本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。
本文内容
摘要
摘要
蚊子基因组学和基因工程技术的最新进展促使人们需要快速且高效的高通量方法来检测靶向DNA序列变异。具体而言，检测由CRISPR向导RNA（gRNA）/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）在基因编辑位点产生的插入和缺失（indel）对于评估诱变的准确性以及非预期改变的发生频率至关重要。本文介绍了一种适用于高通量NHEJ分析的微滴数字PCR（ddPCR）实验方案。尽管该方法无法提供识别单个序列变异的数据，但它能够对群体内的序列变异程度进行定量估算。此外，在具备适当资源的情况下，与下一代测序或桑格测序相比，该方案更易于在野外现场实验室环境中实施。ddPCR的结果周转时间也短于上述两种方法，从而可在转基因生物的野外试验期间对野生种群的遗传变异进行更快速、更全面的分析。
引言
基因驱动技术在控制具有医学和农业重要性的昆虫种群方面具有巨大潜力1,2,3,4,5。例如，基于CRISPR Cas核酸酶和向导RNA（gRNA）的基因驱动系统可用于改造传播疾病的蚊媒种群，通过引入对疟原虫具有抗性的性状，从而减少疾病传播并降低发病率1,4,5。该基因驱动系统可在减数分裂前的生殖细胞中将自身及关联性状从一条同源染色体复制到另一条，从而确保大多数后代继承该驱动元件，进而在野外实现持久且可持续的种群改造。然而，基于Cas/gRNA的方法存在一个缺点：通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制可能产生插入和缺失（indel）突变，导致出现对驱动系统具有抗性的等位基因；当这些抗性等位基因在种群中积累至足够高的频率时，便可能阻止基因驱动系统的进一步扩散1,2,3,4。本实验方案详细描述了一种高通量且可靠的方法，可用于在基于Cas/gRNA的基因驱动过程中，检测种群水平和个体水平上indel突变的发生频率及其相对含量。
新一代测序（NGS）技术提供了无与伦比的测序分辨率。然而，NGS相关的成本和技术要求限制了其作为常规检测手段的应用，也阻碍了其作为高通量方法用于插入缺失（indel）分析的推广6,7,8。传统的PCR定量方法长期以来被用作基因组插入缺失分析的标准评估手段；然而，这些方法耗时耗力，获取数据所需时间较长，且具有较高的变异性。数字微滴PCR（ddPCR）在某些应用中已被证明比Sanger测序更灵敏，并在其他一些情况下比NGS具有更低的检测限6,7,8,9。此外，与Sanger测序或NGS相比，ddPCR在样本集分析上的成本更低，结果周转时间也更短9。利用双探针系统，Drop-Off检测法通过检测gRNA引导的Cas9切割位点处野生型（WT）序列的缺失来识别NHEJ等位基因。在该检测中，使用一对特异性引物扩增包含Cas/gRNA系统预测切割位点的短扩增子 。其中一条荧光探针设计为结合扩增子中的保守区域，另一条荧光探针则识别切割位点的野生型序列。当存在NHEJ等位基因时，后者将无法与扩增子结合。
数字PCR（ddPCR）的应用使得研究人员能够设计引物以靶向缺失、单碱基对差异和插入序列，从而实现对蚊群分析中的非同源末端连接（NHEJ）进行谱型分析9。鉴于这些优势特性，我们建立了一套用于在蚊子中高通量检测由Cas/gRNA介导的基因驱动系统所产生的插入缺失（indel）的ddPCR实验方案。
方案
1. DNA 提取
- 按每份样品500 µL NLS和120 µL EDTA的比例配制EDTA/细胞核裂解缓冲液（EDTA/NLS）。若需处理多个样品，按比例放大体积。将混合液置于冰上预冷。
注意：根据体积不同，溶液在冰上冷却2-5分钟后会变浑浊。 - 将蚊虫样品置于含有600 µL预冷EDTA/NLS的1.5 mL微量离心管中，使用机械匀浆器匀浆10-15秒，并充分混匀。
- 向离心管中加入17.5 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，并充分混匀。
- 在55 °C下孵育过夜。或者，在55 °C下以振荡方式孵育3小时，每隔1小时涡旋混匀一次。
- 向室温样品中加入200 µL蛋白质沉淀溶液，并剧烈涡旋20秒。
- 将样品置于冰上冷却5分钟。
- 以15,890 RCF离心4分钟，使蛋白质沉淀。
- 小心吸取上清液（含DNA），转移至另一洁净的1.5 mL微量离心管中，该管内已加入600 µL异丙醇。
- 通过反复倒置离心管5-10次轻柔混匀溶液，然后以15,890 RCF离心1分钟。小心倾去上清液，注意保留DNA沉淀。
- 加入600 µL室温70%乙醇。通过轻轻倒置离心管清洗DNA沉淀。
- 以15,890 RCF离心1分钟，使用玻璃移液器吸头小心吸除上清液。
- 将离心管倒置于洁净的吸水纸上，室温空气干燥沉淀10-15分钟。
- 用PCR级水重悬DNA。单个蚊虫样品使用20 µL，10只混合蚊虫样品使用100 µL。
注意：使用市售试剂盒（见材料表）提取蚊虫样品DNA的方法，系根据制造商提供的“从组织培养细胞和动物组织中分离基因组DNA”方案进行调整。
2. 数字滴定PCR反应与液滴生成准备
- 使用荧光计定量DNA。
注意：对于脱扣检测（drop-off assay），建议每反应使用3,000–30,000个单倍体基因组拷贝的范围。该方法设计用于检测非同源末端连接（NHEJ）事件，采用HEX标记探针结合靶向切割位点的野生型（WT）序列；若靶位点发生缺失或插入，则探针无法退火（脱扣），从而指示存在NHEJ变异。 - 根据提取物中DNA的浓度和单倍体基因组质量计算拷贝数。具体方法为：将提取DNA的浓度乘以所用体积，得到总DNA质量，再除以单倍体基因组质量。确保加入的体积在1–10 µL之间。如必要，进行稀释以达到推荐的单倍体基因组拷贝数范围。
注意：据估计，每只成年按蚊（Anopheles gambiae）的单倍体基因组质量约为0.27 pg10。 - 设计引物和探针。设计上下游寡核苷酸引物，使其引物熔解温度（Tm）在55–60 °C之间，并分别位于gRNA靶位点的5'端和3'端两侧，扩增产物长度为150–400 bp。
- NHEJ检测用HEX（六氯荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与靶位点互补的寡核苷酸，在其5'端添加HEX荧光标记，3'端添加BHQ1（黑洞淬灭剂1）。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。
- 参考野生型（WT）检测用FAM（6-羧基荧光素）标记探针：设计一条长约15–20 bp、与远离靶位点（约25 bp）的保守基因组区域互补的寡核苷酸，在其5'端添加FAM荧光标记，3'端添加BHQ1。水解探针的Tm应比引物Tm高3–10 °C。
3. PCR 反应体系的准备
- 配制25 µL ddPCR样本混合液，包含以下组分：探针用ddPCR超级混合液（不含UTP）：12.5 µL，正向和反向引物（10 µM）：各1 µL，HEX/FAM探针（10 µM）：各0.625 µL，DNA：1–5 µL（3,750–37,500个单倍体基因组拷贝），加水至总体积25 µL。
- 通过涡旋振荡或反复吹打（上下移液20次）充分混匀反应体系。
注意：若反应体系位于96孔板中，建议通过将全部液体反复吹打20次进行混匀，避免涡旋产生气泡。 - 短暂离心样品，使混合液沉降至管底或孔底。
注意：确保反应体系处于室温条件下再进行液滴生成。每张芯片（每张芯片含8个孔）需额外为未使用孔准备1份ddPCR混合液。
4. 液滴生成
- 使用50 µL多通道移液器，将20 µL的ddPCR样品混合液加入到芯片的中间排（图1A，顶部）。
- 将70 µL油相加入到底部排，向未使用的孔中加入20 µL的1x ddPCR超混合液。
注意：避免产生气泡。 - 放置垫圈时仅接触边缘，避开中心凹陷区域（图1B）。
- 将板牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以启动运行。
- 使用多通道移液器，将40 µL乳化混合液从芯片的上排（图1A，底部）转移至96孔板中。
- 以45–30°角吸取液体样品3–5秒。然后以45°角缓慢将混合液沿孔壁排出超过3秒，使其沿壁滴下。可将移液器压至第二档（完全排空），以确保全部液体排出。
- 使用铝箔热封膜，在180 °C下密封板片5秒。
5. PCR
- 将密封的反应板放入热循环仪中（图1C），若遵循NHEJ Drop-Off操作指南，则设置以下推荐的PCR反应条件：
- 95 °C 初始变性 10 分钟。
- 设置 40 个循环：94 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 1 分钟，60 °C 延伸 2 分钟。
- 在 98 °C 保持 10 分钟。
- 在 4 °C 保持。
注意：针对特定引物和探针组合的退火温度可通过温度梯度优化。所有步骤的升温/降温速率均设置为 2 °C/s。PCR反应条件应根据具体的实验设计和配置进行相应调整。
6. 液滴读取
- 将反应板牢固地放入液滴读取仪中，确保A-1孔位于左上角（该角为光滑圆角，其余三个角为直角）（图1D）。
- 在程序中设置反应板：指定FAM为已知参考通道，HEX为未知通道（图2A）。
- 运行液滴读取实验，选择直接定量模式。运行结束后，将实验类型更改为Drop-Off（DOF）以进行数据分析（图2A）。
7. 分析
- 设定正确的实验参数（图2A）：样品信息、SuperMix、靶标名称（WT 或 NHEJ）、靶标类型（Ref 或 Unknown）、信号通道1（HEX 或 FAM）、信号通道2（HEX 或 FAM），并手动设置液滴计数阈值（建议高于 10,000 以获得可靠结果）。软件将根据设定的参数执行大部分分析。
- 在 液滴 选项卡中检查液滴数量；确保所有样品均高于 10,000（图2B）。
- 检查 1D 振幅，以实现与阴性信号的有效分离。
- 在 板编辑器 中，选中整块板，并将 实验类型 设置为 Drop off。
- 将 WT 靶标设为 参考，并指定通道一为 FAM，通道二为 HEX。
- 将 NHEJ 靶标设为未知，指定通道一为 FAM，通道二为空。
- 在 2D 振幅选项卡中，使用图形工具为每个样品设置 聚类阈值。注意与 WT 聚类相关的拖尾现象；这在 NHEJ 检测中属于正常情况（图3A）。
注意：在 比率 选项卡下，点击图表右上角的 齿轮图标，选择 相对丰度。此时图表将绘制出对应 NHEJ 事件百分比的点（图3B）。
结果
该实验方法的应用见 Carballar-Lejarazú 等人9。数字滴定 PCR（ddPCR）Drop-off 检测利用两种荧光探针来区分野生型（WT）和插入/缺失（indel）序列：FAM 探针结合扩增子内的保守序列，而 HEX 探针则靶向目标位点的野生型序列（图 4A）。当存在插入/缺失突变时，HEX 探针无法结合。代表性结果可参见 Carballar-Lejarazú 等人9的图 2、表 1 和表 2。使用本方案，ddPCR 已被证实能够检测多种由 CRISPR-Cas9 诱导的非同源末端连接（NHEJ）事件，并对个体或混合样本中的 NHEJ 频率进行定量。15 个不同的混合样本（每个样本含 10 只蚊子）包含多种 NHEJ 等位基因（见 Carballar-Lejarazú 等人9的表 2），采用本研究提供的 ddPCR 方案和参数进行分析。表 19 的结果显示，所有 15 个样本均携带 100% 的插入/缺失等位基因，该结果由 Drop-off 检测确认（图 4B）。在另一项实验中，使用本 ddPCR 方案检测了 11 个混合样本，这些样本包含野生型蚊子以及具有不同 NHEJ 比例（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 和 100%）的 NHEJ 蚊子，结果（图 2；Carballar-Lejarazú 等人9）显示，该方法测定的百分比与扩增子分析法检测插入/缺失（Indel Detection by Amplicon Analysis）这一对照技术的结果相近（图 4C）。
图1：实验装置与操作流程。（A）微滴生成用微孔板的制备。（上图）样品加入微孔板中间行，油相加入底部行。（下图）微滴生成后，顶部行充满乳化微滴。（B）已装入样品并盖好密封垫圈的微孔板置于微滴生成仪中。（C）96孔板经铝箔封膜后放入PCR仪中。（D）96孔板置于微滴读取仪中，金属盖板已锁紧以固定微孔板。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：液滴读取。（A）液滴读取的软件界面。橙色框表示含有样品的孔，灰色框为空孔。实验参数在右侧的编辑工具面板中设置。通过点击相应的样品框可对每个样品进行编辑。在实验类型中选择Drop Off（DOF）。在样品信息中，填写样品的名称、类型以及SuperMix。在检测信息中选择Basic Drop-Off。对于WT样品，在靶标名称中选择WT，在靶标类型中选择Ref，在信号通道1和通道2中分别选择FAM和HEX。对于NHEJ样品，在靶标名称中填写相应的名称，在靶标类型中选择Unknown，在信号通道1中选择FAM，信号通道2保持为None。（B）多个样品的液滴计数结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：脱扣（Drop-Off）检测分析。（A）野生型（WT）和非同源末端连接（NHEJ）等位基因的液滴计数聚类二维图。在“二维振幅”选项卡中，默认情况下所有液滴均未分类。本图中，颜色为手动分配以作区分。橙色点簇为野生型等位基因的计数，由FAM探针与参考序列及HEX探针与靶位点序列的结合获得。蓝色点代表液滴的信号值，这些液滴中FAM探针结合于参考序列，但HEX探针在靶位点序列处无结合（即HEX信号脱扣）。灰色点为无FAM或HEX结合的空液滴。（B）NHEJ事件的比率/丰度图。在比率选项卡下，选择分数丰度，可生成对应NHEJ事件百分比的图表。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：利用ddPCR进行转基因中非同源末端连接鉴定与定量的Drop-Off检测应用 Anopheles stephensi 行，AsMCRkh1。 (A) 微滴数字PCR（ddPCR）双探针系统Drop-Off法检测靶向DNA位点突变的示意图。使用正向和反向引物扩增长度为150–400 bp的扩增子。FAM标记的探针设计用于结合扩增子中的保守序列，而HEX标记的探针对应结合野生型（WT）gRNA靶向位点。B利用ddPCR检测多种类型的插入缺失突变。采用ddPCR液滴减少（Drop-Off）检测方法，对15组各含10只AsMCRkh1蚊子的样本池进行了分析，这些样本包含插入、缺失和替换等多种类型的插入缺失突变。突变详情及序列信息见Carballar的表2和表S3。 等.9. (C使用ddPCR及扩增子分析法检测插入缺失（Indel）技术，对不同比例（10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9 和 0:10）的AsMCRkh1与野生型（WT）蚊虫混合样品中的非同源末端连接（NHEJ）进行定量分析9图片改编自 Carballar-Lejarazú 等人。 生物技术. 68(4):172-179 (2020)9. 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 引物/探针 | 序列 (5’ » 3’) |
| ddPCR 正向引物 | ATGATCAAATGTCGACCG |
| ddPCR 反向引物 | ACCGTACTGGTTGAACA |
| ddPCR HEX 探针 (BHQ1) | [HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1] |
| ddPCR FAM 探针 (BHQ1) | [6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1] |
| HEX: 六氯荧光素, FAM: 6-羧基荧光素, BHQ: 黑洞淬灭剂 | |
表1：引物与探针序列。
讨论
数字液滴PCR是一种高效的方法，用于检测基于Cas/gRNA基因驱动系统中由NHEJ事件产生的插入缺失（indel）等位基因，并可对个体或群体中这些等位基因的频率进行定量。为获得可靠结果，该实验方案中的某些步骤需特别注意。首先，基因组DNA提取必须谨慎操作，以确保DNA的质量高且数量充足。良好的提取效果有助于准确测定每反应中的单倍体基因组拷贝数。根据我们的经验，使用市售试剂盒（见材料表）可 consistently 获得高质量的DNA提取结果。然而，单只蚊子的DNA提取尤为困难，因为DNA沉淀难以观察，若操作不慎，容易随上清液被吸走。其次，引物和探针的设计必须严谨。在开展ddPCR实验之前，应先通过常规PCR扩增并利用凝胶电泳观察产物，确认所设计的引物仅产生单一PCR产物。参考FAM探针也应设计为与高度保守序列互补，以确保在遗传多样性丰富的群体中能够准确检测野生型（WT）等位基因。每个独特实验所用的引物/探针组合可能需要不同的PCR仪热循环条件，建议使用温度梯度优化这些条件。
其他用于鉴定插入缺失（indel）的方法包括Sanger测序和高通量测序（NGS）。Sanger测序存在局限性，因其检测下限较高，且发现新变异的能力较弱。此外，Sanger测序劳动强度大，通量较低。与Sanger测序相比，NGS在灵敏度、变异发现能力和通量方面均无上述限制。NGS的另一优势在于其能够检测多种类型的突变，从单核苷酸多态性（SNPs）到基因组重排均可识别。然而，在检测Cas9/gRNA相关插入缺失的应用中，NGS成本较高且耗时较长，因为该应用场景通常仅涉及一个目标区域，而NGS更适用于大规模的全基因组分析。与前述方法相比，数字滴定PCR（ddPCR）具有高通量和快速周转的优点。若实验室内部具备ddPCR所需的试剂和仪器，可在1至2天内处理96个样本，因此特别适用于对大量Cas9/gRNA修饰生物体进行快速分析。
尽管数字滴定PCR（ddPCR）具有诸多优势，但也存在一些局限性。首先，ddPCR设备在独立实验室环境中并不常见。大型研究机构可能提供共用的ddPCR设备，但这限制了在机构外部便捷地进行数据生成与分析。其次，与其它方法不同，ddPCR无法提供所鉴定出的插入缺失（indel）突变的具体唯一序列信息。数字滴定PCR能够测定群体中插入缺失突变的频率，但若缺乏序列信息，则无法判断这些插入缺失更可能维持还是破坏目标基因的功能。ddPCR方法最适合用于Cas9/gRNA介导的基因驱动生物在野外释放试验后对野生群体的分析，因为它能够高效、近乎实时地确定转基因向本地群体中的引入频率以及群体内插入缺失的产生情况。由于ddPCR具有较快的检测周转时间，若本地可获得所需材料，则在野外试验区域每周进行采样并分析群体状况是可行的。尽管在偏远地区的实验室购置、进口和安装ddPCR设备的初期成本较高，但考虑到其在严格评估驱动系统作用下野生群体动态变化方面的优势，这一投入是值得的。
致谢
资金由加州大学欧文分校疟疾倡议项目提供。AAJ 是加州大学欧文分校的唐纳德·布伦教授。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA 提取试剂（例如 Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒） | Promega | A1120 | |
| EDTA（pH 8.0） | Invitrogen | AM9260G | |
| 乙醇，200 证明 | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| 异丙醇（符合 ACS 认证） | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| 细胞核裂解液（NLS）（Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒） | Promega | A1120 | |
| PCR 级水 | 可使用任何经认证的 PCR 级水 | ||
| 蛋白质沉淀溶液（Wizard Genomic DNA 纯化试剂盒） | Promega | A1120 | |
| 蛋白酶 K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| 材料 | |||
| ddPCR 96 孔板 | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 微流控芯片及垫圈 | Bio-Rad | 1864007 | |
| 用于探针的微滴生成油 | Bio-Rad | 1863005 | |
| 荧光探针（例如 FAM/HEX 探针） | Sigma-Aldrich | N/A | 探针根据实验而定，可从任何经认证的供应商处购买。 |
| 正向与反向寡核苷酸引物 | Sigma-Aldrich | N/A | 引物根据实验而定，可从任何经认证的供应商处购买。 |
| 设备 | |||
| C1000 Touch 梯度热循环仪 | Bio-Rad | 1851148 | 可使用其他具备梯度功能和深孔模块的热循环仪 |
参考文献
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
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- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
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- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
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