我们介绍了一种在器官型脑切片模型中实时测量乳腺癌脑转移细胞对药物和辐射反应的实验方案。该方法提供了一种定量分析手段，可在脑微环境界面中以离体（ex vivo）方式研究不同治疗手段对乳腺癌脑转移灶的治疗效果。
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摘要
摘要
脑转移是女性乳腺癌的严重后果，因为此类肿瘤难以治疗，且与不良的临床预后相关。乳腺癌脑转移（BCBM）生长的临床前小鼠模型虽具研究价值，但成本较高，且难以实时追踪脑实质内的活细胞及肿瘤细胞侵袭过程。本文介绍了一种方案 离体 来自颅内注射乳腺癌嗜脑克隆亚系的异种移植小鼠的脑切片培养物 MDA-MB-231BR 将表达荧光素酶标记的细胞颅内注射至 Nu/Nu 雌性小鼠脑内，待肿瘤形成后，分离脑组织并进行切片和培养 离体对肿瘤切片进行成像，以鉴定表达荧光素酶的肿瘤细胞，并监测其在脑实质中长达10天的增殖与侵袭情况。此外，本方案描述了利用延时显微成像技术，观察肿瘤细胞在接受电离辐射或化疗处理后的生长及侵袭行为。通过活体成像显微技术、生物发光强度测定以及含BCBM细胞的脑切片组织学分析，可直观评估肿瘤细胞对治疗的反应。因此，该 离体 脑切片模型可能是一种有效的平台，可用于快速单独测试新型治疗药物，或将其与放疗联合使用，以筛选出针对个体患者乳腺癌脑转移在脑微环境中的个性化靶向药物。
引言
乳腺癌脑转移（BCBM）是指细胞从原发性乳腺肿瘤扩散至大脑而形成的继发性病灶。乳腺癌是继肺癌之后导致脑转移的第二大常见原因，约有10-16%的患者会出现脑转移1不幸的是，脑转移仍然无法治愈，因为 >80%的脑转移患者在确诊后一年内死亡，且由于神经功能障碍导致其生活质量下降2迫切需要找到更有效的治疗方案。单层二维或三维培养模型是实验室中测试治疗药物最常用的方法。然而，这些模型无法模拟复杂的脑转移性肿瘤微环境，而该微环境是肿瘤表型和生长的主要驱动因素。尽管这些模型具有一定价值，但它们未能再现复杂的肿瘤-基质相互作用、独特的代谢需求以及肿瘤的异质性3为了更真实地模拟肿瘤-间质相互作用及微环境异质性，本课题组及其他研究团队已开始构建类器官脑转移模型 "切片" 使用患者来源的肿瘤细胞（原发性或转移性）或癌细胞系进行培养4,5,6与经典方法相比 体外 系统，这种短期 离体 该模型可能在大动物群进行临床前评估之前，为筛选新的治疗方法提供更相关的条件。
离体（ex vivo）模型已被构建并成功应用于多种癌症治疗方案的筛选。该模型仅需数天即可完成评估，还可针对患者个体化药物筛选进行定制。例如，人膀胱癌和前列腺癌的离体（ex vivo）组织已显示出对多西他赛和吉西他滨呈剂量依赖性的抗肿瘤反应7。类似地，结直肠癌离体（ex vivo）组织模型已被用于奥沙利铂、西妥昔单抗和帕博利珠单抗等化疗药物的筛选8。鉴于胰腺导管腺癌的基因型和表型特征与其间质微环境之间存在重要相互作用，该技术已在胰腺癌研究中得到广泛应用9,10。此外，类似的器官型模型也已用于头颈部肿瘤、胃癌及乳腺癌等肿瘤的药物筛选研究11,12。
此处，一种 离体 在微环境中外植乳腺癌脑转移瘤细胞的脑切片模型正在构建中。小鼠经颅内注射乳腺癌脑转移嗜脑性 MDA-MB-231BR 细胞13 大脑皮层顶叶——三阴性乳腺癌转移的常见部位14,15 并允许其形成肿瘤。从这些异种移植动物中制备脑切片并进行培养 离体 如所述的类器官培养16,17. 这一新型 离体 该模型可用于分析脑实质内BCBM细胞的生长情况，并可用于测试治疗药物及辐射对脑微环境中肿瘤细胞的作用效果。
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方案
本方案已获得德雷塞尔大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其动物护理指南。本研究使用了6至8周龄的雌性Nu/Nu裸鼠。
1. 肿瘤细胞的颅内注射
- 将所有器械（镊子、剪刀、缝合剪、手钻）放入灭菌袋中，在高压灭菌器内进行干热灭菌循环，时间最长为45分钟，同时包含灭菌指示剂。若对多只动物进行手术，每次更换动物时需使用加热珠灭菌器对器械进行灭菌（最多3次）。
- 根据使用者的动物护理方案对小鼠实施麻醉（例如异氟烷，诱导浓度4%，维持浓度1-2%），并在手术开始前给予镇痛处理（皮下注射，0.1 mL，剂量为0.1 mg/kg的缓释型丁丙诺啡SR-LAB）。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否适宜。
- 将小鼠固定于立体定位仪中，使用标准耳杆固定头部（图1A），并在 眼睛表面涂抹眼用软膏。
- 在切口前，交替使用碘伏棉签和70%乙醇对头部表面进行三次重复消毒。
- 使用手术刀沿假想中线（将小鼠大脑分为左右对称两半的虚拟线）呈轻微斜角做一条长约1 cm的正中切口，以暴露颅骨。用棉签擦去血液。
- 将皮肤向侧方牵开，暴露注射部位：以颅骨前囟为参考点，向右2 mm，向前1 mm（+2 内外侧方向 (+2ML)，+1 前后方向 (+1RC)）。
- 使用直径0.73 mm的磨钻钻头，在前囟点+2ML、+1RC处施加轻微压力并旋转钻孔，穿透颅骨。
- 使用脑部注射器，将5 µL含100,000个MDA-MB-231BR细胞（稳定表达GFP-荧光素酶）/µL的无菌1×PBS溶液注入脑内，初始进针深度为3.5 mm。
- 让注射器静置2分钟，然后缓慢上提约1 mm，再静置2分钟后，缓慢注入第一半体积的细胞悬液。
- 在注入剩余液体前再等待2分钟，最终注射完成后3分钟再缓慢拔出注射器。
注意：缓慢注射是经验性操作，有助于液体被脑组织充分吸收，避免拔针后发生渗漏，从而防止癌细胞在目标区域外生长。 - 在颅骨注射部位涂抹骨蜡，随后使用聚丙烯缝线缝合组织。麻醉停止后，小鼠通常在5分钟内恢复意识。
- 术后立即观察其行为约10分钟，3小时后及次日再次观察，判断是否需要特殊护理措施（如生理盐水注射、软质食物等）以促进快速恢复。
- 通过成像系统进行生物发光成像以监测肿瘤生长情况。
- 首先，打开成像系统的氧气和异氟烷气源，使气体输送至成像箱外的独立麻醉室。
- 然后启动软件，初始化仪器，并选择适合整体小鼠成像的选项。
- 将小鼠放入含有异氟烷的独立麻醉室中，通过脚趾夹捏测试确保麻醉深度适宜，随后经腹腔注射200 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液。
- 将小鼠腹部朝下转移至成像室的鼻罩接口处，该接口持续供应氧气和异氟烷。关闭成像室，设置曝光时间为2分钟，开始成像。
- 使用软件中的ROI（感兴趣区域）工具定量分析肿瘤的生物发光信号。
- 为分析肿瘤大小，选择圆形工具，将其调整至覆盖肿瘤的形状与范围，测量ROI并记录总信号值。
- 允许实体瘤生长12–14天（或直至荧光素酶信号达到约7.0 × 106 单位）（图1B），然后制备脑切片。
注意：增加注射细胞数量将加快肿瘤生长速度，因此脑切片制备可早于12天进行；相反，若允许肿瘤生长至14天，则可获得更多的GFP阳性切片。超过14天后，小鼠健康状况会迅速恶化，因此自第10天起应将健康监测频率提高至每日一次，任何出现疼痛和/或不适症状的小鼠应及时用于脑切片制备。
2. 制备脑切片
注意：脑组织分离后的所有操作步骤均须在无菌超净工作台中进行。通常情况下，一只注射了MDA-MB-231BR细胞的小鼠可获得35–40个含有肿瘤细胞（荧光素酶信号）的独立脑片（图1C）。
- 在高压灭菌器中对所有手术器械进行灭菌。将组织切片器置于无菌超净工作台内，并使用70%乙醇清洁所有器械和仪器。
- 颅内注射 MDA-MB-231BR 细胞后 12–14 天，根据用户单位的动物护理方案（如 1.2 节所述）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否适宜。
- 迅速取出大脑（在45秒内）并立即放入冰冻（4 °C）的蔗糖-ACSF溶液中，其成分为：280 mM 蔗糖，5 mM KCl，2 mM MgCl₂2，1 mM CaCl2，20 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，5 mM Na+-抗坏血酸，3 mM 硫脲，2 mM Na+，29 mM 丙酮酸盐；pH = 7.3。
- 使用锋利且无菌的手术刀或剃须刀片，从各个方向（包括脑组织底部）切除不含肿瘤的多余脑组织部分。
- 将脑组织修整为接近立方体的形状，置于60 mm培养皿盖内浸有ACSF的滤纸上，使其平稳放置，便于切片。
注意：在切片前需切除肿瘤不易生长的脑部多余组织，以获得 predominantly GFP+ 的切片，并使脑组织形成稳定的形状，能够稳固地放置于仪器表面，避免切片过程中因振动而发生移位。 - 将数张用ACSF预湿的滤纸片放置在切片平台上，然后将组织块置于其上。
- 将仪器上的切割尺寸设置为所提供标尺上的2或2.5单位，以将组织切成200–250 µm的切片。
注意：厚度在100 µm至350 µm范围内的切片均具有活性。对于切片 <200 µm，使用振动切片机或压缩切片机。 - 使用貂毛画笔将脑切片转移至含有蔗糖人工脑脊液（sucrose ACSF）的培养皿中，并在体视显微镜下用27 G针头分离切片。
- 在荧光显微镜下鉴定GFP阳性脑片，使用无菌的1 mL断口移液管（宽口）将其转移至新的60 mm培养皿中，培养皿内含2–3 mL成年脑片培养基（Neurobasal medium A、2% B12补充剂、1% N2补充剂、1%谷氨酰胺、0.5%葡萄糖、10 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。
注意：包含肿瘤细胞在脑表面生长的脑切片（可能由于细胞注射泄漏等原因造成）将被排除。 - 将3-5个切片转移至每个6孔板中直径为30 mm、孔径为0.4 µm的组织培养插入式培养皿上，切片之间保持一定距离，避免相互接触生长。
- 使用 P1000 移液器移除插入物表面多余的培养基，于每个插入物下方加入 1 mL 成年小鼠脑片培养基，并在切片前将培养基于培养箱中平衡。
- 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育组织2, 并在成像前于95%湿度下培养24小时。
3. 切片的IVIS成像
注意：荧光素酶和抑制剂的添加步骤需在无菌的层流罩中进行。
- 用镊子轻轻提起小室，将5 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液加入小室下方的培养基中，加样完毕后将小室放回孔中。
- 将6孔板连同盖子一起放入成像仪的成像室内，置于固定相机下方，并锁紧室门。
- 打开软件并初始化仪器。
- 选择合适的相机设置，使每次成像仅显示一个孔的视野。将载物台上升（视野范围5 cm），并将需要成像的孔准确置于相机正下方。
- 根据肿瘤表达的荧光素酶信号强度设置合适的成像时间，通常在10秒至5分钟之间。建议初始设置为10秒，若信号较弱可逐步延长，但在整个实验过程中对所有时间点和实验条件应保持成像时间一致（图1D）。
- 使用ROI工具（圆形工具），将其调整至与肿瘤的形状和大小相匹配，测量该区域，并记录总信号值，以定量分析每块组织切片上肿瘤的生物发光信号。
- 将6孔板移回无菌超净工作台，用镊子轻轻将小室从孔中提起。
- 吸除旧培养基，加入1 mL新鲜培养基，并将小室重新放回孔中。
- 对于需要给予不同化合物（如抑制剂、代谢物等）处理的实验，先在1.5 mL离心管中用1.2 mL脑片培养基配制适当浓度的试剂，然后将1 mL该溶液转移至含有组织切片的孔中。
- 在研究期间，每隔48小时重复一次上述操作。
4. 肿瘤生长的活体成像 离体 脑切片
注意：插入物需加入足量培养基（1.5 mL），以维持整个实验期间的需求，因为在活细胞成像过程中无法补充额外培养基。
- 将6孔板放置于培养箱内的自动显微镜载板架上（37 °C，5% CO2, 和95%湿度）。
- 打开软件，在第一象限开启明场，调整观察切片所需的曝光度。为确定切片的位置（坐标"xy"），在第二象限使用"xy"来控制显微镜的"xyz"坐标。
- 选择6孔板作为本实验所用耗材。选择ROI地图编辑器，并通过添加新的ROI来注册该位置，然后保存该ROI。
- 对其他孔中的所有其他感兴趣区域重复上述步骤。在添加完所有ROI后，保存全部ROI。
- 在“协议”（Protocol）中选择清除现有，在采集下选择延时成像，然后选择感兴趣的通道（本例中为GFP）。
- 在聚焦设置中关闭自动对焦，并手动为所有切片调整至合适的焦距。最后，将明场强度、荧光通道激发和曝光时间调节至适当水平。
- 设置协议以每15分钟采集一次图像，持续48小时。
- 保存并运行该协议。实验结束后，保存的文件将包含为每个ROI采集的明场和GFP图像。
- 为将图像合成为视频，将所有感兴趣图像重命名为相同的名称，后接二进制编号，以便按采集顺序排列（例如：ROI1 (1)，ROI1 (2) ...）。
- 打开ImageJ，点击文件 > 导入 > 图像序列来导入图像。在出现的文件列表中选择相应文件，并将文件名内容填写至弹出的文件名包含框中，以识别选定用于视频的文件。
- 在文件 > 另存为 > AVI下保存合并后的图像。
5. MTS 检测与免疫组织化学分析 离体 脑组织
- MTS 检测
- 通过沿组织边缘切割组织培养膜下方的方式取出切片，并将仍附着于膜上的组织转移至96孔板中。
- 加入按1:5比例与培养基混合并含有0.01%吐温（Triton）（1×）的MTS试剂，以促进溶液渗透入组织，每孔总体积为120 µL。
- 使用4%多聚甲醛（PFA）作为使脑切片失活的试剂，作为本实验的阳性对照。在进行MTS检测前，将目标脑切片在4% PFA中室温孵育1小时，或4 °C过夜。
- 使MTS试剂与切片反应4小时，随后将切片从孔中取出，测量所有条件下的吸光度（490 nm），包括无切片的空孔作为参考。
- 将读数表示为组织切片面积的函数，面积使用数显卡尺测量。
- 免疫组织化学制备
- 将附着于膜插件表面的脑切片在4 °C条件下浸入10%福尔马林中过夜。
- 进行包埋、处理、封闭，并制备未染色的组织切片。采用标准免疫组织化学染色方案对H&E、Ki-67、γ-H2AX、CC3、GFAP、GFP、DAPI进行染色。
6. 肿瘤照射 离体 脑切片
- 用6 Gy（310 kVp X射线）照射肿瘤。
注意：在考虑R单位（使用Victoreen静电计测量）以及对指形电离室、空气密度和cGy/R的校正后，获得6 Gy总剂量所需的单位为3522单位18。照射时间为130.9秒。 - 使用0.25 mm铜 + 1 mm铝附加滤过，源-皮肤距离（SSD）为50 cm，剂量率为125 cGy/分钟。
- 通过已与一级标准校准的束内电离室进行剂量测定。
- 每日对湿度、温度和大气压进行校正。
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结果
如上所述（图1A），将MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase细胞颅内注射至4-6周龄Nu/Nu小鼠的右侧大脑半球，并让其生长12-14天，在此期间通过生物发光成像监测肿瘤生长情况（图1B）。我们按照其他研究团队报道的方法颅内注射100,000个癌细胞19，但也可低至注射20,000个细胞20。在生成脑切片后（图1C），如上所述，将切片置于IVIS系统中成像，通过24小时孵育后的生物发光成像确认肿瘤的存在，此时间点记为第0天。每48小时定量检测一次生物发光信号以监测肿瘤生长，结果显示在6天内呈进行性生长（图1D）。H&E染色与GFP阳性荧光证实脑切片中存在肿瘤（图1D）。我们还检测到反应性星形胶质细胞的染色增强，通过胶质纤维酸...
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讨论
本研究建立了一种新的ex vivo脑组织培养方法，用于移植性异种脑肿瘤的体外培养。我们证明，将MDA-MB-231BR乳腺癌脑转移（BCBM）细胞经颅内注射至小鼠脑内后，这些细胞可在ex vivo脑切片中存活并生长。本研究还测试了经颅内注射的U87MG胶质母细胞瘤（GBM）细胞，同样发现这些癌细胞可在脑切片中存活并增殖（数据未显示）。我们认为，该模型不仅可用于BCBM和GBM，还可拓展至其他易发生脑转移的癌症类型，包括肺癌和黑色素瘤。选择乳腺癌嗜脑细胞进行颅内注射，是因为该方法操作简便、成瘤快速，且被公认为适用于脑大转移灶研究的合适模型25。然而，类似的肿瘤切片模型也可通过心内接种或原位注射至乳腺脂肪垫的方式建立。通过在无血清培养基中培养成年脑切片，并每48小时更换新鲜培养基，优化了培养条件，从而更好地维持了组织活性以及肿瘤的存活与生长。在培养箱高氧条件下使用的0.4 µm插入式培养插件，既为ex vivo脑切片提供了结构支撑，也实现了营养物质和氧气的人工供给，弥补了缺乏血液供应的不足，该系统似乎足以维持组织活性至少十天。活体成像通过G...
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披露
作者声明无经济利益冲突。
致谢
感谢 Julia Farnan、Kayla Green 和 Tiziana DeAngelis 提供的技术支持。本工作部分由宾夕法尼亚州通用研究增强拨款计划（MJR、JGJ）、UO1CA244303（MJR）、R01CA227479（NLS）、R00CA207855（EJH）以及 W.W. Smith 慈善信托基金（EjH）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器，滑动接头 | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 针头 | BD | 305106 | |
| 6孔板 | 杰内西 | 25-105 | |
| 自动化显微镜和LUMAVIEW软件 | Etaluma | LS720 | |
| B27（GEM21） | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| 50 mL 烧杯 | Fisher | 10-210-685 | |
| 细尖貂毛画笔，5/0号 | 电子显微镜科学公司 | 66100-50 | |
| 骨蜡 | ModoMed | DYNJBW25 | |
| 脑内注射注射器 | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| 裂解型caspase 3抗体 | 细胞信号传导 | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-荧光素钾盐 | Perkin Elmer | 122799 | |
| 双刃剃须刀片 | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| 滤纸（#1），定量圆片，4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| 细毛獾毛画笔 #2/0 | 电子显微镜科学 | 66100-20 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| γ-H2AX 抗体 | Millipore | 05-636 | |
| GFAP 抗体 | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP 抗体 | Santa Cruz | SC-9996 | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8270 | |
| 谷氨酰胺（200 mM） | 康宁 CellGrow | 25-005-Cl | |
| H&E 和 KI-67 | 杰斐逊核心设施病理染色 | ||
| 微型手持电钻套装及微小麻花钻头 | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES，游离酸 | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| 仅用于小鼠的立体定位仪框架 | Harvard Apparatus（美国马萨诸塞州霍利斯顿） | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| 大型手术剪刀 | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR 细胞 | 由 Patricia Steeg 博士惠赠 | 参考文献 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| 小鼠成像设备 | Perkin Elmer | IVIS 200 系统 | |
| 小鼠成像软件 | Caliper Life Sciences（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆） | Living Image 软件 | |
| 微孔板读板仪 | Tecan Spark | ||
| 封片液 | Invitrogen | P36935 | |
| MTS试剂 | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | （货号：G3582） | |
| N2 补充剂 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal 培养基 | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu 裸鼠 | 查尔斯河实验室（美国马萨诸塞州威尔明顿） | ||
| 多聚甲醛 | Affymetrix | 19943 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 145140-122 | |
| 聚丙烯缝合线 | Medex 供应 | ETH-8556H | |
| 聚维酮碘棉签 | DME Supply USA | 产品编号：689286X | |
| 手术刀片 #11（每包 100 片） | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 手术刀柄 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich | S8636 | |
| 刮勺/探针 | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS 双面未涂层剃须刀片（American Safety Razor Co (95-0043)） | VWR | 55411-060 | |
| 蔗糖 | Amresco | 57-50-1 | |
| 手术刀 | Exelint International | D29702 | |
| 组织切片刀 | Brinkman | （McIlwain型） | |
| 组织培养小室 | Millipore | PICMORG50 或 PICM03050 | |
| X射线机 | 精确 250 kVp |
参考文献
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