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OnePot PURE 无细胞体系

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DOI：

10.3791/62625

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2021年6月23日

 ,  ,  , 
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种使用标准实验室设备快速且经济高效地制备重组型PURE无细胞转录-翻译系统的方法。

摘要

定义明确的PURE（使用重组元件进行蛋白质合成）转录-翻译系统为无细胞合成生物学提供了一个极具吸引力的平台。然而，市售系统的成本较高，且可调节性有限。相比之下，自制系统可根据用户需求进行定制。但自制系统的制备过程耗时且繁琐，因其需要核糖体以及36种中等规模的蛋白质纯化步骤。通过共培养和共纯化来简化蛋白质纯化流程，可显著减少所需的时间和劳动投入。本文介绍了一种简便、可调节、高效且成本低廉的方法，仅需标准实验室设备即可在1周内完成PURE系统所有组分的制备。此外，OnePot PURE系统的性能与市售系统相当。由于其操作简便且成本低廉，OnePot PURE制备方法将使更多实验室能够获得PURE系统。

引言

无细胞转录-翻译（TX-TL）系统是研究和构建生物系统的有前景平台。由于不再依赖生长、稳态或调控机制等维持生命的过程，该系统提供了简化且可调控的反应条件1。因此，人们预期无细胞系统将有助于生物分子系统的研究，为理性生物设计策略提供测试框架2，并为未来的合成细胞提供底盘3,4。全重组的PURE系统因其明确且最简的组分，以及良好的可调节性和可调性，成为尤为理想的底盘系统5。

自2001年首个功能完整、完全重组的PURE系统建立以来5，研究人员已致力于拓展该系统的应用范围，并优化其组分以提高蛋白产量6,7,8，实现转录调控9、膜蛋白10,11及分泌蛋白的合成12，以及促进蛋白质正确折叠13,14。目前，市面上有三种商业化系统：PUREfrex（GeneFrontier）、PURExpress（NEB）和Magic PURE（Creative Biolabs）。然而，这些系统成本较高，其确切组分属于商业机密而未公开，且可调节性和灵活性有限。

自行制备的PURE系统被证明是最具成本效益且可调节性最强的方案15,16。然而，蛋白质和核糖体组分所需的37个纯化步骤耗时且繁琐。已有多种尝试致力于提高PURE系统制备的效率17,18,19。我们近期证明，可在同一培养体系中共同培养并共纯化PURE系统所需的所有非核糖体蛋白。这种“一步法”（OnePot）方法已被证实具有较高的成本效益和时间效率，将制备时间从数周缩短至3个工作日。该方法所获得的PURE系统在蛋白质生产能力方面可与商业化的PURExpress系统相媲美20。与以往简化PURE系统制备的方法17,18,19不同，在OnePot方法中，所有蛋白仍在不同的菌株中分别表达。这使得用户仅通过省略或添加特定菌株，或调整接种体积，即可灵活调节OnePot PURE系统的组成，从而分别构建缺失特定组分的PURE系统或改变最终蛋白的比例。

本文所述方案提供了构建OnePot PURE系统的详细方法，此前已有相关描述20，但以三(2-羧乙基)膦（TCEP）替代了β-巯基乙醇。此外，本文描述了两种核糖体纯化方法：一种是基于Shimizu等15报道的传统的无标签核糖体纯化方法，利用疏水相互作用和蔗糖垫进行纯化；另一种是基于Wang等18和Ederth等21的方法但经过显著改进的Ni-NTA核糖体纯化方法。后一种方法进一步简化了PURE系统的制备过程，且仅需常规实验室设备，因而可被更多实验室采用。

本实验方案总结了一种多功能的PURE无细胞转录-翻译（TX-TL）系统的制备方法，提供了一个简单、可调控且成本效益高的无细胞平台，可在一周内使用常规实验室设备完成制备。除了介绍标准的PURE组分外，我们还指出了系统可进行调整的具体方式与位置，重点强调了实验方案中的关键步骤，以确保系统的正常功能。

方案

注意：本方案描述了从重组组分制备无细胞转录-翻译（TX-TL）系统的方法。为方便起见，工作分为五个部分。第一部分介绍实验前的准备工作，应在开始本方案之前完成。第二部分介绍OnePot蛋白溶液的制备。第三部分描述核糖体的纯化步骤，第四部分详述能量溶液的制备，最后一部分提供建立PURE反应的操作手册。为便于操作，各方案按天划分，并在表1中以每日时间表形式进行汇总。按照该时间表，单人可在1周内完成整个系统的制备。

1. 初步工作

  1. 按照补充表1所述方法制备细菌培养基及培养基添加剂。准备并灭菌所需材料，包括移液器吸头和96深孔板。
  2. 菌株制备
    1. 使用热激法将表2中所示的表达菌株与相应的表达载体进行转化。
      1. 将纯化的质粒加入化学感受态细菌中，冰上孵育20–30分钟。
      2. 将混合物置于42 °C下30秒（热激），然后放回冰上2分钟。
      3. 直接吸取20 µL细菌涂布于含氨苄青霉素（AMP）的琼脂平板上，37 °C过夜培养。平板可于4 °C保存最多1周。
      4. 从琼脂平板上挑取单菌落接种至3 mL含AMP的LB培养基中，37 °C、260 rpm振荡培养过夜。
      5. 取250 µL菌液与250 µL 50% (v/v)甘油混合，-80 °C保存。
        注：为便于后续快速使用，可将菌株以甘油保存液形式储存在96孔板中。
    2. 通过菌落PCR和测序验证所有载体转化结果。对基因、启动子区域和核糖体结合位点进行测序。
  3. 表达测试
    1. 在1.3 mL深孔板中，将约1 µL上述制备的甘油保存菌液接种至300 µL含AMP的LB培养基中。用透气膜密封后，37 °C、260 rpm振荡培养过夜。
      注：此时所有表达均需单独进行。
    2. 取1 µL过夜培养物接种至300 µL新鲜含AMP的LB培养基中，37 °C、260 rpm振荡培养过夜。培养2小时后，加入100 µM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，继续培养3小时。
    3. 取10 µL菌液与10 µL 2× Laemmli缓冲液混合，95 °C加热10分钟。使用台式离心机离心1 分钟，取10 µL上清液上样至PAGE凝胶。在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中以200 V电泳30分钟。用去离子水充分冲洗凝胶。加入考马斯亮蓝蛋白染色液覆盖凝胶，室温孵育1小时。必要时用水脱色（表达测试的代表性结果见图1）。
      注：建议使用梯度（4%–15%或4%–20%）PAGE凝胶以获得良好的蛋白分离效果。
  4. IMAC Sepharose树脂的再生与清洗
    1. 柱子准备。
      1. 通过涡旋充分混匀Sepharose树脂。
      2. 将所需量的树脂转移至空的重力流层析柱中。
        注：His-核糖体纯化与蛋白纯化所需的树脂量不同，具体用量见相应部分说明。
      3. 用30 mL去离子水洗涤树脂。
      4. 按照第1.4.4节所述进行柱子再充电操作。
        注：每一步操作前必须确保液体完全流过柱子，但切勿让柱子干涸。当液体流经柱子时，一旦液体到达树脂表面，应立即停止流速或进入下一步操作。
    2. 再生。
      1. 用30 mL去离子水洗涤柱子。
      2. 加入10 mL含0.2 M EDTA和0.5 M NaCl的溶液。
      3. 加入30 mL 0.5 M NaCl溶液。
      4. 用50 mL去离子水洗涤柱子。
      5. 可在4 °C条件下以20% (v/v)乙醇保存，或直接进行下一步操作。
    3. 清洗。
      警告：请佩戴防护装备。
      1. 用30 mL 0.5 M NaOH洗涤柱子。
      2. 用30 mL去离子水洗涤柱子。
      3. 用30 mL 0.1 M乙酸洗涤柱子。
      4. 用30 mL去离子水洗涤柱子。
      5. 用30 mL 70% (v/v)乙醇洗涤柱子。
      6. 用50 mL去离子水洗涤柱子。
      7. 可在4 °C条件下以20% (v/v)乙醇保存，或继续下一步操作。
    4. 再充电。
      1. 向柱子中加入10 mL 0.1 M硫酸镍溶液。
        警告：硫酸镍具有毒性，其废液应按照供应商建议的注意事项进行处理。
      2. 用50 mL去离子水洗涤柱子。
      3. 可在4 °C条件下以20% ((v/v))乙醇保存，或继续进行柱子平衡。
        ​注：若步骤之间柱子以乙醇保存，使用前必须用去离子水充分洗涤，彻底去除乙醇残留。

2. OnePot 蛋白质溶液表达与纯化

注意：该实验方案分为三天进行，共包含三个部分（图2）。理想情况下，制备可获得1.5 mL浓度为13.5 mg/mL的OnePot蛋白溶液，足以进行一千次以上的10 µL PURE反应。然而，不同批次所得溶液的产量和最佳浓度可能存在差异。有经验的操作者可同时进行多个OnePot PURE的制备。

第1天：

  1. 按照补充表1中的说明配制细菌培养基和培养基添加剂。
  2. 准备并灭菌所需材料，包括移液器吸头、两个96深孔板和一个1 L带挡板的锥形瓶。
  3. 按照补充表2中的说明配制缓冲液和添加剂。使用瓶顶过滤器（0.45 µm）对所有缓冲液进行过滤灭菌，并在4 °C下保存。除另有说明外，所有缓冲液在使用前均需添加1 mM TCEP。
  4. 用于OnePot蛋白纯化的Sepharose树脂用量为2 mL。按照第1.4节所述方法制备层析柱。
  5. 为制备起始培养物，将20 mL LB培养基与20 µL AMP混合。在无菌的96孔、1.3 mL深孔板中，向35个孔中各加入300 µL培养基。除热不稳定延伸因子（EF-Tu）外，其余各孔分别接种相应的菌株，并用透气膜密封平板。
    注意：使用96孔复制接种器进行接种（见材料表）。深孔板的孔体积和起始培养物体积至关重要。由于通气不一致，较大的培养基体积或较小的孔体积将导致不同的细菌密度。
  6. 对于EF-Tu培养物，将3 mL LB培养基接种于一个14 mL带卡扣盖的培养管中。单次3 mL EF-Tu培养物足以用于一次OnePot表达培养。
  7. 在37 °C、260 rpm条件下振荡培养过夜。

第2天：
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

  1. 向无菌挡板烧瓶中加入 500 mL LB 培养基和 500 µL 氨苄青霉素（AMP）。
  2. 用 1675 µL EF-Tu 菌液以及深孔板中每种菌液各 55 µL 接种 OnePot PURE 培养体系（表 2）。
    注意：在此步骤中，可通过调节接种比例来调整总体蛋白质组成。确保总接种体积保持恒定，为 3.6 mL。
    可选：为确认所有菌株均已过夜生长，使用酶标仪在 96 孔板中于 600 nM 波长处测定过夜培养物的光密度（OD600）。光密度测定时采用 10 倍稀释。
  3. 将培养物在 37 °C、260 rpm 振荡条件下培养 2  h，或直至培养物的 OD600 达到 0.2–0.3。
  4. 加入 500 µL 0.1 mM IPTG 诱导培养，并继续生长 3 h。
  5. 在 4 °C、3220 × g 条件下离心 10 min 收集细胞，并将菌体沉淀储存在 -80 °C，以备后续使用。
    注意：为优化时间安排，可在第 2 天的培养期间配制第 4 节所述的能量溶液（表 1）。

第3天：

  1. 根据下述步骤中所述的纯化流程，量取所需缓冲液体积，并按补充表2所示向所有缓冲液中加入TCEP。将未添加TCEP的剩余缓冲液于4 °C保存，以备后续纯化使用。
  2. 用30 mL缓冲液A对已上样柱子（第2.4节）进行平衡。当25 mL缓冲液A流过柱子后，关闭柱子底部出口。同时，继续进行步骤2.15–2.17。
  3. 将细胞解冻，并用移液管将细胞沉淀重悬于7.5 mL缓冲液A中。
  4. 使用130瓦探头式超声破碎仪（见材料表，探头尖端直径：6 mm）进行细胞裂解，参数设置如下：脉冲开启4次，每次20秒，脉冲间隔20秒，振幅70%。若超声成功，溶液颜色会变深（图2）。
    注意：超声过程中务必保持样品置于冰上。将探头插入溶液足够深度，但避免接触管壁。若产生大量泡沫，能量传递将受到抑制。此时应暂停操作，待泡沫消散后，将探头更深地插入溶液中，并适当延长超声时间。
  5. 超声结束后立即在4 °C条件下以21130 × g离心20 min，以去除细胞碎片。裂解液始终保持在冰上。
  6. 将上清液加入已平衡的柱子中。关闭柱子顶部，确保无泄漏。将柱子置于4 °C旋转孵育3 h（使用试管旋转混合仪）。
  7. 用25 mL缓冲液A洗脱未结合组分并清洗柱子。
  8. 用25 mL含25 mM咪唑的缓冲液（由23.95 mL缓冲液A和1.25 mL缓冲液B配制）洗涤柱子。
  9. 用5 mL含450 mM咪唑的缓冲液（由0.5 mL缓冲液A和4.5 mL缓冲液B配制）洗脱目标蛋白。洗脱过程中始终将收集的蛋白溶液置于冰上。
  10. 将洗脱液用25 mL HT缓冲液稀释，混合液保持在冰上。取15 mL加入15 mL离心浓缩管中，浓缩至1.5 mL。将剩余的15 mL加入已浓缩的样品中，再次浓缩至1.5 mL。
  11. 向浓缩后的样品中加入10 mL HT缓冲液，浓缩至1 mL。加入等体积的储存用缓冲液B，于-80 °C保存备用。
    注意：每轮缓冲液置换/浓缩过程需在4 °C下以3220 × g离心约60 min。
  12. 在缓冲液置换期间，按照第1.4节规定恢复柱子状态。

第4天：

  1. 按照供应商提供的说明，使用Bradford法测定蛋白浓度。使用0.5 mL截留分子量为3 kDa的离心浓缩管将样品浓缩至20 mg/mL。
    注意：在进行浓度测定前，将蛋白溶液稀释25倍或50倍，以避免Bradford法检测时信号过饱和。
  2. 为确定最佳蛋白浓度，可在本阶段进行表达测试（第5.2节），使用不同浓度的蛋白溶液。进行滴定实验时，保持溶液总体积恒定，并按照五种不同比例加入OnePot蛋白溶液（包括储存缓冲液B）（补充表7）。
  3. 使用SDS-PAGE验证OnePot PURE蛋白的组成（图3A）。取2.5 µL样品加入7.5 µL水稀释，再与10 µL 2x Laemmli缓冲液混合，随后分别上样5 µL和2.5 µL至凝胶。按照第1.3.3节所述条件运行SDS-PAGE。
  4. 在确认蛋白表达并调整浓度后，将蛋白溶液分装为每份50 µL。将OnePot PURE蛋白溶液储存于-80 °C，以备后续使用。
    注意：若怀疑某一蛋白组分缺失或其浓度低于预期，可执行以下步骤。
  5. 通过测量各培养物的光密度（OD600），检查相应菌株的过夜培养物是否与其他培养物具有相似的生长速率。
  6. 对特定菌株进行额外的表达测试，以验证可疑蛋白的表达情况。

3. 核糖体溶液

注意：本文介绍了两种不同的核糖体纯化策略，一种用于六组氨酸标签核糖体，另一种用于无标签核糖体。使用标准亲和镍-NTA重力流柱进行His纯化的主要优点是纯化过程简便、快速，且无需额外的实验设备（如FPLC系统和超速离心机）。然而，OnePot PURE反应中的蛋白质生产能力相比无标签核糖体大约仅为三分之一。因此，应根据特定应用是否需要高产量来选择核糖体生产方法。

  1. His标签核糖体纯化
    注意：本方案采用 E. coli RB1菌株，由美国哥伦比亚大学王教授惠赠18该菌株在50S核糖体蛋白（L7/L12）的C末端基因组插入了六组氨酸标签，可利用Ni-NTA重力流柱进行纯化。通常产量约为0.5 3.45 µM 核糖体的毫升数，足以进行五百次以上的 10 µL PURE 反应。

第1天：

  1. 按照补充表1中的说明配制细菌培养基和培养基添加剂。
  2. 准备并灭菌所需材料，包括移液器吸头、一个5 L的锥形瓶和一个100 mL的锥形瓶。
  3. 按照补充表2中的说明配制缓冲液和添加剂。使用瓶顶滤器（0.45 µm）对所有缓冲液进行过滤灭菌，并在4 °C下保存。

第2天：

  1. 用移液器将5 mL树脂转移至层析柱中，并按照第1.4节所述方法准备层析柱。
    注意：由于树脂体积较大，再生和纯化所需时间显著延长。应使用不同的层析柱进行核糖体纯化，以避免交叉污染，并在纯化前彻底清洗层析柱。
  2. 接种35 mL LB培养基于100 mL三角烧瓶中，培养大肠杆菌（E. coli）RB1菌株过夜。在37 °C、260 rpm振荡条件下孵育。

第3天：
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

  1. 将2 L LB培养基加入5 L无菌烧瓶中，接种12 mL过夜培养物，然后在37 °C、260 rpm振荡条件下培养3–4 h。
    注意：也可在4个1 L带挡板的烧瓶中分别进行500 mL培养，进行细菌培养。
  2. 在4 °C条件下，以3220 × g离心10 min收集菌体。随后保存于-80 °C，待后续使用。

第4天：

  1. 用 30 mL 裂解缓冲液平衡第 3.1.4 步制备的层析柱。
  2. 使用血清移液管将沉淀重悬于 20 mL 裂解缓冲液中。
  3. 在冰上使用 130 瓦探头式超声破碎仪（参见材料表，探头尖端直径：6 mm）裂解细胞，参数如下：脉冲开启 11 次，每次 20 秒；脉冲关闭 20 秒，振幅 70%（操作细节见第 2.16 步）。
  4. 超声处理后立即在 4 °C 下以 21130 × g 离心 20 min，去除细胞碎片。将裂解液置于冰上保存。
  5. 将上清液上样至层析柱，并使其自然流过。
  6. 使用以下裂解缓冲液与洗脱缓冲液的混合液洗涤层析柱。
    1. 洗涤 0：使用 30 mL 裂解缓冲液。
    2. 洗涤 1：使用 30 mL 含 5 mM 咪唑的缓冲液（29 mL 裂解缓冲液 + 1 mL 洗脱缓冲液）。
    3. 洗涤 2：使用 60 mL 含 25 mM 咪唑的缓冲液（50 mL 裂解缓冲液 + 10 mL 洗脱缓冲液）。
    4. 洗涤 3：使用 30 mL 含 40 mM 咪唑的缓冲液（22 mL 裂解缓冲液 + 8 mL 洗脱缓冲液）。
    5. 洗涤 4：使用 30 mL 含 60 mM 咪唑的缓冲液（18 mL 裂解缓冲液 + 12 mL 洗脱缓冲液）。
  7. 用 7.5 mL 洗脱缓冲液洗脱核糖体。洗脱后的蛋白样品需始终置于冰上。
  8. 向 45 mL 核糖体缓冲液中加入 22 µL 纯 β-巯基乙醇。
    警告：β-巯基乙醇具有毒性，操作时应采取安全防护措施，并在通风橱中进行。
  9. 将洗脱液加入 15 mL 离心过滤管中，浓缩至 1 mL。
  10. 向浓缩后的样品中加入 15 mL 核糖体缓冲液，再次浓缩至 1 mL。
    注意： 重复上一步骤两次。
  11. 于 -80 °C 保存，以备后续使用。
    ​注意：每轮缓冲液置换/浓缩过程需在 4 °C 下以 3220 × g 离心约 60 min。
  12. 在缓冲液置换过程中，按照第 1.4 节所述方法对层析柱进行再生处理。

第5天：

  1. 通过测量样品在核糖体缓冲液中稀释100倍后于260 nM处的吸光度来确定核糖体浓度。稀释后溶液的吸光度值为10时，对应未稀释溶液的浓度为23 µM，如前所述16。
  2. 配制终末储存浓度为3.45 µM。如需调整浓度，可用核糖体缓冲液稀释核糖体，或在4 °C下使用3 kDa、0.5 mL离心滤器以14000 × g离心进一步浓缩。
    注意：为获得最佳系统表达，应进行核糖体浓度滴定（见第5.2节，补充表7）。
  3. 按照第1.3.3节所述方法，使用SDS-PAGE验证核糖体组成（图3A）。取2.5 µL样品与7.5 µL水混合，再加入10 µL 2× Laemmli缓冲液，然后将5 µL和2.5 µL样品分别上样至凝胶中。

  1. 无标签核糖体纯化
    注意：无标签核糖体纯化使用FPLC系统（材料表）进行，基于采用2 x 5 mL丁基柱（材料表）的疏水相互作用色谱法。尽管核糖体可从任何菌株中纯化，但使用E. coli A19（耶鲁CGSC E. coli 遗传资源中心）菌株具有优势，因其缺失RNase I22。纯化过程应在4 °C的冷室或冷却柜中进行。通常产量约为0.5 mL的10 µM核糖体，足以进行五百次以上的10 µL PURE反应。

第1天：

  1. 按照补充表1中的说明配制细菌培养基和培养基添加剂。
  2. 准备并灭菌所需材料，包括移液器吸头、5 L 锥形瓶和100 mL 锥形瓶。
  3. 按照补充表2中的说明配制缓冲液和添加剂。使用瓶顶过滤器（0.45 µm）对所有缓冲液进行过滤灭菌，并于4 °C保存。

第2天：

  1. 为了制备过夜培养的 E. coli A19 菌株，接种 35 mL LB 培养基置于 100 毫升锥形瓶中，37 °C、260 rpm 振荡培养 rpm

第3天：

  1. 将2 L LB培养基转移至5 L无菌带挡板的烧瓶中，加入30 mL过夜培养物进行接种，然后在37 °C、200 rpm振荡条件下培养3–4 h。
  2. 在4 °C条件下，以4000 × g 离心15 min收集细胞沉淀。将沉淀重悬于25 mL悬浮缓冲液中，保存于-80 °C，待后续使用。

第4天：

  1. 并行执行步骤 3.2.8–3.2.12 与步骤 3.2.13–3.2.19。
  2. 在冰上使用 130 瓦探头式超声破碎仪（参见材料表，探头直径：6 mm）解冻并裂解细胞，参数如下：脉冲开启 12 次，每次 20 秒；脉冲关闭 20 秒，振幅 70%（详见步骤 2.16 的操作细节）。
  3. 立即在 4 °C 条件下以 20000 × g 离心 20 分钟，去除细胞碎片。
  4. 吸出上清液并测量体积。加入等体积的悬浮缓冲液（高盐），使硫酸铵终浓度达到 1.5 M，并充分混匀。
  5. 在 4 °C 条件下以 20000 × g 离心 20 分钟，去除沉淀。
  6. 在进行 FPLC 纯化前，使用 0.45 µm 聚醚砜膜注射式滤器过滤上清液，并将滤液收集至 100 mL 玻璃瓶中。全程保持上清液处于 4 °C。
  7. 按照以下方式设置 FPLC 系统，使用双丁基柱（2 × 5 mL）进行疏水相互作用层析纯化。在此设置中，一个柱体积（CV）指 10 mL 体积。
  8. 需要三个进样口：两个作为缓冲液通道，一个作为样品通道。由于纯化仪的默认设置，建议将 A1 和 B1 分别用于缓冲液 C 和缓冲液 D，A2 作为样品通道。除泵清洗（10 mL/min）或另有说明外，应用默认流速 4 mL/min。
    注意：由于 TCEP 是一种昂贵的试剂，仅在平衡步骤后向缓冲液 C 和 D 中加入相应量。
  9. 使用 20% ((v/v)) 乙醇进行系统泵清洗，以清洁系统并去除先前纯化可能残留的污染。手动设置流速为 0.2 mL/min，安装层析柱，然后停止流速。
  10. 用去离子水执行一次系统泵清洗。用 3 CV 去离子水清洗层析柱。
  11. 平衡：将进样口 A1 和 A2 置于不含 TCEP 的缓冲液 C 中，进样口 B1 置于缓冲液 D 中。执行泵清洗，并用 4 CV 缓冲液 C 平衡层析柱。
  12. 向缓冲液 C 和 D 中加入 TCEP。
  13. 准备 15 mL 管或透明圆形收集管置于馏分收集器中，用于收集 4–5 mL 的洗脱馏分。
  14. 上样：将进样口 A2 插入装有滤过样品的瓶子中。将约 90% 的样品体积加载到层析柱上。用含 TCEP 的缓冲液 C 稀释样品 20 mL，然后将 10 mL 样品上样至柱中。重复稀释步骤至少两次，并尽可能多地将样品上样至柱中。关键是要确保无空气被吸入仪器中。
  15. 清洗步骤 1：用 3 CV 缓冲液 C 洗涤，以去除未结合的组分。
  16. 清洗步骤 2：用 80% 缓冲液 C 和 20% 缓冲液 D 的混合液洗涤 5 CV。
  17. 洗脱：使用 50% 缓冲液 C 和 50% 缓冲液 D 洗脱产物，总洗脱体积为 5 CV。将此馏分收集至收集管中。
  18. 清洗步骤 3：使用 100% 缓冲液 D 洗脱所有强相互作用的杂质，总体积为 5 CV。
  19. 分析样品馏分在 260 或 280 nM 处的吸收光谱（图 4）。第一个峰代表在上样和第一次清洗步骤中被洗脱的非结合蛋白；第二个峰代表在第二次清洗步骤中被洗脱的杂质。第三个峰对应目标终产物，最后一个峰为强相互作用杂质。合并所有对应于第三个峰的样品馏分用于后续处理。全程保持洗脱蛋白处于冰上。
  20. 将回收的馏分小心地覆盖于四个聚碳酸酯超速离心管中各 15 mL 的垫层缓冲液上。每管最多加入 15 mL 样品至 15 mL 垫层缓冲液中。确保各管重量平衡良好。在 4 °C 条件下以 100000 × g 超速离心 16 小时，沉淀核糖体。
    注意：确保超速离心管无任何裂纹。
  21. 按以下步骤清洗并重置层析柱。5 mL/min 的流速效果良好。将所有进样口置于水中，执行泵清洗，并用 2 CV 水清洗层析柱。
    1. 将进样口置于 0.5 M NaOH 溶液中，执行泵清洗，随后用 3 CV NaOH 清洗层析柱。
    2. 将进样口置于水中，执行泵清洗，然后用 2 CV 水清洗层析柱。
    3. 将进样口置于 0.1 M 乙酸溶液中，执行泵清洗，随后用 3 CV 乙酸溶液清洗层析柱。
    4. 泵清洗并用 2 CV 水清洗层析柱。
    5. 将所有进样口置于 20% ((v/v)) 乙醇中，执行一次泵清洗步骤，并用 3 CV 20% ((v/v)) 乙醇溶液清洗后，将层析柱保存在 20% ((v/v)) 乙醇中。
      注意：确保系统始终不干涸或吸入空气。切勿将缓冲液直接加入乙醇，或乙醇直接加入缓冲液。两者之间必须加入水清洗步骤，否则可能产生沉淀堵塞层析柱。确保准备足够数量的样品收集管。

第5天：

  1. 弃去上清液，小心地用 0.5 mL 冰冷核糖体缓冲液洗涤每个透明沉淀，操作时勿扰动沉淀。重复此步骤两次。
  2. 在冰上使用磁力搅拌器，以最低转速，用磁力搅拌子（直径 3 mm，长度 10 mm）将每个透明沉淀重悬于 100 µL 核糖体缓冲液中。收集重悬的核糖体，并用额外的 50 µL 核糖体缓冲液冲洗离心管。
    注意：透明沉淀不易观察，因此应小心地从管壁四周冲洗沉淀。
  3. 通过测定样品在核糖体缓冲液中按 1:100 比例稀释后在 260 nm 处的吸光度来确定核糖体浓度。如先前所述16，稀释液吸光度为 10 时，对应未稀释溶液的浓度为 23 µM。
  4. 制备终浓度为 10 µM 的核糖体储备液。如需调整浓度，可用核糖体缓冲液稀释核糖体，或在 4 °C 下使用 3 kDa 离心滤管以 14000 x g 离心进一步浓缩。
    注意：为获得最佳系统表达效果，应进行核糖体滴定（见第 5.2 节，补充表 7）。
  5. 按照第 1.3.3 节所述方法，通过 SDS-PAGE 验证核糖体组成（图 3A）。取 2.5 µL 样品加入 7.5 µL 水稀释，与 10 µL 2x Laemmli 缓冲液混合，然后分别上样 5 µL 和 2.5 µL 至凝胶中。

4. 能量溶液

注意：此处介绍的2.5x能量溶液配方是适用于标准TX-TL反应的一种有效溶液示例。为优化时间安排，建议在第2天制备能量溶液。随后将详细说明氨基酸溶液的制备方法，最后介绍最终的配制步骤。

  1. 氨基酸溶液
    注意：请批量配制氨基酸溶液。配制最终体积至少为 2000 µL 的氨基酸储备液，可减少因称量极微量物质而产生的误差。氨基酸溶液的总体浓度受限于各氨基酸的溶解度及其相应储备液的浓度。对于标准 PURE 体系，应配制终浓度为 3.25 mM 的氨基酸溶液。使用氨基酸溶液计算表（补充表3) 作为模板。使用盐形式的半胱氨酸以确保足够的溶解度。避免使用基于 KOH 的氨基酸制备方法。可以直接将氨基酸精确称量至最终氨基酸溶液中，而无需为所有氨基酸预先配制储备液。然而，这种方法更具挑战性且精确度较低。
    1. 按照所述方法为每种氨基酸配制储备液 补充表3，酪氨酸除外。
      注意：由于各种氨基酸在水中的溶解度不同，其建议的储备液浓度也有所差异。
    2. 最小质量 [mg] 提供了为目标总体积配制足够量储备液所需的大致最小质量，仅供参考。
      注意：最小质量按10%的余量计算。
    3. 为更简便地配制溶液，无需称量氨基酸的精确质量，而是根据实际称取的质量，调整加水量以达到目标浓度。根据实际称量的质量（浅黄色单元格）和目标浓度，利用电子表格计算所需去离子水的体积（需添加的水量 [µL]）。 补充表3.
    4. 通过涡旋振荡溶解氨基酸储备液，直至所有沉淀完全溶解。单个氨基酸储备液可在 -20 °C 下保存数周。
      注意：某些氨基酸在水中难以溶解，该过程可能需要一段时间。
    5. 称取精确量的酪氨酸，以获得终浓度为 3.25 mM 直接加入氨基酸溶液管中。
      注意：酪氨酸极难溶于水，建议直接加入，不要预先配制母液。
    6. 根据“需添加的终体积 [µL]”列（浅蓝色单元格）中所示，加入相应量的氨基酸储备液和水，并充分涡旋混匀。将配制好的氨基酸溶液于 -80 °C 保存，直至后续使用。
  2. 能量溶液的配制
    注意：总体而言，2.5倍能量溶液中含有0.75 每种氨基酸的浓度为 29.5 mM 250 毫摩尔的醋酸镁 5 毫摩尔谷氨酸钾 ATP 和 GTP 各 2.5 mM mM 的 CTP、UTP 和 TCEP，以及 8.75 mg/mL 的 tRNA E. coli MRE 600, 50 0.05 毫摩尔磷酸肌酸 5 毫摩尔的亚叶酸 mM 亚精胺和 125 mM HEPES。初次使用者应将能量溶液配制成每份200 µL的小批量。将按此方法制备的各溶液分别储存于 补充表4 在 -20 °C 或 -80 °C 保存，以备后续使用。
    1. 解冻本实验中提及的所有水溶液 补充表5 置于冰上。
    2. 同时，配制所列其余组分的储备溶液 补充表 4制备完成后，将所有溶液置于冰上保存。
      注意：向冻干 tRNA 小瓶中直接加入 500 µL 无 RNase 和 DNase 的水，轻轻涡旋混匀；尽量减少移液操作，以避免引入 RNase。
    3. 加入计算好的体积（补充表5) 储备液和水，使用涡旋振荡器充分混匀。溶液须始终置于冰上保存。
    4. 用移液器吸取1 µL溶液滴加到pH试纸上，测定溶液pH值，以确保溶液为中性。
    5. 将能量溶液在冰上分装至每管50–100 µL，于-80 °C保存备用。分装过程中需频繁涡旋混匀母液，以防止组分沉淀。
      ​注意：可选择对新制备的能量溶液与市售能量溶液进行活性测定实验，例如 PURExpress 中的溶液 A。若观察到能量溶液导致系统性能显著下降，通过滴定优化离子浓度（尤其是镁离子，5-20 mM）可能有助于改善。

5. 一步法 PURE 反应

  1. DNA 模板
    注意：在 PURE 系统中，T7 启动子下游编码的蛋白质可由线性或环状 DNA 表达。通过延伸 PCR 生成线性 DNA 模板，可省去繁琐的克隆步骤。本研究中使用的线性模板通过以下所述的 PCR 方法制备，使用高保真 DNA 聚合酶（材料表）。引物序列、退火温度以及本研究中使用的热循环仪设置详见 补充表 6。DNA 模板的制备不包含在每日实验流程中。
    1. 按照聚合酶供应商的建议设置 PCR 反应。
      注意：高保真 DNA 聚合酶（材料表）的优化参数见 补充表 6。
    2. 使用基因特异性引物（500 nM）从质粒或基因组中扩增目标基因（例如 eGFP）作为线性模板（参数见 补充表 6）。
    3. 扩增产物带有短的延伸序列，用于后续延伸 PCR 步骤中的退火。
    4. 通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小和纯度。
    5. 将扩增得到的 DNA 用作后续延伸步骤的模板。设置至少 50 µL 的反应体系。
    6. 使用延伸引物（2.5 nM）进行 10 个 PCR 扩增循环。完成扩增循环后，立即向同一反应体系中加入最终引物（500 nM），再进行 30 个循环以扩增延伸后的 PCR 产物。引物序列和退火温度见 补充表 6。
    7. 使用 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA 片段，并用无核酸酶水而非含 EDTA 的洗脱缓冲液洗脱 DNA。
    8. 通过琼脂糖凝胶电泳检测线性模板的大小和纯度。
    9. 使用紫外-可见分光光度计测定 DNA 浓度（单位：ng/µL）。
  2. 设置 PURE 反应
    注意：最终反应组成为 1x 能量溶液、无标签核糖体或 His 标签核糖体、OnePot PURE 蛋白以及 DNA 模板。反应体积比例为 40% 能量溶液、30% 蛋白与核糖体溶液、30% DNA 与水。典型反应体积在 5 µL 至 25 µL 之间。使用酶标仪连续定量检测荧光蛋白的表达。使用 Green Lys 体外 翻译标记系统，将荧光标记的赖氨酸残基掺入新合成的蛋白质中，以在 SDS-PAGE 凝胶上验证非荧光蛋白的表达。示例反应模板见 补充表 7，以帮助建立 PURE 无细胞表达反应。黄色单元格表示需用户输入的数值，橙色单元格表示可选择性添加的额外试剂。保持各组分的体积比例精确，以确保正确的离子平衡。例如，为获得更高的蛋白浓度，可提高 OnePot 蛋白溶液的浓度，但不要增加加入反应中的蛋白溶液体积。
    1. 在电子表格的相应黄色单元格中填写 DNA 的浓度 [ng/µL] 和长度 [碱基对]。反应中使用 2–10 nM 的 DNA。
    2. 填写所需的总反应体积（单位：µL）。
    3. 从冰箱中取出所需试剂，并在冰上解冻。
      注意：组分可重新冷冻，功能不会下降。但应尽量减少冻融次数，并尽量减少样品在冰上存放的时间。
    4. 将计算好的水、DNA 和能量溶液的体积移液至 PCR 管的一侧或 384 孔板的一个角落。将任何额外试剂也加在同一侧。尽量减少每次实验的样品数量，以避免样品蒸发和实验起始时间偏差。
      注意：必须将能量组分与蛋白组分物理分离，以防止能量源过早消耗而导致产量降低。
    5. 将计算好的蛋白和核糖体溶液的体积移液至 PCR 管的另一侧或 384 孔板的对角位置。
      注意：尽可能使用预混液（master mix），以减少移液误差的影响。在初步测试后，核糖体溶液和蛋白溶液可混合并作为单一溶液储存。
    6. 短暂离心（30 秒）以混合反应组分。为防止酶标仪实验过程中的蒸发，加入 35 µL 液体石蜡，并使用透明封板膜密封（见 材料表）。
    7. 在 37 °C 下孵育至少 3  小时。
    8. 若使用酶标仪读数，每隔 2  分钟在所需波长下测量荧光强度（代表性结果见 图 3B）。
    9. 对 Green Lys 标记的样品执行以下步骤。
    10. 无细胞表达完成后，在 37 °C 下用 0.16 µg/µL 的 RNase A 孵育样品 30  分钟，以去除 Green Lys 标记试剂盒的荧光背景。
      注意：应使用 RNase A，因为其他类型的 RNase 无法充分去除背景。
    11. 按照第 1.3.3 节所述进行 SDS-PAGE 以检测蛋白表达。将未染色的凝胶用去离子水轻轻洗涤，并使用 488 nm 激发波长在荧光成像仪上成像。
    12. 随后使用常规考马斯亮蓝染色方法对凝胶进行染色。合适的参数参见第 1.3.3 节。
      注意：使用推荐的核糖体浓度对蛋白溶液进行滴定，如有需要，再使用最优 OnePot 蛋白浓度对核糖体进行滴定。使用商业化的 PURExpress ΔRibosome 试剂盒作为阳性对照。溶液 A、因子混合物和核糖体溶液分别对应所制备的能量溶液、OnePot 蛋白溶液和纯化的核糖体。

结果

上述方案旨在帮助任何实验室建立PURE无细胞转录-翻译（TX-TL）系统。该方案详细描述了PURE系统的三个独立组分的制备过程：OnePot蛋白、核糖体和能量溶液。优化工作流程的详细每日时间安排见表1。该工作流程针对带His标签核糖体的纯化进行了优化；若进行无标签核糖体纯化，各步骤所需时间可能略有不同。一次制备所得的PURE系统组分足以进行至少五百次10 µL反应。此外，制备好的溶液在-80 °C下可稳定保存一年以上，并能耐受多次冻融循环。

所有菌株的充分过表达水平对于最终蛋白质溶液的功能至关重要。图1展示了后续用于OnePot蛋白质制备的全部36个独立菌株中均实现了成功的过表达。过表达蛋白条带强度的差异很可能源于上样体积在SDS-PAGE凝胶中的偏差。预期的蛋白质大小汇总于表2中。GlyRS和PheRS由两个不同分子量的亚基组成；其余34种蛋白质均由单个亚基构成。本实验方案简洁高效的关键在于共培养与共纯化步骤（图2）。通过提高EF-Tu菌株相对于其他所有表达菌株的比例，制备了OnePot蛋白质溶液。最终蛋白质的整体组成通过SDS-PAGE进行分析（图3A）。从凝胶结果（泳道2、3）可以看出，EF-Tu（43.3 kDa）的浓度明显高于其他蛋白质，与预期一致。尽管凝胶电泳可初步反映蛋白质表达比例，但难以确定每种单个蛋白质是否表达以及其表达水平。因此，强烈建议在共培养前如上所述验证每种菌株中的过表达情况。

的 E. coli 核糖体是由50多个独立的蛋白质亚基组成的复杂分子机器23在260 nm处的无标签核糖体纯化代表性吸收光谱如图所示 图4；第三个峰是核糖体成功洗脱的特征。对于这两种核糖体纯化方法，在SDS-PAGE凝胶上预期的跑胶模式（图3A)18 观察到污染现象。我们在两次纯化过程中均观察到了污染，尽管污染量较小（<10%）。值得注意的是，由于方法不同，无标签核糖体（第5、6泳道）和带His标签的核糖体（第11、12泳道）中存在的污染物也不同。为方便用户参考，还提供了合并体系的SDS-PAGE凝胶结果（第8、9泳道以及第14、15泳道）。

最后，比较了使用不同核糖体变体的制备系统（图3）的性能。体外 eGFP 表达的时间进程显示，两种 PURE 系统均具有功能并可产生荧光 eGFP。然而，将 OnePot 蛋白溶液与 His 标签核糖体结合，并采用滴定优化的核糖体浓度时，其表达水平仅为非标签核糖体版本的三分之一（图3B）。当使用 Green Lys tRNA 体外 标记系统表达并标记三种不同大小的蛋白质时，也观察到类似结果（图3C）。如荧光凝胶所示，两种系统均成功表达了全长产物；但 His 标签核糖体系统的表达水平仅达到约一半。除荧光标记外，在考马斯亮蓝染色凝胶上也可清晰分辨出三种蛋白质的预期条带（图3D）。结果表明，该引入的表达系统可在配备常规设备的实验室中于一周内完成制备，适用于从线性模板上 T7 启动子下游编码的蛋白质的体外表达。

SDS-PAGE蛋白质表达检测，用于分析蛋白质条带的凝胶电泳结果
图1：PURE系统所有表达菌株过表达检测的代表性结果。 PURE蛋白的编号和大小总结于表2中。蛋白编号21、24和27用星号标记，以便更清晰地观察。请点击此处查看该图的放大版本。

OnePot 蛋白质纯化流程图；重悬、超声、孵育、纯化步骤。
图 2：OnePot 蛋白质纯化。 OnePot 蛋白质溶液制备过程中所有步骤的示意图及相应照片。请点击此处查看该图的放大版本。

SDS-PAGE蛋白质分析；eGFP表达；核糖体性能图；无标签核糖体与His标签核糖体对比
图3：使用不同核糖体变体的制备系统的性能表现。 (A) OnePot蛋白溶液（泳道2、3）、无蛋白溶液的无标签核糖体（泳道5、6）和含蛋白溶液的无标签核糖体（泳道8、9）、无蛋白溶液的His标签核糖体（泳道11、12）和含蛋白溶液的His标签核糖体（泳道14、15）的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。每个样品加载了两种不同的浓度。B) 带有His标签的核糖体与无标签核糖体的eGFP表达比较。荧光强度的 体外 使用无标签核糖体的PURE反应中，随时间监测eGFP的表达1.8 µM，蓝色）和带 His 标签的核糖体（0.62 µM，红色）。线性模板和OnePot蛋白溶液的浓度分别为4 nM和2 mg/mL。图（C）和（D) 显示在OnePot中合成的无标签蛋白的SDS-PAGE凝胶结果1.8 µM，蓝色，泳道 3、4、5）以及 His标签核糖体（0.62 µM，红色，第6、7、8泳道）用GreenLys标记 体外 标记试剂盒（C）并用考马斯亮蓝染色（D），分别表示合成蛋白质的预期条带：eGFP（26.9 kDa）、ArgRS（64.7 kDa）、T7 RNAP（98.9 kDa）。线性模板和OnePot蛋白溶液的浓度分别为4 nM和1.6 mg/mL。 请点击此处以查看此图的放大版本。

层析结果；吸光度与体积关系；洗脱峰；蛋白质纯化图谱。
图 4：260 nm 处的吸光度光谱。 无标签核糖体经疏水相互作用纯化过程中 260 nm 处吸光度光谱的代表性结果。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：制备所有OnePot PURE溶液的每日时间优化方案。 请点击此处下载该表格。

表2：PURE蛋白列表 请点击此处下载该表格。

补充表 1：试剂。 本表格列出了本研究中所用试剂和组分的浓度、体积及其他具体细节。请点击此处下载该表格。

补充表 2：缓冲液。 该电子表格列出了用于蛋白质、无标签核糖体和 His-标签核糖体纯化的各种缓冲液的精确组分，以及配制这些缓冲液所用储备液的浓度。此外，该表格还可根据所需缓冲液体积自动计算各组分的用量。请点击此处下载该表格。

补充表3：氨基酸计算。 该电子表格列出了能量溶液所需的氨基酸及其推荐的储备溶液浓度。根据实际称量的质量，计算每种氨基酸需加入的水量，并计算将各氨基酸溶液加入最终氨基酸混合液中的体积。请点击此处下载该表格。

补充表4：能量溶液的储备液。 该表格列出了配制能量溶液所需的储备液浓度和体积，并提供了包括储存条件在内的进一步详细信息。请点击此处下载该表格。

补充表5：能量溶液。 该表格列出了能量溶液的组分及其推荐浓度。此外，根据各组分的储备液浓度以及能量溶液的总体积，计算了需加入终溶液的相应体积。请点击此处下载该表格。

补充表6：PCR。 该表格列出了用于延伸PCR的引物序列和浓度，并标明了针对高保真DNA聚合酶优化的退火温度以及PCR仪的反应程序。请点击此处下载该表格。

补充表 7：PURE 反应。 该电子表格展示了 PURE 反应的一个示例设置，列出了使用无标签核糖体或 His 标签核糖体时各组分的使用浓度和体积。此外，它还计算了蛋白质和核糖体滴定的体积比例。请点击此处下载该表格。

讨论

本文所述方案介绍了一种简单、省时且经济的方法，用于制备一种多功能的PURE表达系统20 根据标准组成15通过结合使用本方案与提供的每日时间表（表1），所有组分可在1周内完成制备，产量足以进行多达五百次10 µL的PURE反应。由于本方案中使用的蛋白质由高拷贝质粒过表达，且对宿主毒性较低 E. coli，所有所需蛋白均观察到良好的表达水平（图1这使得通过简单调整接种菌株的比例，即可方便地调节共培养体系中的菌株组成，进而调节蛋白质组成。20除了核糖体蛋白外，EF-Tu 的浓度也被证明对表达产量具有重要意义6相比之下，其他蛋白质组分浓度的变化对PURE系统的稳健性影响相对较小7,24因此，通过调整EF-Tu相对于其他所有组分的接种比例，可获得与标准PURE体系相似的组分构成，从而实现产量相近的PURE系统20 可以实现。在制备蛋白质溶液时，关键是要确保所有菌株在诱导后能够良好生长并过表达所编码的蛋白质（图1).

核糖体功能对PURE系统的整体性能至关重要24在本实验方案中，展示了两种不同的核糖体溶液制备方法，即无标签核糖体纯化和带His标签核糖体纯化。无标签核糖体纯化基于疏水相互作用层析，随后通过蔗糖垫进行离心，该方法需要使用FPLC纯化系统和超速离心机。15相比之下，利用带His标签核糖体的方法18 重力流亲和层析纯化无需专用设备，可在大多数实验室中进行。因此，后一种方法具有操作简便和易于获取的优势。然而，我们观察到在 OnePot PURE 体系中使用带 His 标签的核糖体时，其合成产量显著低于无标签的版本（图3根据应用类型，这种较低的产量可能是可以接受的。

能量溶液提供驱动反应所需的低分子量组分和tRNA 体外 TX-TL 反应。本方案提供了一种典型能量溶液的配制方法，可根据用户需求轻松调整。与 tRNA、NTP 和磷酸肌酸一起，Mg 的丰度和浓度2+ 离子对PURE系统的整体性能至关重要8，因为它们是转录和翻译过程中的关键辅因子。在某些情况下，通过滴定离子浓度可显著提升整体PURE系统的性能。DNA完整性对PURE系统的性能至关重要。因此，需对启动子区域、核糖体结合位点及目的基因进行测序验证，并确保有足够的DNA浓度（<2 nM）将有助于在建立PURE反应时排查可能出现的问题。

PURE 系统是一种最简的转录-翻译偶联系统，因此特定应用可能需要额外的调整25。这些调整可能包括引入不同的RNA聚合酶9,26、分子伴侣13，以及EF-P或ArfA等蛋白质因子8。尽管这些蛋白质的表达菌株可被包含在共培养体系中，但将其单独添加至制备好的系统中可能更有利于精确控制所需蛋白的表达水平。此外，囊泡的加入对于膜蛋白的合成至关重要10,11。相较于还原性环境，氧化性环境以及二硫键异构酶有助于正确形成二硫键，这对于分泌蛋白等的正确折叠尤为重要12。

必须确保任何添加的组分不会干扰反应。在设置反应或添加其他组分时，需注意以下最重要的因素。应避免使用不相容的缓冲液，或干扰离子浓度。尽可能避免使用含有甘油、高浓度钾离子、镁离子、钙离子、渗透调节剂、焦磷酸盐、抗生素或EDTA的溶液。例如，在DNA纯化过程中，用纯水替代洗脱缓冲液可能更有利，因为EDTA是此类缓冲液中常见的添加剂。当向反应体系中加入额外的带负电荷分子（如NTP或dNTP）时，需相应调整镁离子浓度8，因为这些带负电荷的分子可作为螯合剂，与带正电荷的离子结合。反应体系宜维持中性pH值。因此，所有组分均应使用相应pH值的缓冲液进行配制；这一点对于NTP等强酸性或强碱性分子尤为重要。最后，温度和体积是反应的关键参数。为获得较高的产率，建议采用约37 °C的反应温度，因为低于34 °C的温度将显著降低产率27。

需要注意的是，在制备OnePot PURE系统之前，应考虑目标应用及其相关要求，例如体积、纯度、修饰的难易程度，以及组分的包含或省略。对于许多应用而言，该系统将是极佳的选择，但某些应用可能需要更高的产量、可调节性及其他OnePot系统无法提供的因素。无论何种情况，本文介绍的方案都将有助于任何自制系统的制备，因为此处已总结了此类制备过程中的所有关键步骤。

OnePot 系统的主要优势之一是其与市售 PURExpress 系统的兼容性，这使得可以通过将 PURExpress 系统的各个组分依次替换为 OnePot 对应组分，来分别测试所有组分的功能性和完整性。OnePot PURE 系统具有可调节性强、制备简便快速且成本低等优点，将使无细胞转录-翻译系统在全球范围内被更多实验室所采用，并推动这一强大平台在无细胞合成生物学中的更广泛应用。

披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了欧洲研究理事会欧洲联盟“地平线2020”研究与创新计划资助（编号723106）、瑞士国家科学基金会资助（编号182019）以及洛桑联邦理工学院（EPFL）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液伯乐生命科学公司1610732
15 mL 离心管VWR International525-0309
384孔黑色检测板康宁3544
4-20% Mini-PROTEAN® TGX™ 预制蛋白凝胶伯乐生命科学公司4561096
50 mL 离心管VWR International525-0304
96孔聚丙烯深孔板Nunc260252
乙酸，99.8 %阿克罗斯222140010
Äkta purifierGE Healthcare无标签核糖体的纯化
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa默克密理博UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa默克密理博UFC900324
氨基酸Sigma-AldrichLAA21-1KT
氯化铵Sigma-Aldrich09718-250G
硫酸铵Sigma-AldrichA4418
氨苄青霉素康达实验室6801
BenchMark 荧光蛋白标准品ThermoFisherLC5928
Breathe-Easy 封膜Diversified BiotechZ380059-1PAK
聚碳酸酯离心管贝克曼355631无标签核糖体的纯化
Chill-out 液体蜡伯乐生命科学公司CHO1411
磷酸肌酸Sigma-Aldrich27920
DNA 纯化 & 浓缩仪-25（带盖）ZymoZYM-D4034-200TS
DTTSantaCruz Biotechsc-29089B
Econo-Pac 层析柱伯乐生命科学公司7321010
EDTA（乙二胺四乙酸）Sigma-Aldrich03609-250G
Eppendorf Protein LoBind 微量离心管VWR International / Eppendorf525-0133
Falcon 14 mL 圆底聚苯乙烯试管，带卡扣盖Falcon352051
1000 mL 带挡板锥形瓶，4 片挡板，硼硅酸盐玻璃Scilabware9141173
FluoroTect Green Lys 体外翻译标记系统普洛麦格L5001可选
亚叶酸Sigma-AldrichPHR1541
甘油Sigma-AldrichG7757-1L
HEPESGibco15630-056
HiTrap Butyl HP 柱GE Healthcare28411005无标签核糖体的纯化
IMAC Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-0921-07
咪唑Sigma-AldrichI2399
InstantBlueExpedeonISB1L-1L
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）Alfa AesarB21149.03
Laemmli 缓冲液 (2x)，上样缓冲液Sigma-AldrichS3401-1VL
LB 培养基AppliChemA0954
乙酸镁Sigma-AldrichM0631
氯化镁Honeywell Fluka63020-1L
硫酸镍Alfa Aesar15414469
NTPThermoFisherR0481
Phusion 高保真 DNA 聚合酶（2 U/μL）µL赛默飞世尔科技F530S
氯化钾Sigma-AldrichP5405-1KG
谷氨酸钾Sigma-Aldrich49601
PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒NEBE6800S
PURExpress Δ 核糖体试剂盒NEBE3313S
Quick Start Bradford 1x 染料试剂伯乐生命科学公司5000205
快速流动式无菌一次性真空滤器单元赛默飞世尔科技564-0020
RNaseA 溶液PromegaA7973
SealPlate 薄膜Excel ScientificZ369659-100EA
氢氧化钠Sigma-Aldrich6203
亚精胺Sigma-AldrichS2626
蔗糖Sigma-Aldrich84097
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）Sigma-Aldrich646547-10X1mL
厚壁聚碳酸酯管贝克曼355631
三氯乙酸Sigma-AldrichT0699
Tris 碱赛默飞世尔科技BP152-500
tRNA罗氏10109541001
超速离心机 Optima L-80贝克曼无标签核糖体的纯化
Whatman GD/X 注射器滤器GE WhatmanWHA68722504
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250-100mL

参考文献

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