用于研究哺乳动物细胞内吞再循环的密度梯度超速离心法

摘要

本文旨在介绍一种利用蔗糖密度梯度超速离心法从哺乳动物细胞中制备循环内体的实验方案。

摘要

内体运输是一种调控多种生物学事件的重要细胞过程。蛋白质从质膜被内吞后，转运至早期内体。这些被内吞的蛋白质可进一步转运至溶酶体进行降解，或被循环回收至质膜。一个高效的内吞循环通路对于平衡内吞过程中膜成分的移除至关重要。已有多种蛋白质被报道参与调控该通路，其中包括ADP核糖基化因子6（ARF6）。密度梯度超速离心是一种经典的细胞组分分离方法。离心后，细胞器会沉降到其等密度界面处。收集所得的组分可用于后续多种下游实验。本文所述是一种利用密度梯度超速离心法从转染的哺乳动物细胞中分离含回收内体组分的实验方案。分离得到的组分通过标准Western印迹法分析其蛋白质组成。采用该方法，我们发现吞噬及细胞运动相关蛋白1（ELMO1）——一种Ras相关C3肉毒毒素底物1（Rac1）鸟嘌呤核苷酸交换因子——定位于质膜的过程依赖于ARF6介导的内吞循环通路。

引言

内体运输是一种重要的生理过程，涉及多种生物学事件¹，例如信号受体、离子通道和黏附分子的转运。定位于质膜的蛋白质通过内吞作用被内化²。内化的蛋白质随后由早期内体进行分选³。其中一部分蛋白质被靶向至溶酶体进行降解⁴。然而，大量蛋白质则通过快速再循环和慢速再循环过程被回收至细胞表面。在快速再循环过程中，蛋白质离开早期内体后直接返回质膜；而在慢速再循环过程中，蛋白质首先被分选至内吞再循环区室，然后再被转运回质膜。多种货物蛋白，例如网格蛋白、逆行体复合物（retromer complex）、回收体复合物（retriever complex）、Wiskott-Aldrich综合征蛋白以及SCAR同源物（WASH）复合物，均参与此类膜再循环过程^4,5,6,7,8,9。内吞作用与再循环事件之间的平衡对细胞存活至关重要，并影响多种细胞活动¹⁰，例如细胞黏附、细胞迁移、细胞极性和信号转导。

ARF6 是一种小GTP酶，已被报道为内吞运输的调控因子^7,11,12。值得注意的是，多个研究团队已阐明ARF6在内吞再循环过程中的重要作用^{13,14,15,16,17}。本研究旨在探讨ARF6介导的神经突生长与内吞再循环之间的关系。先前的研究表明，ARF6通过作用于ELMO1-细胞分裂周期蛋白1（DOCK180）复合物，位于Rac1活性的上游¹⁸。然而，ARF6如何启动ELMO1-DOCK180介导的Rac1信号通路仍不清楚。本研究采用密度梯度超速离心法，以探究ARF6介导的内吞再循环在此过程中的作用。通过该方法，从细胞裂解液中分离出含有再循环内体的组分¹⁹。该组分随后进行蛋白质印迹分析以检测其蛋白含量。免疫印迹结果显示，在存在FE65（一种脑组织富集的衔接蛋白）的情况下，活性ARF6显著增加了再循环内体组分中ELMO1的水平。以下实验方案包括以下步骤：（1）转染哺乳动物细胞；（2）制备样品和密度梯度柱；（3）获取含有再循环内体的组分。

方案

1. 哺乳动物细胞培养与转染

1. 在100 mm培养皿中接种2 × 10⁶个细胞。每次转染使用四个培养皿。
   注意：不同细胞系所需的细胞数量可能有所不同。在进行分离步骤之前，可能需要进行优化。
2. 次日，根据生产商说明书，使用Lipofectamine对细胞进行转染。

2. 细胞收获

1. 转染后48小时弃去培养基。
2. 用预冷的PBS（10 mM磷酸钠，2.68 mM氯化钾，140 mM氯化钠）洗涤细胞两次。
3. 每皿加入1 mL预冷的PBS⁺（含0.5×蛋白酶抑制剂混合物和0.5×磷酸酶抑制剂混合物的PBS）。
4. 用细胞刮收集细胞，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
5. 使用水平转子在400 × g 条件下离心5分钟，沉淀细胞。
6. 弃去上清液，用5 mL匀浆缓冲液（HB；250 mM蔗糖，3 mM咪唑（pH 7.4），1 mM EDTA，添加0.03 mM环己酰亚胺、1×蛋白酶抑制剂混合物和1×磷酸酶抑制剂混合物）轻柔重悬细胞沉淀。
7. 在1,300 × g 条件下离心10分钟，收集细胞。
8. 用1 mL HB重悬细胞沉淀。
9. 使用Dounce匀浆器匀浆细胞，进行15–20次研磨。
   注意：也可采用其他匀浆方法，例如通过注射器反复推注样品。可通过相差显微镜观察匀浆液来评估匀浆效率。
10. 将匀浆液转移至2 mL离心管中。
    注意：取50 µL匀浆液与12.5 µL 5×上样缓冲液混合，标记为总裂解液。
11. 向匀浆液中加入0.7 mL HB。
12. 在4 °C条件下，以2,000 × g 离心10分钟。
    注意：沉淀物包含细胞核和未破碎的细胞。
13. 收集1.5 mL上清液，并重复步骤2.12一次。
14. 收集1.4 mL上清液，标记为去核上清液（PNS）。

3. 密度梯度柱的制备

1. 将 1.2 mL PNS 转移至超速离心管中。
2. 向样品中加入 1 mL 62% 蔗糖溶液（2.351 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4），通过轻柔移液充分混匀。
   注意：所得溶液为 40.6% 蔗糖溶液。
3. 小心地将 3.3 mL 35% 蔗糖溶液（1.177 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4）加至 62% 蔗糖溶液上方。
4. 再小心地将 2.2 mL 25% 蔗糖溶液（0.806 M 蔗糖，3 mM 咪唑，pH 7.4）加至 35% 蔗糖溶液上方。
   注意：在室温下，62%、40.6%、35% 和 25% 蔗糖溶液的折射率分别为 1.44、1.40、1.39 和 1.37。可通过折射仪检测蔗糖溶液的折射率 ，以确保实验的精确性和一致性。
5. 用 HB 缓冲液加满超速离心管。
   ​注意：将制备好的密度梯度柱暂时储存在 4 °C 下。

4. 含再循环内体组分的分离与回收

1. 在 4 °C 条件下，以 210,000 × g 离心柱体 3 小时。
2. 从梯度顶部开始小心收集 12 个组分（每个 1 mL）。
   注意：回收型内体应位于 35% 与 25% 蔗糖溶液之间的界面处。收集的组分可迅速在液氮中冷冻，并于 -80 °C 保存。
3. 用 1 mL 稀释缓冲液（pH 7.4 的 3 mM 咪唑，1 mM EDTA）稀释所有组分。
4. 在 4 °C 条件下，将稀释后的样品以 100,000 × g 离心 1 小时。
5. 吸除上清液，并加入 50 µL 1× 样品缓冲液以收集各组分。
6. 通过蛋白质印迹法分析各组分中的蛋白质含量。

结果

通过密度梯度超速离心法对未转染的HEK293细胞进行分馏后，从梯度顶部开始共收集12个组分。收集的组分以1:1的比例用稀释缓冲液稀释后，进行第二轮离心。随后对样品进行蛋白质印迹分析以检测其蛋白组成。如图1所示，循环内体标志物Rab11在第7组分中被检测到²⁰。同时也检测了其他亚细胞标志物，包括β-COP、COX IV、GAPDH、EEA1、Rab7和Lamp1。在第7组分中也检测到EEA1的阳性信号。使用ImageLab软件（Bio-Rad）测量第7组分和PNS中GAPDH、COX IV和Rab11的条带强度，并计算第7组分与PNS中标志物的强度比值，以±SD的柱状图表示。

先前的研究表明，ARF6 和 ELMO1 可与 FE65 相互作用，促进 Rac1 介导的神经突生长^21,22。由于 ARF6 是内吞再循环的调控因子，而 ELMO1 向质膜的靶向定位对于...

讨论

上述方案概述了通过超速离心法从培养细胞中分离回收型内体的实验步骤。该方法的可靠性已在最新发表的研究²²中得到验证，证明可成功将回收型内体与其他细胞器（如高尔基体和线粒体）分离开来（图1）。为获得良好的分离效果，需特别注意若干关键步骤。在配制蔗糖溶液时，建议使用折光仪检测各溶液的折光率。室温下，62%、35% 和 25% 蔗糖溶液的折光率分别为 1.44、1.39 和 1.37。同时，应避免在密度梯度中产生气泡，因为柱中的气泡可能破坏梯度的连续性。在匀浆过程中应避免使用去垢剂，因其会破坏细胞器膜结构，导致膜结合细胞器中的蛋白质释放，从而引起严重污染。此外，所有匀浆工具在使用前均应预先冷却，以防止匀浆过程中蛋白质降解。梯度液配制完成后应尽快使用。尽管配制好的梯度液可在 4 °C 下短期保存（1–2 小时），但长时间存放可能因扩散作用而影响密度梯度的稳定性。

蔗糖是一种广泛使用的梯度介质，因其易于获得。事实上，还有许多其他替代物，包括Percoll和Ficoll-400

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 开口厚壁聚丙烯管，11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm 组织培养皿	SPL	20100
13.2 mL 认证无菌开口薄壁超透明管，14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x 上样缓冲液	GenScript	MB01015
cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11873580001
COX IV (3E11) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	4850S	用于检测 COX IV 的兔单克隆抗体。
放线菌酮（Cycloheximide）	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce 组织研磨器，7 mL	DWK Life Sciences	357542
低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	HyClone	SH30021.01
ELMO1 抗体 (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	用于检测 ELMO1 的小鼠单克隆抗体。
EndoFree 质粒大提试剂盒	QIAGEN	12362
FE65 抗体 (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	用于检测 FE65 的山羊多克隆抗体。
胎牛血清，研究级	HyClone	SV30160.03
GAPDH 单克隆抗体 (6C5)	Ambion	AM4300	用于检测 GAPDH 的小鼠单克隆抗体。
ImageLab 软件	Bio-Rad		条带强度测定
咪唑（Imidazole）	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
单克隆抗β-COP 抗体	Sigma	G6160	用于检测 β-COP 的小鼠单克隆抗体。
Myc 标签 (9B11) 小鼠单克隆抗体	Cell Signaling Technology	2276S	用于检测 Myc 标签蛋白的小鼠单克隆抗体。
OmniPur EDTA，二钠盐，二水合物	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP 超速离心机	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL 台式超速离心机	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985070
PBS 片剂	Gibco	18912014
PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混合物	Roche	4906845001
RAB11A 特异性多克隆抗体	Proteintech	20229-1-AP	用于检测 Rab11 的兔多克隆抗体。
蔗糖（Sucrose）	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 固定角转子	Beckman Coulter	362046
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Gibco	25300062