我们介绍了一种在器官型脑切片模型中实时测量乳腺癌脑转移细胞对药物和辐射反应的实验方案。该方法提供了一种定量分析手段，可在脑微环境界面中以离体（ex vivo）方式研究不同治疗手段对乳腺癌脑转移灶的治疗效果。
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摘要
摘要
脑转移是女性乳腺癌的严重后果，因为此类肿瘤难以治疗，且与不良的临床预后相关。乳腺癌脑转移（BCBM）生长的临床前小鼠模型虽具研究价值，但成本较高，且难以实时追踪脑实质内的活细胞及肿瘤细胞侵袭过程。本文介绍了一种方案 离体 来自颅内注射乳腺癌嗜脑克隆亚系的异种移植小鼠的脑切片培养物 MDA-MB-231BR 将表达荧光素酶标记的细胞颅内注射至 Nu/Nu 雌性小鼠脑内，待肿瘤形成后，分离脑组织并进行切片和培养 离体对肿瘤切片进行成像，以鉴定表达荧光素酶的肿瘤细胞，并监测其在脑实质中长达10天的增殖与侵袭情况。此外，本方案描述了利用延时显微成像技术，观察肿瘤细胞在接受电离辐射或化疗处理后的生长及侵袭行为。通过活体成像显微技术、生物发光强度测定以及含BCBM细胞的脑切片组织学分析，可直观评估肿瘤细胞对治疗的反应。因此，该 离体 脑切片模型可能是一种有效的平台，可用于快速单独测试新型治疗药物，或将其与放疗联合使用，以筛选出针对个体患者乳腺癌脑转移在脑微环境中的个性化靶向药物。
引言
乳腺癌脑转移（BCBM）是指细胞从原发性乳腺肿瘤扩散至大脑而形成的继发性病灶。乳腺癌是继肺癌之后导致脑转移的第二大常见原因，约有10-16%的患者会出现脑转移1不幸的是，脑转移仍然无法治愈，因为 >80%的脑转移患者在确诊后一年内死亡，且由于神经功能障碍导致其生活质量下降2迫切需要找到更有效的治疗方案。单层二维或三维培养模型是实验室中测试治疗药物最常用的方法。然而，这些模型无法模拟复杂的脑转移性肿瘤微环境，而该微环境是肿瘤表型和生长的主要驱动因素。尽管这些模型具有一定价值，但它们未能再现复杂的肿瘤-基质相互作用、独特的代谢需求以及肿瘤的异质性3为了更真实地模拟肿瘤-间质相互作用及微环境异质性，本课题组及其他研究团队已开始构建类器官脑转移模型 "切片" 使用患者来源的肿瘤细胞（原发性或转移性）或癌细胞系进行培养4,5,6与经典方法相比 体外 系统，这种短期 离体 该模型可能在大动物群进行临床前评估之前，为筛选新的治疗方法提供更相关的条件。
离体（ex vivo）模型已被构建并....
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方案
本方案已获得德雷塞尔大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其动物护理指南。本研究使用了6至8周龄的雌性Nu/Nu裸鼠。
1. 肿瘤细胞的颅内注射
- 将所有器械（镊子、剪刀、缝合剪、手钻）放入灭菌袋中，在高压灭菌器内进行干热灭菌循环，时间最长为45分钟，同时包含灭菌指示剂。若对多只动物进行手术，每次更换动物时需使用加热珠灭菌器对器械进行灭菌（最多3次）。
- 根据使用者的动物护理方案对小鼠实施麻醉（例如异氟烷，诱导浓度4%，维持浓度1-2%），并在手术开始前给予镇痛处理（皮下注射，0.1 mL，剂量为0.1 mg/kg的缓释型丁丙诺啡SR-LAB）。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否适宜。
- 将小鼠固定于立体定位仪中，使用标准耳杆固定头部（图1A），并在 眼睛表面涂抹眼用软膏。
- 在切口前，交替使用碘伏棉签和70%乙醇对头部表面进行三次重复消毒。
- 使用手术刀沿假想中线（将小鼠大脑分为左右对称两半的虚拟线）呈轻微斜角做一条长约1 cm的正中切口，以暴露颅骨。用棉签擦去血液。
- 将皮肤向侧方牵开，暴露注射部位：以颅骨前囟为参考点，向右2 mm，向前1 mm（+2 内外侧方向 (+2ML)，+1 前后方向 (+1RC)）。
- 使用直径0.73 mm的磨钻钻头，在前囟点....
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结果
如上所述（图1A），将MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase细胞颅内注射至4-6周龄Nu/Nu小鼠的右侧大脑半球，并让其生长12-14天，在此期间通过生物发光成像监测肿瘤生长情况（图1B）。我们按照其他研究团队报道的方法颅内注射100,000个癌细胞19，但也可低至注射20,000个细胞20。在生成脑切片后（图1C），如上所述，将切片置于IVIS系统中成像，通过24小时孵育后的生物发光成像确认肿瘤的存在，此时间点记为第0天。每48小时定量检测一次生物发光信号以监测肿瘤生长，结果显示在6天内呈进行性生长（图1D）。H&E染色与GFP阳性荧光证实脑切片中存在肿瘤（图1D）。我们还检测到反应性星形胶质细胞的染色增强，通过胶质纤维酸.......
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讨论
本研究建立了一种新的ex vivo脑组织培养方法，用于移植性异种脑肿瘤的体外培养。我们证明，将MDA-MB-231BR乳腺癌脑转移（BCBM）细胞经颅内注射至小鼠脑内后，这些细胞可在ex vivo脑切片中存活并生长。本研究还测试了经颅内注射的U87MG胶质母细胞瘤（GBM）细胞，同样发现这些癌细胞可在脑切片中存活并增殖（数据未显示）。我们认为，该模型不仅可用于BCBM和GBM，还可拓展至其他易发生脑转移的癌症类型，包括肺癌和黑色素瘤。选择乳腺癌嗜脑细胞进行颅内注射，是因为该方法操作简便、成瘤快速，且被公认为适用于脑大转移灶研究的合适模型25。然而，类似的肿瘤切片模型也可通过心内接种或原位注射至乳腺脂肪垫的方式建立。通过在无血清培养基中培养成年脑切片，并每48小时更换新鲜培养基，优化了培养条件，从而更好地维持了组织活性以及肿瘤的存活与生长。在培养箱高氧条件下使用的0.4 µm插入式培养插件，既为ex vivo脑切片提供了结构支撑，也实现了营养物质和氧气的人工供给，弥补了缺乏血液供应的不足，该系统似乎足以维持组织活性至少十天。活体成像通过G.......
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披露
作者声明无经济利益冲突。
致谢
感谢 Julia Farnan、Kayla Green 和 Tiziana DeAngelis 提供的技术支持。本工作部分由宾夕法尼亚州通用研究增强拨款计划（MJR、JGJ）、UO1CA244303（MJR）、R01CA227479（NLS）、R00CA207855（EJH）以及 W.W. Smith 慈善信托基金（EjH）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器，滑动接头 | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 针头 | BD | 305106 | |
| 6孔板 | 杰内西 | 25-105 | |
| 自动化显微镜和LUMAVIEW软件 | Etaluma | LS720 | |
| B27（GEM21） | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| 50 mL 烧杯 | Fisher | 10-210-685 | |
| 细尖貂毛画笔，5/0号 | 电子显微镜科学公司 | 66100-50 | |
| 骨蜡 | ModoMed | DYNJBW25 | |
| 脑内注射注射器 | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| 裂解型caspase 3抗体 | 细胞信号传导 | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-荧光素钾盐 | Perkin Elmer | 122799 | |
| 双刃剃须刀片 | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| 滤纸（#1），定量圆片，4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| 细毛獾毛画笔 #2/0 | 电子显微镜科学 | 66100-20 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| γ-H2AX 抗体 | Millipore | 05-636 | |
| GFAP 抗体 | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP 抗体 | Santa Cruz | SC-9996 | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8270 | |
| 谷氨酰胺（200 mM） | 康宁 CellGrow | 25-005-Cl | |
| H&E 和 KI-67 | 杰斐逊核心设施病理染色 | ||
| 微型手持电钻套装及微小麻花钻头 | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES，游离酸 | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| 仅用于小鼠的立体定位仪框架 | Harvard Apparatus（美国马萨诸塞州霍利斯顿） | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| 大型手术剪刀 | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR 细胞 | 由 Patricia Steeg 博士惠赠 | 参考文献 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| 小鼠成像设备 | Perkin Elmer | IVIS 200 系统 | |
| 小鼠成像软件 | Caliper Life Sciences（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | Living Image 软件 | |
| 微孔板读板仪 | Tecan Spark | ||
| 封片液 | Invitrogen | P36935 | |
| MTS试剂 | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | （货号：G3582） | |
| N2 补充剂 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal 培养基 | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu 裸鼠 | 查尔斯河实验室（美国马萨诸塞州威尔明顿） | ||
| 多聚甲醛 | Affymetrix | 19943 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 145140-122 | |
| 聚丙烯缝合线 | Medex 供应 | ETH-8556H | |
| 聚维酮碘棉签 | DME Supply USA | 产品编号：689286X | |
| 手术刀片 #11（每包 100 片） | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 手术刀柄 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | S8636 | |
| 刮勺/探针 | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS 双面未涂层剃须刀片（American Safety Razor Co (95-0043)） | VWR | 55411-060 | |
| 蔗糖 | Amresco | 57-50-1 | |
| 手术刀 | Exelint International | D29702 | |
| 组织切片刀 | Brinkman | （McIlwain型） | |
| 组织培养小室 | Millipore | PICMORG50 或 PICM03050 | |
| X射线机 | 精确 250 kVp |
参考文献
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al.
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