本文介绍了一种用于扩增伽马-德尔塔（γδ）T细胞药物产品的实验方案。通过离心淘析法分离淋巴细胞，并使用唑来膦酸和白细胞介素-2富集γδ T细胞。采用临床级磁性分离装置去除αβ T细胞。将富集的γδ T细胞与K562细胞系衍生的人工抗原呈递细胞共培养并进行扩增。
本文内容
摘要
摘要
尽管Vγ9Vδ2 T细胞是T淋巴细胞中的一个次要亚群，但由于其能够以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式识别抗原，并发展出强大的细胞溶解效应功能，因而成为癌症免疫治疗的理想候选者。由于Gamma-Delta（γδ）T细胞在外周血中的频率较低，我们开发了一种高效方案，可大规模扩增出高纯度的γδ T细胞药物产品，用于异体γδ T细胞在急性髓系白血病（AML）患者中的首次人体应用。以健康供体的单采血液作为异体细胞来源，采用经验证的仪器，通过逆流离心法根据细胞大小和密度分离淋巴细胞。
采用富含淋巴细胞的组分，并使用唑来膦酸（FDA 批准）和白细胞介素（IL）-2 优先激活 γδ T 细胞，持续 7 天。在 γδ T 细胞优先扩增后，使用符合临床级标准的磁性细胞分离装置及 TCRαβ 磁珠，去除污染的 T 细胞受体（TCR）αβ T 细胞。高度富集的 γδ T 细胞随后进入第二阶段扩增，使用来源于 K562 细胞的基因工程人工抗原呈递细胞（aAPCs）进行培养；该 aAPCs 经基因改造，可表达针对 CD3 和 CD28 的单链可变区片段（scFv）、41BBL（CD137L）以及 IL15-RA，并联合使用唑来膦酸和 IL-2。将第 7 天富集的所有 γδ T 细胞与 aAPCs 共同培养，可实现从健康供体血液中制备出高纯度的 γδ T 细胞，平均扩增倍数达 >229,000 倍。
引言
白血病复发是急性髓系白血病（AML）患者在接受造血细胞移植（HCT）后死亡的首要原因1,2,3。研究表明，HCT后外周血γδ T细胞恢复程度较高，可显著改善无白血病生存率，且不增加移植物抗宿主病（GVHD）的风险4。γδ T细胞能够以MHC非依赖的方式识别抗原，并产生强烈的细胞溶解作用和Th1样效应功能，这使得这一T细胞中的少数亚群成为治疗接受异基因移植且具有复发风险的AML患者的理想选择5。由于Vγ9Vδ2 T细胞在外周T细胞中仅占0.5%至5%，属于稀有亚群6，因此我们致力于建立一个稳定可靠的扩增体系，以大量扩增这种稀有血细胞，达到可用于临床试验的潜在治疗剂量。
尽管已有研究者成功利用唑来膦酸甚至人工抗原呈递细胞（aAPCs）扩增γδ T细胞，但我们开发了一种可将γδ T细胞扩增229,749倍的方法。该扩增过程分为两个阶段：首先，通过分离仪器采用离心淘洗法获取淋巴细胞。该设备提供一个封闭系统，可通过逆流离心法根据细胞的大小、形状和密度实现细胞分离。在富集淋巴细胞后，使用唑来膦酸和IL-2处理7天，实现Vγ9Vδ2 T细胞的选择性扩增。在此处理结束后，立即利用微珠技术去除TCR-αβ T细胞，从而为后续使用K562来源的aAPCs扩增γδ T细胞创造条件。
在工艺验证中，仅使用5 × 106个经唑来膦酸扩增的γδ T细胞与人工抗原呈递细胞（aAPCs）进行第二阶段共培养扩增。在该第二阶段扩增过程中，采用莫菲特癌症中心（Moffitt）生产的符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的工作细胞库（WCB）的基因工程改造K562来源aAPCs（K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)）来激活γδ T细胞。该两阶段扩增策略的原理基于唑来膦酸可抑制单核细胞中的法尼基二磷酸合酶（FDPS），从而导致异戊烯基焦磷酸积累，后者可直接刺激Vγ2Vδ2细胞。在第二阶段扩增中，K562来源的aAPCs（K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)）为所有T细胞提供强效刺激。然而，此时细胞产物中γδ T细胞已得到富集，因而可实现γδ T细胞的高效扩增。
通过使用特定设备和烧瓶，该过程构成一个功能性的封闭系统，从而降低了污染风险。此外，1 L封闭式生物反应器可在1 L培养基总体积中实现细胞的最大生长与扩增，且几乎无需补液。Moffitt方法的优势在于，它提供了一种快速、可重复且高度可行的GMP系统，用于生产高纯度、供体来源的γδ T细胞产品，适用于同种异体给药。该方法可应用于任何旨在利用表达Vγ2Vδ2 T细胞受体的人源γδ T细胞作为过继性免疫治疗手段的临床试验，以介导针对癌症患者体内微生物和肿瘤的免疫反应，实现部分或完全缓解。此外，该方法还为γδ嵌合抗原受体阳性（CAR+）T细胞的开发与生产提供了可靠的平台。
方案
注意：已获得机构审查委员会（IRB）批准，并已从供者处获得知情同意。
1. 淋巴细胞分离
- 将单采产品转移至洁净室。
注意：工艺验证使用了符合原始细胞材料采集法规的外部商业供应商提供的正常供体单采产品。 - 采集样本用于无菌检测、细胞计数和细胞表型分析。
- 使用逆流离心装置进行洗脱，初级介质为含1%人血清白蛋白（HSA）的Hanks平衡盐溶液，次级介质为生理盐水溶液（0.9%氯化钠注射液USP）或Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）。将离心洗脱速度设置为900 × g，并根据流速和时间收集不同组分。
- 从第2组分中采集样本，并进行以下检测：2 mL用于无菌检测；0.5 mL用于通过吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）进行细胞计数和活力检测；5 × 106个细胞用于流式细胞术进行细胞表型分析。
- 将纯化的淋巴细胞组分（第2组分）以10 × 106个细胞/cm2的密度，在1 L封闭式生物反应器中培养扩增，加入5 µmol/L唑来膦酸和300 IU/mL IL-2。
- 在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育七天。
2. αβ T 细胞去除
- 从1 L封闭式生物反应器瓶中收获细胞。将1 L转移袋无菌焊接至封闭式生物反应器的红线处，并使用适当的药用泵将细胞转移至转移袋中。
- 采集以下样品：10 mL用于培养基无菌检测；0.5 mL细胞用于AO/PI染色法进行细胞计数和活力检测；5 × 106 个细胞用于流式细胞术分析。
- 将细胞以约5 × 108 个细胞/mL的浓度重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）或PBS/乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液 + 0.5% HSA中，并加入生物素标记的TCR αβ特异性抗体。
- 将摇床置于冰箱中，在2–8 °C条件下振荡孵育细胞约15分钟。
- 用总共600 mL的PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA洗涤细胞。在2–8 °C条件下，以200–500 × g 离心15分钟，去除未结合的抗体。将约5 × 108 个细胞/mL重悬于PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA中，并加入抗生物素特异性磁珠（7.5 mL/1小瓶）。
- 将摇床置于冰箱中，在2–8 °C条件下振荡孵育细胞约15分钟。孵育后，在2–8 °C条件下以200–500 × g 离心15分钟，去除未结合的磁珠。将细胞以约6 × 107 个细胞/mL的浓度重悬于PBS/EDTA缓冲液 + 0.5% HSA中，并转移至转移袋中。
- 按照制造商说明，将管路组件安装至临床级磁性细胞分选装置中，将含有PBS/EDTA缓冲液的袋子和含有细胞产物的转移袋放入仪器中，并在仪器提示时进行穿刺操作。
- 选择Depletion 1.2程序以去除标记的αβ T细胞。
- 离心目标组分（富集的γδ T细胞），并将细胞重悬于添加了10%人AB血清的培养基中。
- 取0.5 mL样品，使用AO/PI染色法进行细胞计数和活力检测。将细胞调整至终浓度约为1 × 106 个细胞/mL。取5 × 106 个细胞的产品样品，用于去除αβ T细胞后的流式细胞术表型分析。
3. 与aAPCs的共培养
- 在X射线发生仪器上以100 Gy剂量照射5 × 107个aAPC/烧瓶。
- 将aAPC与γδ T细胞以10:1的比例共培养。将经照射的aAPC（5 × 107个细胞/烧瓶）和γδ T细胞（5 × 106个细胞/烧瓶）置于含1 L培养基的封闭式生物反应器烧瓶中，培养基中添加10%人AB型血清。最多接种10个烧瓶。
- 将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中培养扩增10天。
- 使用试纸条、葡萄糖和乳酸检测仪，每3至4天监测一次葡萄糖和乳酸水平。
- 若葡萄糖浓度降至250 mg/dL，使用药用泵通过无菌焊接方式将1 L转接袋连接至封闭式生物反应器的红色标记线，将烧瓶内液体体积减少至200 mL。
- 混匀剩余200 mL中的细胞，取0.5 mL样本，通过AO-PI染色进行细胞计数和活力检测。若细胞数量≥109，将一个烧瓶中的细胞分至两个烧瓶，并用添加10%人AB型血清的AIM-V培养基补至每瓶1 L；若细胞数量<109，则向原烧瓶中加入1 L新鲜培养基（含10%人AB型血清）进行换液。
- 对所有烧瓶重复步骤3.6，并放回37 °C、5% CO2培养箱中。每3至4天重复一次步骤3.4–3.7。
4. 细胞收获
- 共培养10天结束时，收获所有生物反应器烧瓶。每次收获一个生物反应器烧瓶，并将所有细胞汇集至适当大小的转移袋中。将转移袋无菌焊接至封闭式生物反应器的红线处，使用药用泵将细胞转移至转移袋中。
- 留取以下质量控制样品：取药品终产物（DP）的1%用于血培养和革兰染色以检测无菌性；取0.5 mL用于AO/PI染色法进行细胞计数和活率检测；取5-10 × 106个细胞用于流式细胞术分析（参见图1中的设门策略）；取0.5 mL用于内毒素检测；取0.5 mL用于革兰染色；取106个细胞加入10 mL使用过的培养基中用于支原体检测。
- 在室温下以200-500 × g离心15分钟，弃去上清液。
- 用平衡晶体溶液加0.5%人血清白蛋白（HSA）的溶液在室温下以200-500 × g洗涤细胞15分钟。然后将细胞重悬于100-300 mL的平衡晶体溶液加0.5% HSA的目标体积中。
5. 放行检测
- 对γδ T细胞DP进行以下质量控制检测：通过流式细胞术检测纯度和鉴定（活/死细胞、CD45、CD3、TCR αβ、TCR γδ、CD20、CD56、CD16）；通过AO/PI染色检测活力；内毒素检测；通过聚合酶链式反应（PCR）检测支原体；通过革兰染色及需氧和厌氧血培养检测无菌性；通过流式细胞术检测残留K562细胞（CD3-CD16-CD56-CD71+）。
结果
γδ T细胞工艺经过表征并优化，用于生产γδ T细胞药物产品。工艺优化包括：1）采用离心淘析法进行淋巴细胞富集；2）使用唑来膦酸对γδ T细胞药物物质（DS）进行细胞特异性扩增；3）去除γδ T细胞药物物质中的TCRαβ细胞；4）利用K562来源的aAPCs对γδ T细胞药物物质进行二次扩增；5）最终药物产品（DP）的收获及制剂制备，用于给药或冷冻保存。完成工艺优化后，使用来自三位健康供体的材料进行了规模化确认运行，以验证细胞处理的适用性。所有数据均已分析，并汇总于表1、表2和表3中。从逆流离心后第2组分（F2）分离的细胞获得了高纯度的淋巴细胞群体，CD45+细胞平均比例为99.23%（以活细胞总门控频率计），平均活力优异，达95.80%（表1）。
使用唑来膦酸对γδ T细胞进行特异性扩增的效果取决于细胞经离心淘洗后淋巴细胞组分（F2）中自然杀伤（NK）细胞的初始百分比。通过去除TCRαβ实现γδ T细胞终产品（DS）的富集效果稳定一致（表2）。由三位健康供体制造的γδ T细胞终产品（DP）中，CD20+ B细胞的平均含量为0.11% ± 0.05%，TCR αβ+ T细胞含量为0.00% ± 0.00%，符合TCR αβ+ T细胞≤1%的放行标准。终产品中NK细胞的平均百分比为17.06% ± 26.19%，符合<35%的放行标准。此外，终产品中T细胞和NK细胞谱系阴性细胞的平均百分比为0.48% ± 0.42%（表3）。如图2A-D所示，采用细胞表面染色和流式细胞术分析对DS和DP的身份特征、纯度及工艺相关杂质进行了表征。
通过aAPC（K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)）WCB与γδ T细胞DS以10:1的比例共培养实现的二次扩增，获得了符合所有放行标准的γδ T细胞终产品（DP），如表4所示。此外，在第0天（逆流离心F2细胞）、第7天（唑来膦酸扩增的T细胞）、第7天（TCR αβ T细胞耗竭）以及第17天（终末DP）对细胞进行染色，并通过流式细胞术检测以下生物标志物：分化簇（CD）3、TCRαβ、TCR γδ、CD45RA、CD45RO、CC趋化因子受体7（CCR7）、程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）、淋巴细胞活化基因3（LAG3）以及含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3（TIM3）。图3所示数据来自三次独立实验的平均值，结果表明细胞尚未达到耗竭状态。Moffitt CTF还开发了一种残留K562检测方法，用于测定与K562来源的aAPC相关的终产品杂质（图4）。
用于分析各细胞类型百分比的流式细胞术设门策略如下：1）设门于T细胞和NK细胞谱系阴性细胞群（CD3-CD56-CD16-）；2）设门于CD71+细胞（该转铁蛋白受体表达于红系谱系及急性髓系白血病细胞中，可用于检测残留的K562细胞）。该设门策略可用于评估CD3-CD16-CD56-CD71+细胞，即aAPC（K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)）WCB（在图4中称为“残留K562细胞”）。通过将残留K562细胞频率乘以双阳性产物（DP）的总活细胞数（TVC），可计算DP中残留K562细胞的数量（%CD71+ × DP TVC = DP中残留K562细胞数）。所有流式细胞术数据均以活细胞频率表示。表5和图4提供了T细胞和NK细胞谱系阴性细胞以及残留K562细胞的百分比。采用双尾t检验分析这些细胞群间差异的统计学显著性，结果显示WCB与γδ T细胞DP之间、以及WCB与γδ T细胞之间均存在显著差异（T细胞和NK细胞谱系阴性细胞：t = 0.0019；残留K562细胞：t < 0.0001；T细胞和NK细胞谱系阴性细胞：t = 0.0314；残留K562细胞：t < 0.0001）（表5）。
图 1：流式细胞术设门策略示意图。缩写：aAPC = 人工抗原呈递细胞；SSC-A = 侧向散射-峰值面积；FSC-A = 前向散射-峰值面积；SSC-H = 侧向散射-峰值高度；FSC-H = 前向散射-峰值高度；CD = 分化簇。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：起始材料、中间产物及终末药品的组成。所有数据显示为三次独立实验的平均值。（A）来自健康供体的单采血液通过逆流离心装置进行离心分离，获得富含淋巴细胞的F2组分，作为起始材料。（B）F2组分在添加10%人AB型血清的1 L培养基中，使用5 µmol/L唑来膦酸和300 IU/mL IL-2进行为期7天的Vγ9Vδ2 T细胞特异性扩增。（C）对唑来膦酸扩增后的产物进行TCR αβ T细胞去除。（D）在经照射的人工抗原呈递细胞（aAPCs）以1:10比例存在下，在添加10%人AB型血清的1 L培养基中，使用5 µmol/L唑来膦酸和300 IU/mL IL-2进行第二次为期10天的扩增后，收获高纯度的γδ T细胞药品。缩写：NK = 自然杀伤细胞；CD = 分化簇；TCR = T细胞受体；IL = 白细胞介素；aAPCs = 人工抗原呈递细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：起始材料、中间产物及终末药品的生物标志物。 在第0天（逆流离心F2细胞）、第7天（唑来膦酸扩增的T细胞）、第7天（TCR αβ T细胞耗竭）以及第17天（终末药品）收集细胞，并对CD3、TCRαβ、TCR γδ、CD45RA、CD45RO、CCR7、PD-1、CTLA4、LAG3和TIM3进行染色。所有数据显示为三次独立实验的平均值。(A) 干细胞样表型（CD3+、TCR γδ+、CD45RA+、CD45RO- 和 CCR7+）以活细胞总数表示。(B) 中央记忆表型（CD3+、TCR γδ+、CD45RA-、CD45RO+ 和 CCR7+）以CD3+ TCR γδ+细胞的百分比表示。缩写：CD = 分化簇；TCR = T细胞受体；IL = 白细胞介素；CCR7 = CC趋化因子受体7；PD-1 = 程序性死亡蛋白1；CTLA4 = 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；LAG3 = 淋巴细胞激活基因3；TIM3 = 含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：K562残留检测（CD3-CD16-CD56-CD71+）的代表性数据。缩写：aAPC = 人工抗原呈递细胞；NK = 自然杀伤细胞；SSC-A = 侧向散射-峰面积；CD = 分化簇；IL = 白细胞介素；TCR = T细胞受体；MCB = 主细胞库；FMO = 荧光减一对照；DP = 药物产品；WCB = 工作细胞库。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 步骤 | 参数 | 供体 | 平均值 | 标准差 | |||
| 运行 1 | 运行 2 | 运行 3 | |||||
| 富集后（淋巴细胞组分 F2） | 总活细胞数 所有工艺验证均接种于 109 TVC | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 0.00 | |
| 存活率 (%) | 98.6 | 96.6 | 92.2 | 95.8 | 3.27 | ||
| CD20+ B 细胞 (%) | 15.6 | 23.4 | 15.2 | 18.07 | 4.62 | ||
| CD3+ T 细胞 (%) | 80.04 | 66.7 | 76.1 | 74.28 | 6.85 | ||
| TCR αβ+ (%) | 77.59 | 58.03 | 68.96 | 68.19 | 9.8 | ||
| TCR γδ+ (%) | 2.48 | 1.59 | 2.1 | 2.06 | 0.45 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK 细胞 (%) | 6.57 | 19.4 | 10.5 | 12.16 | 6.57 | ||
| T 细胞和 NK 细胞谱系阴性 (%) | 13 | 13.7 | 13.4 | 13.37 | 0.35 | ||
表1：通过离心淘析法富集淋巴细胞的结果汇总，以活细胞频率表示。 缩写：TVC = 总活细胞数；TCR = T细胞受体；CD = 分化簇；NK = 自然杀伤细胞。
| 操作步骤 | 参数 | 供体 | 平均值 | 标准差 | |||
| 运行 1 | 运行 2 | 运行 3 | |||||
| 唑来膦酸处理后第7天扩增（TCRαβ耗竭前） | 总活细胞数 (TVC) | 3.69 X 109 | 1.79 X 109 | 1.42 X 109 | 2.3 X 109 | 1.22 X 109 | |
| 存活率 (%) | 99.2 | 82.6 | 89.8 | 90.53 | 8.32 | ||
| CD20+ B细胞 | 2.1 | 11.5 | 7.08 | 6.89 | 4.7 | ||
| CD3+ T细胞 (%) | 95.7 | 64.1 | 91.9 | 83.9 | 17.25 | ||
| TCR αβ+ (%) | 13.88 | 38.14 | 31.98 | 28 | 12.61 | ||
| TCR γδ+ (%) | 81.44 | 24.93 | 56.98 | 54.45 | 28.34 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK细胞 (%) | 3.59 | 33.1 | 7.28 | 14.66 | 16.08 | ||
| T细胞与NK细胞谱系阴性 (%) | 0.67 | 2.7 | 0.82 | 1.4 | 1.13 | ||
| TCRαβ耗竭后 | 总活细胞数 (TVC) | 1.81 x 109 | 4.95 X 108 | 3.80 X 108 | 8.95 X108 | 7.94 X 108 | |
| 细胞存活率 (%) | 98.8 | 87.6 | 89.8 | 92.07 | 5.93 | ||
| CD20+ B细胞 | 2.26 | 12 | 6.59 | 6.95 | 4.88 | ||
| CD3+ T细胞 (%) | 95.8 | 45.3 | 89.7 | 76.93 | 27.56 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | ||
| TCR γδ+ (%) | 95.61 | 45.07 | 89.16 | 76.61 | 27.51 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK细胞 (%) | 3.85 | 59.9 | 9.79 | 24.51 | 30.79 | ||
| T细胞与NK细胞谱系阴性 (%) | 0.34 | 1.72 | 0.45 | 0.84 | 0.77 | ||
| TCR αβ+ 总活细胞数 (TVC) | 0.00 | 4.95 x 103 | 3.8 X 103 | 2.92 X 103 | 2.59 X 103 | ||
| TCR γδ+ 总活细胞数 (TVC) | 1.73 X 109 | 2.23 X 108 | 3.39 X 108 | 7.64 X 108 | 8.39 X 108 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK 总活细胞数 (TVC) | 6.97 X 107 | 2.97 X 108 | 3.72E+07 | 1.35 X 108 | 1.42 X 108 | ||
表2：以唑来膦酸扩增γδ T细胞并结合仪器富集后，活细胞频率的总结。 缩写：TVC = 总活细胞数；TCR = T细胞受体；CD = 分化簇；NK = 自然杀伤细胞。
| 产品属性 | 参数 | 供体 | 平均值 | 标准差 | |||
| 运行 1 | 运行 2 | 运行 3 | |||||
| 第 0 天 γδ T 细胞 | 2.48 X 107 | 1.59 X 107 | 2.10 X 107 | 2.06 X 107 | 4.47 X 107 | ||
| 富集后第 7 天 γδ T 细胞 | 1.73 X 109 | 2.23 X 108 | 3.39 X 108 | 7.64 X 108 | 8.39 X 108 | ||
| 第 7 天扩增倍数 | 69.76 | 14.03 | 16.14 | 33.31 | 31.58 | ||
| 收获时总活细胞数* | 8.14 X 1010 | 1.67 X 1010 | 6.84 X 1010 | 5.55 X 1010 | 3.42 X 1010 | ||
| 细胞活力 (%) | 92.8 | 85.5 | 87.3 | 88.53 | 3.80 | ||
| CD20+ B 细胞 (%) | 0.12 | 0.06 | 0.15 | 0.11 | 0.05 | ||
| CD3+ T 细胞 (%) | 97.8 | 52 | 97.5 | 82.43 | 26.36 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0 | 0.00 | 0.00 | ||
| TCR γδ+ (%) | 97.51 | 50.13 | 97.21 | 81.62 | 27.27 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK 细胞 (%) | 2.16 | 47.3 | 1.71 | 17.06 | 26.19 | ||
| T 细胞和 NK 细胞谱系阴性、CD71+ 残留 K562 (%) | 0.018 | 0.61 | 0.82 | 0.48 | 0.42 | ||
| 收获时总 γδ T 细胞数 | 7.93 X 1012 | 8.38 X 1011 | 6.65 X 1012 | 5.14 X 1012 | 3.78 X 1012 | ||
| γδ T 细胞总扩增倍数（从第 0 天至收获） | 3.20 X 105 | 5.27 X 104 | 3.17 X 105 | 2.30 X 105 | 1.53 X 105 | ||
| *工艺验证已缩小至使用 5 X 106 γδ T 细胞和 50 X 106 照射过的 aAPC 的培养瓶规模。报告数据为若使用第 7 天原液接种 24 个培养瓶时，推算的全规模运行结果。 | |||||||
表3：γδ+ T细胞与aAPCs共培养及扩增后γδ+ T细胞收获情况汇总，以活细胞频率表示。*工艺验证已缩小规模，采用一个封闭式生物反应器（容量1 L），接种5 × 106个γδ T细胞和50 × 106个经辐照的aAPCs。所报告数据为从第7天原液接种24个培养瓶时，按全规模运行的预测值。缩写：aAPCs = 人工抗原呈递细胞；TVC = 总活细胞数；TCR = T细胞受体；CD = 分化簇；NK = 自然杀伤细胞。
| 检测参数 | 可接受标准 | 结果 | ||
| 验证 1 | 验证 2 | 验证 3 | ||
| 活力 | ≥ 70% | 92.80% | 85.50% | 87.30% |
| 支原体 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 无菌性 | 最终无生长（14 天） | 最终无生长（14 天） | 最终无生长（14 天） | 最终无生长（14 天） |
| 革兰染色 | 未见微生物（NOS） | NOS | NOS | NOS |
| 内毒素 | ≤ 2 EU/mL | <0.50 EU/mL | <0.50 EU/mL | <0.50 EU/mL |
表4：γδ T细胞质量控制放行检测结果汇总。
| 残留K562检测 | K562 | WCB | 仅γδ细胞 | γδ细胞 + WCB产物 | ||||
| T细胞和NK细胞谱系阴性百分比 | 残留K562百分比 | T细胞和NK细胞谱系阴性百分比 | 残留K562百分比 | T细胞和NK细胞谱系阴性百分比 | 残留K562百分比 | T细胞和NK细胞谱系阴性百分比 | 残留K562百分比 | |
| 99.4 | 98.8 | 98.7 | 96.83 | 3.49 | 0.58 | 0.48 | 0.07 | |
| 99.2 | 98.31 | 99.5 | 98.21 | 12.8 | 0.38 | 3.87 | 0.71 | |
| 98.9 | 98.6 | 97.6 | 95.55 | N/A | N/A | 14.4 | 0.63 | |
| 99.2 | 98.9 | 97.9 | 96.53 | N/A | N/A | N/A | N/A | |
| 98.7 | 98.3 | 98.6 | 97.6 | N/A | N/A | N/A | N/A | |
| 平均值 | 99.08 | 98.58 | 98.46 | 96.94 | 8.15 | 0.48 | 6.25 | 0.47 |
| 标准差 | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 1.02 | 6.58 | 0.14 | 7.26 | 0.35 |
表5：以活细胞频率表示的T细胞和NK细胞谱系阴性及残留K562细胞百分比。 缩写：NK = 自然杀伤细胞；WCB = 工作细胞库。
讨论
莫菲特细胞治疗实验室开发了一种双相扩增高纯度γδ T细胞的方案，用于临床试验中的供者产品（DP）。该方案在封闭系统中依据cGMP规范提供了一种生产方法，所获得的供者产品为高纯度的γδ T细胞，可通过唑来膦酸和WCB aAPCs有效激活并扩增。该方案已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于制造针对急性髓系白血病（AML）患者的同种异体γδ T细胞供者产品。利用健康供者样本，我们在仅7天内成功将供者γδ T细胞的小群体从初始的2.06 ± 0.45%扩增至54.45 ± 28.34%。在使用唑来膦酸扩增7天后，观察到2号供者的自然杀伤（NK）细胞群体有所增加。
唑来膦酸可抑制单核细胞中的法尼基二磷酸合酶（FDPS），从而导致异戊烯基焦磷酸（IPP）的积累，而IPP的积累与T细胞和自然杀伤（NK）细胞的显著增殖增加相关7,8,9。这种增加的NK细胞群体阻碍了2nd 扩增阶段使用aAPCs，因为aAPCs仅促进NK细胞的进一步扩增。因此，供者筛选标准进行了调整，排除NK细胞比例较高的供者。在去除αβ T细胞后，γδ T细胞的富集度达到76.61 ± 27.51%。该独特方案包括第二轮扩增，使用莫菲特（Moffit）制备的aAPCs，靶向γδ T细胞上的CD8、CD28和CD127L受体。通过aAPCs进行的第二轮扩增阶段，最终产物中CD3双阳性（DP）比例达到≥65%+TCR γδ+ T细胞，≤1% TCRαβ T细胞，和 <35% CD3-CD16+CD56+ NK细胞。由于使用了源自K562的aAPCs，有必要证明这些aAPCs包含 <最终产物的1%。
Moffit CTF 开发了一种流式细胞术检测方法，用于放行标准，以测定最终产品中残留 K562 细胞的百分比。该流式细胞术检测方法克服了利用细胞表面抗原来鉴定 K562 细胞时存在的所有问题。由于活化的 T 细胞可表达 CD71，我们设计了一种策略，通过设门排除所有 T 细胞和 NK 细胞，即选择 CD3- CD56- 和 CD16- 的细胞群体，然后分析 CD71+ 细胞，这些细胞即为唯一的 K562 细胞。本方案表明，γδ T 细胞终产品中残留 K562 细胞比例为 0.48 ± 0.42%，且符合所有放行标准：细胞活力 ≥70%、PCR 检测支原体阴性、革兰染色未见微生物、内毒素含量 ≤2 EU/mL，以及最终（14 天）血培养无菌生长。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢莫菲特癌症中心（Moffitt Cancer Center）的细胞免疫治疗-研究者发起的试验奖内部资助机会为本方案的开发提供了资金支持。我们还要感谢 Claudio Anasetti 博士在本项目中给予的宝贵帮助和指导。最后，我们感谢 Justin Boucher 博士对稿件提出的见解和审阅意见。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉克斯平衡盐溶液 | R&D | 285-GMP | |
| 人血清白蛋白 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| 唑来膦酸（Zometa） | Hos pira | 4215-04--8 | FDA 批准药物 |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
| 3 mL 注射器 | BD | 309657 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 309604 | |
| 20 mL 注射器 | BD | 302830 | |
| 50 mL 注射器 | BD | 309653 | |
| 100 mL 注射器 | JMS | 992861 | |
| 18g 针头 | Fisher | 305198 | |
| 1.8 mL 冻存管 | Fisher | 375418 | |
| 5 mL 移液管 | Fisher | 1367811D | |
| 50 mL 移液管 | Fisher | 1367610Q | |
| 10 mL 移液管 | Fisher | 1367811E | |
| 100 mL 移液管 | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 mL 离心管 | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 mL 离心管 | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 mL 离心管 | Fisher | 430776 | |
| 600 mL 转移袋 | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" 血浆转移装置 | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Elutra 管路套装 | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton 无菌泵动式液体分配系统 | Fisher Scientific | 22-246660 | |
| Acacia 泵靴 | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA 缓冲液 | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| 重组人脱氧核糖核酸酶 α（Dornase Alpha） | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA 批准药物 |
| 1000 mL 0.22 µm 滤器 | Fisher | 157-0020 | |
| 170 µm 血液滤器 | B.Braun | V2500 | |
| CliniMACs 管路套装 | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β 试剂盒 | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Y型输血装置 | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 mL 培养瓶 | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA 批准药物 |
| AIM-V 培养基 | Fisher | 0870112BK | |
| 人AB型血清 | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3 升转移袋 | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 微升移液器吸头 | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex 液体处理与细胞收获泵 | WILSON WOLF MFG CORP | ||
| HERAcell Vios CO2 培养箱 | Thermo Scientific |
参考文献
- Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
- Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
- Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
- Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700(2011).
- Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
- Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
- Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
- Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
- Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).
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