定量检测；iii）临床病史与皮肤试验或 sIgE 检测结果不一致；iv）临床症状提示皮肤试验可能诱发全身性反应；v）在进行受累过敏原/药物的确证性激发试验（CCT）之前¹⁰。

关于实验方案，为获得适用于检测的合适血液样本，需考虑若干重要方面。全身性类固醇¹⁴⁶ 以及免疫抑制剂，包括口服皮质类固醇，¹⁴⁷ 检测前应避免，因为会降低嗜碱性粒细胞反应¹⁴⁶ （抗组胺药和局部用类固醇不影响BAT检测结果）¹⁴⁶不应在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 圆底聚苯乙烯试管，无盖，非无菌	Corning	352008
APC 抗人 CD193 (CCR3) 抗体	BioLegend	310708
BD FACSCalibur 流式细胞仪	BD Biosciences
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
FITC 抗人 CD63 抗体	BioLegend	353006
HEPES (1 M)	Thermo-Fisher	15630106
溶血液，10 倍浓缩	BD Biosciences	349202
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸	Sigma-Aldrich	F3506
PE 抗人 CD203c (E-NPP3) 抗体	BioLegend	324606
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
纯化小鼠抗人 IgE 抗体	BD Biosciences	555857
重组人 IL-3	R&D Systems	203-IL
鞘液	BD Biosciences	342003
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
9 mL LH 锂肝素试管	Greiner Bio-One	455084
吐温 20	Sigma-Aldrich	P1379