本论文描述了通过膀胱内给予携带lux操纵子的尿路致病菌以在小鼠中诱导尿路感染，并利用生物发光成像对细菌载量进行后续的纵向体内分析。
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本文内容
摘要
摘要
尿路感染（UTI）是人类最常见的细菌感染之一，通常采用经验性抗生素治疗。然而，由于微生物耐药性日益增加，最常用抗生素的疗效已有所下降。为了寻找替代治疗方案，迫切需要更深入地了解尿路感染的发病机制以及决定其易感性的相关机制。为了在动物模型中开展相关研究，建立一种可重复且非侵入性的检测方法以观察尿路感染的病程至关重要。
多年来，细菌载量计数的金标准一直是测定特定样本体积中的菌落形成单位（CFU）。该技术需要进行死后器官匀浆及系列稀释，限制了数据产出和可重复性。作为一种替代方法，生物发光成像（BLI）正逐渐被用于测定细菌载量。通过将病原体标记含有lux操纵子的基因，可实现灵敏、无创的检测与定量，从而支持纵向追踪观察。然而至今，BLI在尿路感染（UTI）研究中的应用仍然有限。
本文描述了生物发光成像（BLI）在小鼠尿路感染模型中的实际应用。文中提供了细菌培养、膀胱内灌注及成像的逐步操作指南。 体内 通过比较未经治疗的感染动物与抗生素治疗动物的细菌载量，检验其与CFU的相关性，并提供概念验证。此外，还探讨了在实施BLI时特有的优势、局限性和注意事项 体内 讨论了尿路感染模型。生物发光成像技术在尿路感染研究领域的应用将极大促进对尿路感染发病机制的研究，并推动预防和治疗尿路感染新方法的发现。
引言
尿路感染（UTI）是人类最常见的细菌感染之一。几乎一半的女性在一生中都会经历一次有症状的尿路感染。1局限于膀胱的感染可引起尿频、尿急、血尿、尿失禁和疼痛等泌尿系统症状。当感染上行至 upper urinary tract 时，患者可发展为肾盂肾炎，出现全身不适、发热、寒战和腰痛。此外，高达 20% 的 UTI 患者会经历反复感染，导致抗生素敏感性显著下降2,3,4近年来，人们对治疗和预防复发性尿路感染（UTI）的新疗法日益关注。尽管对下尿路的先天性和适应性免疫机制以及细菌侵袭和定植所必需的毒力因子有了更深入的理解，但这些进展尚未转化为泌尿科日常实践中的根本性治疗改变。2为了研究尿路感染的发病机制和易感性 在体内一种可重复且无创的检测方法是必不可少的。
已报道的多种动物尿路感染模型涵盖从线虫到灵长类动物的范围，但目前主要使用小鼠模型5,6。该模型通过经尿道插管（雌性）小鼠，并将细菌悬液直接注入膀胱腔内建立，最常用的病原菌为尿路致病性Escherichia c....
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方案
所有动物实验均按照欧盟共同体指南进行，并已获得鲁汶大学动物伦理委员会（P158/2018）的批准。
1. 细菌培养（改编自7,13,14）
- 准备
- 选择一种最符合实验需求的发光性尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株。
注意：此处选用临床膀胱炎分离株UTI89（E. coli），因其在人类和啮齿类动物中均具有尿路致病能力，并且在小鼠尿路感染模型中被广泛使用5,7,15。携带完整lux操纵子（luxCDABE）的生物发光同源菌株简称为UTI89-lux。该操纵子还携带硫酸卡那霉素（Km）抗性基因，因此可使用卡那霉素筛选生物发光菌落13。 - 为所选细菌菌株建立菌落形成单位（CFU）与600纳米波长下的光密度（OD 600 nm）之间的相关曲线7。
- 选择一种最符合实验需求的发光性尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株。
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结果
在体 BLI 与接种时接种物的 CFU 相关。
评估BLI的检测限 体内 以及与接种物CFU的相关性，用不同浓度的UTI89感染小鼠lux 以及 PBS 作为阴性对照。灌注前，对未感染动物进行扫描以确定背景发光值。随后的图像在灌注后立即获取（图1A）。在灌注UTI89-后lux，生物发光信号在2 x 10以上可被强烈检测到4 菌落形成单位（CFU），并建立了接种物的CFU与生物发光之间的线性相关性（图1B）。相比之下，用PBS灌注的动物以及在最低细菌浓度（2 x 10）下，总光子通量与背景信号相当3 菌落形成单位
生物发光成像作为治疗过程中纵向随访的工具
为了确定是否可以通过纵向生物发光成像（BLI）来展示已验证抗生素治疗的疗效，研究.......
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讨论
与CFU计数相比，生物发光成像（BLI）的优势
纵向数据
采用菌落形成单位（CFU）计数来量化微生物负荷的传统方法存在一个主要缺点，即需要制备动物的死后器官匀浆，因而每只动物仅能获得一个横断面数据点。相比之下，BLI可实现对感染动物的无创性纵向追踪。动物每天可被成像2至3次，从而提供关于感染动力学的详细信息。此外，对同一只动物进行重复测量可显著减少为达到足够统计效能实验所需的动物数量。同时，研究人员能够关注个体间的差异，并可在使用新型药物处理或检测动物之前，根据实时数据选择具有预设细菌负荷的动物。另一方面，利用实验的曲线下面积（AUC）可使研究人员关注整体细菌负荷，而非单一的横断面数值。在尿路感染（UTI）研究背景下，纵向和实时数据所带来的附加价值不可估量。
感染播散的鉴定
生物发光成像（BLI）所获得图像的空间分辨率足以识别由携带lux-或FLuc-标记的病原体定植的其他部位19。对于尿路感染（UTI），病原体.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了佛兰德研究基金会（FWO Vlaanderen；G0A6113N）、鲁汶大学研究委员会（C1-TRPLe；T.V. 和 W.E.）以及VIB（授予T.V.）的资助。W.E. 是佛兰德研究基金会（FWO Vlaanderen）的高级临床研究员。菌株UTI89-lux 由Seed教授实验室慷慨惠赠13。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔黑色平底聚苯乙烯板 | Corning | 3925 | 用于 体外 成像 |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | 毛发修剪器，配 GT608 型帽 |
| 麻醉蒸发器 | Harvard Apparatus Limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | 恩诺沙星 |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | 黄色静脉导管，用于滴注时使用无菌塑料针头 |
| C57Bl/6J 小鼠 | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R 离心机 | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | 用于测量 OD 600nm |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液，Gibco | ThermoFisher Scientific | 货号 14040-083 | |
| 70% 变性乙醇，5L | VWR International | 85825360 | |
| Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯管，带 snap-cap 盖 | Corning | 352057 | |
| Falcon 50 mL cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT 注射器，PTFE 鲁尔锁，100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | 确保以 50 µL 缓慢接种细菌 |
| 接种环 | Roth | 6174.1 | 支架：货号 6189.1 |
| Iso-Vet 1000 mg/g | Dechra Veterinary Products | N/A | 异氟烷 |
| IVIS Spectrum 活体成像系统 | PerkinElmer | 货号 124262 | 成像设备 |
| 卡那霉素溶液 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging 软件 | PerkinElmer | N/A | 生物发光成像采集软件，版本 4.7.3 |
| LB 肉汤培养基 | Sigma-Aldrich | 货号 L3022 | 也可自行配制 |
| 含琼脂的 LB 肉汤培养基 | Sigma-Aldrich | 货号 L2897 | 也可自行配制 |
| Sterilin 培养皿，90 mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | 用于盛装添加 Km 的 LB 琼脂 |
| Pyrex 细胞培养瓶，250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Trinean Slide 200 | Unchained Labs | 701-2007 | 用于测量 OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | 由 Seed 教授慷慨惠赠 |
| 涡旋振荡器 | VWR International | 444-1372 |
参考文献
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug ....
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