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退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

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DOI：

10.3791/62638

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2021年6月14日

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1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 4Singapore Eye Research Institute (SERI), 5UCL Institute of Ophthalmology, 6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 8Department of Ophthalmology, University of Bonn

* These authors contributed equally

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摘要

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）移植在治疗遗传性和获得性视网膜变性类疾病方面具有广阔前景。这类疾病包括视网膜色素变性（RP）以及年龄相关性黄斑变性（AMD）的晚期形式，例如地图样萎缩（GA）。这些疾病共同构成了全球目前无法治愈的失明病例中的很大一部分。这些尚未满足的医疗需求促使学术界对开发RPE替代疗法产生了日益浓厚的兴趣。在常用于治疗手段临床前测试的动物模型中，非人灵长类动物（NHP）是唯一具有黄斑的动物模型。由于其眼部具有与人类眼睛相似的解剖结构，NHP眼睛是开发视网膜色素上皮细胞治疗等先进治疗用医药产品（ATMPs）的重要且合适的临床前动物模型。

本论文描述了一种在免疫抑制的非人灵长类动物（NHP）中，将培养于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）细胞载体上的视网膜色素上皮（RPE）单层细胞移植至黄斑下、并置于手术制造的RPE创口处的方法。在移植过程中，中央无血管区——即黄斑中心凹，是机械强度最薄弱的部位。若初始的视网膜下液体注射对视网膜产生过大的作用力，则可能导致中心凹损伤。因此，建议在全氟碳液体（PFCL）玻璃体填充下，采用双通道视网膜下注射套管，在较低的眼内压（IOP）条件下缓慢注射，以形成视网膜下隆起（retinal bleb）。

建议预先玻璃体内注射纤溶酶原，以解除旁中心凹处视网膜色素上皮（RPE）与光感受器之间的黏连。与传统技术相比，这些联合策略可降低中心凹撕裂的发生风险。非人灵长类动物（NHP）是RPE细胞治疗临床前研究中的关键动物模型。本方案针对在NHP眼内递送RPE细胞治疗所面临的技术挑战。

引言

视网膜色素上皮（RPE）移植在治疗遗传性和获得性视网膜变性疾病方面具有广阔前景。这些疾病包括视网膜色素变性（RP，杆锥细胞营养不良）以及年龄相关性黄斑变性（AMD）的晚期形式，如地理样萎缩（GA）。总体而言，这些疾病构成了目前全球范围内大量无法治愈的失明病例的重要部分1,2。AMD 的晚期分为新生血管性 AMD（nAMD）和地理样萎缩（GA）。尽管对于 nAMD 已有有效的治疗手段，例如抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）注射，但 GA 患者的治疗选择仍然有限。RP 是一组高度异质性的遗传性视网膜疾病，其特征是视网膜感光细胞进行性退化。在部分患者中，致病性遗传缺陷位于 RPE 而非感光细胞本身；因此，当基因治疗不可行时，RPE 替代治疗可能是一种替代策略。

人们对于开发这些疾病的高效治疗方法具有浓厚兴趣。特别是，视网膜色素上皮（RPE）移植作为一种潜在的治疗策略正受到越来越多的关注3,4,5,6,7,8。自20世纪80年代首次报道RPE移植以来9，该领域已扩展至包括多种RPE细胞来源、递送策略以及疾病和移植的实验模型10,11,12,13,14。在各种动物模型中，只有非人灵长类动物（NHP）具有与人类共有的解剖学特化结构——位于视网膜后极的“黄斑”（macula lutea）及其中央凹（fovea centralis）。中央凹含有极高密度的视锥光感受器，从而实现高分辨率的中心视力15。此外，NHP在基因组和蛋白质组构成上也与人类相似16。这些相似性使其成为研究影响人类视网膜的眼部疾病的重要且合适的动物模型17,18。

本论文描述了一种在免疫抑制的非人灵长类动物（NHP）中进行视网膜色素上皮（RPE）异种移植的方法，该移植以聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）细胞载体作为支撑，置于视网膜下腔。既往已有论文描述了通过玻璃体途径在兔眼中进行视网膜下腔RPE移植的技术19。然而，在NHP中，由于黄斑中心凹的存在，术中操作需格外谨慎20。特别是，若视网膜下液体注射方法对视网膜产生过大的作用力，则极易导致中心凹撕裂20。因此，本论文的重点在于降低NHP术中意外发生中心凹损伤风险的策略。

这些技术包括术前玻璃体内注射纤溶酶原以解除旁中心凹粘连，以及术中使用手术显微镜集成的光学相干断层扫描（miOCT）实现对中心凹解剖结构的实时可视化。建议采用自制的25/41 G双通道视网膜下导管，在眼内灌注全氟化碳液体（PFCL）并维持低眼压条件下进行操作，以实现更可控的中心凹脱离过程。此外，建议在移植前手术清除宿主的视网膜色素上皮（RPE），以促进移植的RPE细胞与宿主光感受器之间的更好整合。最后，文中描述了一种适用于非人灵长类动物（NHP）模型的围手术期和术后全身免疫抑制方案，以提高RPE异种移植后的细胞存活率11,21。

方案

注意：所有动物实验均遵循眼科与视觉研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的准则进行。实验已获得新加坡SingHealth机构动物护理与使用委员会的伦理批准。动物饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC）认证的SingHealth实验医学中心。AAALAC）。此批准表明所有动物实验均符合新加坡农粮兽医局（Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore）颁布的国家实验动物研究咨询委员会指南标准。以下实验方案基于6只眼（来自6只动物）的实验建立 Macaca fascicularis （4只雄性，2只雌性，4至6岁，2.8至4.0 kg） .

1. 在非人灵长类动物模型中实现免疫抑制

  1. 在手术前7天开始免疫抑制治疗，并在整个随访期间持续进行免疫抑制。
  2. 在给予全身性免疫抑制药物前称量非人灵长类动物（NHP）的体重，以确保用药剂量准确。 动物在基线时称重，之后每周称重一次。
  3. 使用口服雷帕霉素（sirolimus）、多西环素（doxycycline）和米诺环素（minocycline）实现全身性免疫抑制。
    1. 先给予2 mg口服雷帕霉素的负荷剂量，随后每日维持剂量为1 mg。在给药前获取基线血液雷帕霉素浓度，并在整个随访期间持续监测。确保雷帕霉素浓度至少达到5 µg/L，以实现充分的免疫抑制。
      注意：雷帕霉素剂量 无需根据体重调整。
    2. 每日口服多西环素剂量为7.5 mg/kg，分两次给药。 
    3. 每日口服米诺环素剂量为7.5 mg/kg，分两次给药。 
  4. 在免疫抑制期间，监测所有非人灵长类动物是否出现严重的全身性不良反应。观察是否有明显体重减轻（>10%）、食欲和饮水量下降、毛发脱落且缺乏梳理、以及攻击性或嗜睡等异常行为。评估将在第3天、第14天和第1个月进行，之后每月评估一次。

2. 仪器灭菌

  1. 使用蒸馏水冲洗手术器械。
  2. 将器械放入装有 500 mL 蒸馏水和 2 mL 器械消毒剂的超声波清洗机中，使用超声波清洗机的扫描功能清洗 15 分钟。
  3. 从超声波清洗机中取出器械，用蒸馏水彻底冲洗两次，每次冲洗 5 分钟。冲洗后将器械自然晾干。
  4. 将器械放入器械盒中，使用通用程序设置进行高压灭菌（在 134 °C 下灭菌 50 分钟：高压灭菌 30 分钟，干燥 20 分钟）。

3. 无防腐剂曲安奈德（40 mg/mL）的制备

  1. 使用1 mL注射器抽取1 mL曲安奈德溶液（10 mg/mL）。将其转移至15 mL锥形管中，并与4 mL无菌平衡盐溶液（BSS）混合。 
  2. 在120 × g 条件下离心5分钟。确保所有曲安奈德颗粒沉降至锥形管底部。弃去上清液（BSS）。
  3. 在锥形管中用5 mL无菌BSS重新悬浮曲安奈德颗粒。在120 × g 条件下离心5分钟。再次弃去上清液。
  4. 重复步骤3.3，完成对曲安奈德颗粒的BSS洗涤（共3次）。
  5. 用0.25 mL无菌BSS重新悬浮曲安奈德颗粒，使终浓度为40 mg/mL。
  6. 用一支新的1 mL注射器吸取重悬后的曲安奈德溶液（40 mg/mL）。安装一支25 G钝头吹管针头，将装有曲安奈德溶液的注射器置于一旁，以备术中使用。

4. 玻璃体内注射纤溶酶原（0.25 µg/µL）预处理非人灵长类动物眼睛

  1. 手术前一周，向眼内注射猴纤溶酶原（20 µL，浓度为 0.25 µg/µL）。
  2. 术前通过肌肉注射氯胺酮（10–20 mg/kg 体重）和皮下注射阿托品（0.05 mg/kg 体重）对非人灵长类动物（NHP）进行镇静。使用丁卡因滴眼液进行局部麻醉。
  3. 眼内注射前，用 10% 聚维酮碘消毒眼周区域。通过向非人灵长类动物的结膜穹窿部给予 5% 聚维酮碘进行眼部消毒。确保溶液在穹窿部停留至少 1 分钟，然后用无菌平衡盐溶液（BSS）彻底冲洗。
  4. 使用 250 µL 注射器从药瓶中吸取预稀释的猴纤溶酶原（0.25 µg/µL）。在注射器上安装 30 G 针头，并将猴纤溶酶原准备就绪，用于眼内注射。
  5. 使用卡尺确定眼部的注射位点。在距离角膜缘 3 mm 处进行眼内注射。
  6. 进针时将针头朝向眼球中心进行注射。拔出针头后，使用棉签压迫注射部位，防止眼内容物反流。
  7. 给予润滑凝胶或软膏，以减轻术后即刻的眼表刺激。

5. 手术台和设备设置

  1. 建立无菌区域。进入无菌区域时，必须始终穿着手术服、佩戴口罩和头罩。
  2. 准备用于术中玻璃体显影的无防腐剂曲安奈德（40 mg/mL）（参见第3节）。将无菌BSS装入10 mL注射器，润滑剂装入5 mL注射器，放置于无菌布上。
  3. 将其他器械准备好并置于无菌布上，包括3-0丝线、7-0薇乔缝线、棉签棒、伤口闭合贴片以及吊灯式内照明光纤导线。
  4. 使用无菌技术将玻璃体切除装置连接至玻璃体切除机，包括高速玻璃体切割头、文丘里盒和25G吊灯式内照明器。
  5. 打开一瓶500 mL眼科级BSS，按照制造商说明将其连接至文丘里盒。随后进行系统预充。
  6. 开启miOCT/手术显微镜。选择适用于后节手术和照明的显微镜预设配置。输入手术相关信息，包括编号、性别、动物眼别及手术名称。
  7. 安装非接触式广角128度眼底镜。
  8. 在手术显微镜/miOCT上安装无菌一次性手柄套。使用脚踏板调节显微镜位置和焦距。开始手术。

6. 麻醉准备及动物体位安置（建议由兽医团队执行）

  1. 在诱导麻醉前至少 8 小时确保非人灵长类动物（NHP）处于禁食状态，以防止反流和呕吐。在诱导麻醉前对 NHP 进行镇静（镇静操作详见步骤 4.2）。
  2. 使用 1% 托吡卡胺和 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液，至少滴眼 3 次，每次间隔 5 分钟，以实现充分的瞳孔散大。
  3. 在手术前 30 分钟给予肌肉注射布托啡诺（0.005–0.03 mg/kg 体重），以实现镇痛效果。
  4. 使用气管导管对 NHP 进行气管插管，导管尺寸通常为 3–5 mm。尝试插管时，应准备多种尺寸的导管。选择能够无创通过喉部的最大尺寸导管。 监测呼气末 CO2 以确认气管导管位置正确。
  5. 通过气管导管输送 2% 异氟烷气体以诱导全身麻醉。通过评估 NHP 对声音和触碰等外界刺激的反应，确认其是否达到全身麻醉状态（无触觉反应）。使用 0.5–2% 异氟烷气体维持全身麻醉状态。 
  6. 在整个手术过程中持续监测 NHP 的心电图、呼吸频率、血压和血氧饱和度。
  7. 将 NHP 置于手术台上，使术眼与手术显微镜垂直。对未手术眼使用润滑凝胶或眼膏，以减少麻醉期间角膜表面的刺激。
  8. 使用剪刀剪除眼睫毛，以降低感染风险。
  9. 使用 10% 聚维酮碘对眼周区域进行消毒。将 5% 聚维酮碘滴入 NHP 的结膜穹窿以消毒眼部。确保药液在穹窿处停留至少 1 分钟，然后用无菌 BSS 充分冲洗。
  10. 铺设无菌手术巾，使预切开的孔洞对准术眼中心。使用粘性手术切口巾覆盖术眼周围区域。
  11. 对术眼行外侧睑缘切开术。
  12. 插入利伯曼开睑器，以确保眼睑充分张开，便于术中观察眼球。

7. 玻璃体切除术

注意：为了进入视网膜下腔以递送PET支架RPE移植物，本方案建议使用标准玻璃体视网膜手术设备和非接触式广角128°眼底镜，进行4通道（带阀）25G玻璃体切除术。本方案还建议使用配备miOCT的手术显微镜，以指导多个关键手术步骤，包括黄斑脱离诱导、RPE移植物植入以及视网膜下液引流。

  1. 使用Vannas剪刀在角膜缘附近切开结膜，行360°结膜环形切开术。通过钝性分离扩大切口。
  2. 使用25G显微玻璃体视网膜刀，在右眼8点钟或左眼4点钟位置行巩膜切口。巩膜切口应位于角膜缘后3 mm处。
  3. 插入并用7-0薇乔缝线固定25G定制侧口灌注套管。确认套管位于玻璃体腔内后，启动BSS灌注，并将系统设置为维持眼内压（IOP）在20 mmHg。
  4. 使用25G平头套管穿刺针，在右眼2点钟或左眼10点钟位置行巩膜切口，操作同步骤7.2。
  5. 将25G吊灯式照明装置插入平头套管中，并用胶带固定。将光源强度调节至约60%。
  6. 在右眼10点钟或左眼2点钟位置再次行巩膜切口（操作同步骤7.2）。在切口周围预置U形7-0薇乔缝线，暂不打结。将玻璃体切割头经此切口插入眼内。
  7. 首先在各入口周围开始玻璃体切除，随后进行短核心玻璃体切除，设置如下：最大切割速度5000次/分钟，最大吸力400 mmHg。
  8. 注射20–50 µL曲安奈德（40 mg/mL），以增强玻璃体的可视性。
  9. 通过分离玻璃体与视网膜，诱导后玻璃体脱离（PVD）。
    1. 将玻璃体切割头置于视盘上方，轻柔诱导PVD。仅启用最大吸力（400 mmHg），不进行切割操作。
    2. 必要时，使用25G眼内镊在视盘边缘操作玻璃体，于玻璃体皮质上制造裂口，以促进脱离。
      注：若曲安奈德晶体可在视网膜表面无阻碍滑动，则视为PVD成功。
  10. 使用切割头打开后玻璃体后膜，并将已脱离的玻璃体裙边清除至玻璃体基底部（位于视网膜赤道部）。吸除视网膜表面残留的曲安奈德。

8. miOCT引导的黄斑脱离

  1. 注射 1-2 mL 的全氟化碳液体（PFCL），使其覆盖从后极部至前部中周视网膜区域。
  2. 使用视网膜下注射套管进入眼内。将玻璃体切除机的灌注压（IOP）设置为 0-4 mmHg（确保系统完全密闭；如有需要，可在套管口周围加缝线固定）。
  3. 使用连接 250 µL 注射器的 25/41 G 定制双孔视网膜下注射套管或 25/38 G 视网膜下注射套管，轻柔地注射平衡盐溶液（BSS），以诱导形成局限性视网膜脱离。当隆起区域刚好越过黄斑中心凹时，停止注射。从另一方向创建第二个隆起区域，并将两个隆起融合，以实现黄斑中心凹的完全脱离。
  4. 启动 intraoperative OCT（miOCT）功能以观察隆起形成过程。确保线扫描和立体扫描处于高清模式，参数设置为（512 × 128 像素，扫描宽度 4 mm），在黄斑中心凹处获取图像。通过 miOCT 图像确认神经视网膜在黄斑中心凹处已完全与视网膜色素上皮层（RPE）分离。
  5. 使用一对垂直的 25 G 玻璃体视网膜剪刀将视网膜切开扩大至 1.5 mm，以便进入视网膜下腔进行移植操作。

9. 去除天然视网膜色素上皮细胞

  1. 将玻璃体切除机的IOP设定为50 mmHg。
  2. 使用带毛刷的硅胶头套管，通过主动挤出法移除氟碳化物液体（PFCL）。
  3. 用1.4 mm切口刀扩大巩膜切口，以便插入20 G器械。
  4. 使用定制的20 G可伸展环形器械，刮除黄斑下区域的宿主视网膜色素上皮（RPE）以进行移除，刮除范围应至少达到2 × 3 mm。

10. 视网膜色素上皮细胞单层移植片递送枪的装填

  1. 关于将从RPE培养物中切取的子弹形移植物装载到PET细胞载体上的一般操作步骤，请参考先前的出版物22。

11. miOCT引导下的移植物植入与位置调整

  1. 在眼内压为 20 mmHg 时，将注射装置的尖端经巩膜切口插入，通过视网膜表面形成的视网膜切开边缘将植入物注入视网膜下腔。
  2. 注射植入物时，确保细胞载体侧朝向布鲁赫膜，而视网膜色素上皮异种移植物侧朝向光感受器。
  3. 启用 miOCT 功能以观察植入物位置。确认植入物平整地贴附于视网膜下腔的布鲁赫膜上，且其上方视网膜完整；同时确保其与所创建的视网膜切开处保持适当距离，未受切开部位的挤压。
  4. 使用视网膜下注射套管或 25 G 弯曲眼内剪刀调整植入物位置，确保其准确地位于黄斑下方。

12. miOCT引导下的视网膜下液引流术

  1. 使用带刷状硅胶头的套管针，进行液-气交换并小心地引流视网膜下液体。从视网膜脱离的隆起区域及视网膜切开边缘贴附处轻柔地进行视网膜下液体抽吸。
  2. 启用miOCT功能，实时观察视网膜下液体是否充分引流，直至视网膜完全复位并贴附于植入物表面。

13. 结束操作

  1. 使用预先放置的7-0薇乔缝线关闭工作端巩膜切口。移除25 G导光纤维和25 G灌注套管。用7-0薇乔缝线关闭这些巩膜切口。
  2. 在缝合前，于8点钟位置的巩膜切口处注射0.05 ml不含防腐剂的曲安奈德（40 mg/ml），剂量为2 mg。
  3. 触诊眼球以确保眼内压处于可接受范围内。如有需要，通过30 G针头注入过滤空气（或BSS）。
  4. 用7-0薇乔缝线缝合结膜，用5-0普理灵缝线缝合外眦切开处（10–14天后拆除）。

14. 术后动物护理

  1. 术后将非人灵长类动物（NHP）置于俯卧位 1 小时。在动物恢复意识之前，不得无人看护。确保有兽医和动物护理技术人员在术后过程中进行观察和提供支持。
  2. 术后 5 天内，每日两次局部使用抗生素（妥布霉素）、类固醇（地塞米松）软膏以及后马托品眼药水。
  3. 术后 6 小时再给予一次皮下注射布托啡诺（0.005–0.03 mg/kg 体重），以实现充分的镇痛。
  4. 仅当非人灵长类动物完全恢复意识后，方可将其归还至其他动物群体中。
  5. 手术后第 3 天、第 14 天和第 1 个月进行多模态影像学随访，之后每月进行一次检查。手术后每月进行一次视网膜电图（ERG）检测。在第 14 天进行多模态影像学检查所需的镇静期间，同时拆除外眦切开术所用的 5-0 Prolene 缝线。其余缝线为可吸收的 7-0 Vicryl 缝线，无需拆除。 

15. 多模态成像的术后监测方法

  1. 对非人灵长类动物（NHP）进行过夜禁食。在成像前立即进行镇静处理（镇静所用药物及浓度参见步骤4.2）。若镇静效果不足以抑制眼球运动，可考虑使用全身麻醉。
  2. 成像前滴用1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素滴眼液，以实现瞳孔散大（参见步骤6.2）。
  3. 使用配备55°视场镜和30°视场镜的高分辨率OCT仪器，进行自发荧光（AF）、眼底荧光素血管造影（FFA）和光学相干断层扫描（OCT）。
    1. 为进行FFA，静脉注射10%荧光素钠（0.1 mL/kg体重）。为获取早期相图像，应在注射后30秒内拍摄图像；为获取晚期相图像，应在注射后5–10分钟拍摄图像。
  4. 在FFA的早期相与晚期相之间，使用眼底照相机进行眼底摄影。

16. 全视野视网膜电图（ERG）研究的术后监测方法

  1. 对非人灵长类动物（NHP）进行过夜禁食。在进行ERG检查前对NHP实施镇静（镇静药物及浓度参见步骤4.2）。在整个ERG记录过程中，根据需要适时追加镇静剂。
  2. 多模态成像与ERG记录之间应至少间隔2–3天。
  3. 动物镇静后，在ERG记录前确保其暗适应30分钟。
  4. 将不锈钢皮下针电极置于NHP左右外眦（参考电极）以及身体背部（接地电极）。使用Vidisic凝胶辅助将ERG接触镜电极放置于NHP角膜上，以确保良好接触和黏附。
  5. 所有ERG检测均依据国际临床视觉电生理学会（ISCEV）推荐的人类检测方案14进行。在暗视条件下开始ERG记录，并从较弱的闪光刺激开始。刺激间间隔应遵循ISCEV的推荐建议。
  6. 在进行明视检测前，确保NHP接受10分钟的光适应，背景光强度同样依据ISCEV的标准推荐值设定。

17. 非人灵长类动物的安乐死

  1. 为对非人灵长类动物实施安乐死后进行眼球摘除，应按照美国兽医协会安乐死专家组的建议，静脉注射戊巴比妥钠（75 mg/kg）。

结果

多模态成像技术（眼底照相、眼底自发荧光成像（FAF）、眼底荧光素血管造影（FFA）的早期和晚期相，以及光学相干断层扫描（OCT））展示了黄斑下视网膜色素上皮（RPE）移植术成功的特征（图1）。眼底照相显示RPE移植物准确位于中心凹处，且随时间推移未发生移位。FAF成像显示移植物区域的高自发荧光（表现为白色高信号区域）变化轻微。FFA的早期和晚期相均未见明显渗漏（即随时间扩大增强的白色高信号区域）围绕RPE移植物。术后第3天的初始图像显示因移植前去除原有RPE而形成的窗样缺损。黄斑区OCT图像显示，随着时间推移，RPE移植物上方的外层视网膜结构（尤其是光感受器层）得以保留。苏木精-伊红染色显示视网膜各层结构完整，无微小撕裂迹象。移植物周边区域上方外核层的保留提示RPE细胞正在发挥其维持光感受器健康的生理功能。

25/41 G双孔套管的眼内视图和外部视图展示了在视网膜下注射过程中控制眼内压（IOP）的机制（图2）。在进行视网膜下液体注射时，BSS通过中央较长的套管进入视网膜下腔。当眼内压显著升高时，玻璃体腔内的BSS会通过套管较大的金属孔道流出眼球。随后，BSS沿套管流动，最终从靠近套管枢纽的出口排出。为评估套管是否正常工作，请确认液体是否从靠近套管枢纽的出口流出。

miOCT 可在黄斑脱离术中实时显示裂孔的尺寸以及潜在的黄斑撕裂（图3）。图3A1-A3 展示了一例伴有黄斑撕裂的裂孔病例。图3A1 中，尽管在手术显微镜下可观察到下方的裂孔，但难以识别撕裂部位。图3A2 显示的是无任何撕裂的裂孔纵向切面。图3A3 显示的是在评估裂孔垂直切面时发现的黄斑撕裂。图3B1-B3 展示的是成功形成的、无任何撕裂的裂孔。

ERG波形未出现显著恶化，表明视网膜下RPE异种移植后，视杆细胞和视锥细胞的整体功能得以维持（图4）。ERG波形反映了视网膜的整体功能，尤其应关注A波，以判断光感受器功能是否受损。

视网膜成像研究：眼底照片、荧光血管造影、OCT结果（3个月内），组织学切片
图1术后 体内 多模态成像分析 (A) 在体 左眼黄斑下RPE移植片（眼底照相中呈黄色）在不同成像方式下的影像表现（从左至右各列：眼底照相、自发荧光、眼底荧光素血管造影早期相、眼底荧光素血管造影晚期相、光学相干断层扫描），观察时间点为术后3个月内（从上至下各行：术后第3天、第14天，术后第1个月、第3个月）。眼底照片中的星号表示视网膜切开部位；白色虚线箭头指示线扫描的方向。眼底自发荧光图像中绘制的黄色轮廓标示移植片的位置。OCT图像中的白色三角形指示移植片的相应侧缘（对应于彩色眼底图像上的线扫描位置）。B) 移植组织在萎缩性中央凹（由于术中撕裂）处的苏木精-伊红染色，各层结构已标注。比例尺 = 1 mm A （自发荧光和荧光素血管造影图像）， 200 µm 在 A （OCT图像），以及 100 µm 在 B缩写：FA = 眼底血管造影；OCT = 光学相干断层扫描；RGC = 视网膜神经节细胞层；INL = 内核层；ONL = 外核层；RPE = 视网膜色素上皮 请点击此处以查看此图的放大版本。

眼内和眼外视图、眼科手术操作、视网膜检查、医学影像。
图 2：25/41 G 双通道套管的眼内和外部视图。（A）在形成视网膜下隆起时，25/41 G 双通道套管的眼内视图。白色箭头指向用于视网膜下注射的较长中心套管。虚线箭头指向流出套管的开口，平衡盐溶液（BSS）由此流出眼球。（B）25/41 G 双通道套管的外部视图。星号标记了靠近套管 hub 的流出端口，眼内 BSS 由此排出。缩写：BSS = 平衡盐溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

显示视网膜横截面的光学相干断层扫描；眼部扫描，医学影像分析。
图3：伴有黄斑裂孔的视网膜下隆起的术中显微镜图像与miOCT图像。（A1）术中显微镜图像，显示在伴有黄斑裂孔的隆起区域中纵向（蓝色）和横向（红色）扫描的位置。（A2）纵向miOCT扫描，显示黄斑区的视网膜下隆起（黄色箭头）。（A3）横向miOCT扫描，捕捉到黄斑裂孔（白色箭头），同时可见视网膜切开术（星号）及视网膜下隆起（黄色箭头）。（B1）术中显微镜图像，显示成功形成的隆起区域中纵向（蓝色）和横向（红色）扫描的位置。（B2）纵向miOCT扫描，显示黄斑区的视网膜下隆起（黄色箭头）。（B3）横向miOCT扫描，显示成功创建的视网膜下隆起，上方黄斑结构完整（白色菱形）。缩写：miOCT = 显微镜集成光学相干断层扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

RPE异种移植反应图，振幅与时间关系，显示不同条件下视网膜活性。
图4：RPE异种移植眼的ERG结果。 为评估视网膜功能，对RPE异种移植眼在移植前基线期（上排）和移植后3个月（下排）进行了全视野ERG检测，结果显示无论在暗适应或明适应条件下，RPE异种移植对任何反应振幅、潜伏时间或波形均未产生显著影响。缩写：RPE = 视网膜色素上皮；ERG = 视网膜电图；DA = 暗适应；LA = 明适应。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前正在进行评估的两种主要脉络膜上视网膜色素上皮（RPE）移植方法是RPE细胞悬液注射和单层RPE移植物移植。本文不拟对这两种方法进行详细比较。然而，单层RPE移植物移植可能具有优势，因为RPE细胞在单层结构中的排列比在悬液中更为有序。移植物中的RPE细胞以融合的单层形式排列，类似于生理状态下RPE细胞层的结构，有助于移植后的RPE细胞执行其正常生理功能。与细胞悬液相比，这种方法可实现更精确的剂量控制参数，这对于监管申报和工业化放大生产具有重要意义。

将RPE细胞片移植到视网膜下间隙需要对黄斑区进行精细操作，并准确地将移植物植入视网膜下间隙。显微外科技术的进步，例如 intraoperative miOCT（术中显微镜集成光学相干断层扫描），以及对术中视网膜组织动态的深入理解，已显著缩短了该手术的学习曲线。本文将阐述以下方面的理论依据：i）术前注射纤溶酶原；ii）术中使用miOCT；iii）使用定制的41G双通道套管、低眼压设置以及全氟化碳液体（PFCL）以形成视网膜下隆起（subretinal bleb）；iv）移植前刮除原有的RPE细胞层；v）使用西罗莫司（sirolimus）、曲安奈德（triamcinolone）、多西环素（doxycycline）和米诺环素（minocycline）以降低移植物的免疫排斥反应。

术前注射纤溶酶原可解除黄斑旁视网膜粘连
在初期实验中，单次液体推注难以分离黄斑中心凹。通过miOCT评估发现，影像显示黄斑旁区外层视网膜与天然视网膜色素上皮（RPE）之间存在粘连，同时伴有视网膜内损伤的证据20。这些粘连可能导致液体隆起呈垂直扩展，而非在视网膜下沿轮廓扩散形成液体波，从而引起中心凹损伤。纤溶酶原是纤溶酶的非活性前体，而纤溶酶是一种可靶向纤维连接蛋白和层粘连蛋白的蛋白酶。Ocriplasmin 是人源纤溶酶的一种生物工程改造变体，已获美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准，用于治疗有或无伴随黄斑裂孔的症状性玻璃体黄斑牵拉。然而，Ocriplasmin 注射后的上市后报告提示该酶对视网膜可能存在更广泛的作用，例如可导致囊样黄斑水肿的发生23。

尽管确切的机制尚未明确，但有研究提示，纤溶酶可能通过降解负责感光细胞与视网膜色素上皮（RPE）黏附的感光细胞间基质成分，从而削弱视网膜黏附性24。在本实验方案中，非人灵长类动物（NHP）眼球在手术前1周接受玻璃体内注射纤溶酶原，以解除旁中心凹区外层视网膜的黏附。基于感光细胞与RPE之间的黏附力被削弱的假设，分离神经感觉视网膜（包括通常对视网膜下液波具有抵抗作用的远端旁中心凹环）所需的力更小20。因此，在视网膜隆起分离过程中施加的力将导致隆起沿视网膜轮廓扩展，而非对视网膜产生切向拉伸，从而降低中心凹撕裂的风险。然而需要注意的是，本方案未研究纤溶酶原对移植物长期存活的影响。未来的研究应尝试明确这一效应。

miOCT 提供解剖学反馈，以指导视网膜下液泡的形成、移植物植入以及视网膜下液体的引流
术中对黄斑区进行无创性操作是获得良好移植效果的关键。然而，与操作相关的黄斑微结构变化在手术显微镜下并不总是清晰可见。在此类手术中，miOCT 是一种重要工具，可提供黄斑结构的实时三维术中反馈。miOCT 在黄斑中心凹脱离、移植物植入以及通过液-气交换引流视网膜下液体等步骤中尤为有用。在中心凹脱离过程中，miOCT 可确定液泡的垂直和水平范围。手术显微镜下可能难以清晰观察到的黄斑微裂孔，可通过 miOCT 得以确认（图3）。在移植物植入过程中，miOCT 图像可通过显示移植物在透明度较低的脱离视网膜下的位置或与中心凹的接近程度，提供引导作用。miOCT 还可在复杂移植过程中突出显示可能存在的视网膜粘连区域25。最后，在视网膜下液体引流过程中，miOCT 可可靠地引导液体排出，直至实现视网膜与视网膜色素上皮层（RPE）移植物之间的完全贴合。

双孔套管、低眼内压设置与全氟化碳液体（PFCL）玻璃体填充的联合应用在视网膜下水泡形成过程中协同减少黄斑区创伤
在进行黄斑中心凹脱离的视网膜下平衡盐溶液（BSS）注射时，可能发生切向视网膜牵拉和液体湍流，从而导致意外的中心凹撕裂。为对抗这些现象，已有研究表明，注射起始位置相对于中心凹中心的距离与方位、注射体积与速度、玻璃体填充物、视网膜下操作器械的选择以及眼内压（IOP）等因素均具有重要影响20,26,27。为实现中心凹脱离而形成的视网膜下水泡应位于距离中心凹足够远的位置，因为水泡起始点处的视网膜牵拉程度可能最大27。在整个视网膜下水泡形成过程中，眼内压也应保持在较低水平。当眼内压较高时，水泡更倾向于垂直方向增大，而非沿视网膜轮廓扩展；而在较低压力下，水泡则较浅平20。此外，尽管在人类眼中，50 µL的玻璃体腔注射即可使眼内压有效加倍28，但由于非人灵长类动物（NHPs）的眼轴较短，其在视网膜下注射期间眼内压的升高可能比人类更为显著且迅速。虽然大多数玻璃体切除设备具备调节眼内压波动的功能，但该调节并非实时同步，而是在视网膜下注射过程中逐步响应的反馈机制。因此，眼内压越高，视网膜过度牵拉及由此引发的中心凹损伤风险也越高。因此，在视网膜下注射期间维持稳定且较低的眼内压至关重要。

建议使用商用20/41 G（DORC）或定制的25/41 G双通道视网膜下注射套管进行视网膜下注射。该套管可使液体从玻璃体腔流出，同时将平衡盐溶液（BSS）注入视网膜下间隙，从而在视网膜下注射过程中实现眼内压（IOP）的“同步”调节。双通道套管的示意图见图2。最后，使用重水（PFCL）可降低黄斑裂孔的风险20,26,27。由于PFCL（如八氟丙烷）具有较高的比重，在黄斑脱离过程中会对视网膜产生向下的作用力29，从而进一步稳定黄斑脱离隆起的形成过程，并促进隆起沿视网膜轮廓扩展。该技术已成功应用于因新生血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）导致的大面积视网膜下出血患者中注射重组组织型纤溶酶原激活剂（rtPA）30。

移植前清除内源性视网膜色素上皮可实现视网膜色素上皮的重建-光感受器复合物
在移植移植物之前应去除宿主RPE，因为需要重建RPE-光感受器复合体，以使RPE移植物能够发挥其支持光感受器的生理功能。21宿主RPE若不被清除，可能构成机械屏障，阻碍该复合结构的重建。RPE可通过施用对RPE具有毒性的化学物质或采用物理方法予以清除。化学清除方法包括全身性或视网膜下注射碘酸钠31,32由于碘酸钠在给药后会导致光感受器、视网膜色素上皮细胞和脉络膜毛细血管广泛变性，其视网膜毒性和全身毒性限制了其在人体试验中的应用32,33因此，更倾向于采用物理术中技术。目前已提出多种物理方法。使用物理方法时，关键是要确保布鲁赫膜保持完好无损。许多 体外 研究表明，视网膜色素上皮（RPE）移植物的存活依赖于完整的布鲁赫膜34,35,36.

既往尝试的液压清创术与Bruch膜破裂、视网膜前膜发生率升高以及增殖性玻璃体视网膜病变相关，最终导致牵拉性视网膜脱离37。一种用于视网膜色素上皮（RPE）清创的钻石涂层刮匙也被发现会引起Bruch膜破裂，导致脉络膜细胞增殖并侵入视网膜下间隙38。有趣的是，一种定制的可伸缩环形器械可在兔和猪的眼中去除表层RPE的同时保留Bruch膜的完整性11,39。去除下方RPE对于建立类似于年龄相关性黄斑变性（AMD）晚期萎缩型的RPE及外层视网膜萎缩动物模型也具有重要意义。当从黄斑区局部去除RPE后，RPE创面通过残留RPE细胞的肥大而闭合。然而，这种伤口愈合反应伴随着外核层的萎缩40。尽管建立动物模型不在本论文的讨论范围之内，但类似的操作可用于构建晚期萎缩型AMD表型的动物模型，以用于RPE来源细胞治疗药物的测试。

使用西罗莫司、曲安奈德、多西环素和米诺环素降低免疫原性移植物排斥反应
人们认为视网膜下腔是一个免疫豁免部位，其免疫豁免状态由完整的血-视网膜屏障及其他因素维持41。在许多涉及将干细胞衍生物移植至视网膜下腔且血-视网膜屏障完整的研究中，免疫抑制药物对移植物存活的作用微乎其微42。外层血-视网膜屏障被认为由天然的视网膜色素上皮（RPE）层以及RPE细胞之间的紧密连接构成。虽然去除天然RPE有助于移植的RPE与宿主光感受器更好地整合，但该过程会破坏血-视网膜屏障，从而增加发生免疫排斥的风险。传统上，T细胞在其他器官（如肾脏和肝脏）移植排斥反应中起核心作用43。因此，针对视网膜组织移植的初始免疫抑制方案主要着眼于抑制此类适应性免疫反应。

雷帕霉素（sirolimus）是一种雷帕霉素靶蛋白抑制剂，他克莫司（tacrolimus）是一种钙调磷酸酶抑制剂，二者均为靶向适应性免疫应答的免疫抑制药物。然而，尽管对T细胞的抑制已达到足够水平，移植物的存活率仍然较低。此外，已知视网膜色素上皮（RPE）细胞可通过释放抑制性因子来抑制T细胞活化，并促进调节性T细胞的生成44。因此，适应性免疫可能并非导致移植物排斥的唯一因素，这一观点日益明确42。细胞产品的视网膜下移植可导致小胶质细胞的聚集和活化45。

小胶质细胞是视网膜中的巨噬细胞，主要包括两个主要群体：1）位于视网膜内层血管系统的血管周小胶质细胞；2）存在于视网膜实质组织中的小胶质细胞。由于小胶质细胞参与固有免疫反应，玻璃体内注射糖皮质激素（如曲安奈德）可抑制细胞因子介导的增殖46多西环素和米诺环素也可抑制小胶质细胞活化，应予以考虑47,48最后，同种异体与异种视网膜色素上皮移植在免疫排斥反应方面的差异尚未完全明确49例如，已有报道称在血清中发现了针对诱导性多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的同种异体抗体 体内 免疫排斥模型。然而，这些抗体的作用以及抗体介导的排斥反应在移植物存活中的重要性仍不明确50因此，建议采用一种多药联合方案，利用西罗莫司抑制适应性免疫，联合曲安奈德、多西环素和米诺环素以抑制固有免疫。该方案已在兔模型中成功应用，表现出良好的移植物存活率及较小的全身性不良反应。11.

该手术技术的局限性
本文描述了一种将视网膜色素上皮（RPE）移植物片递送至非人灵长类动物（NHP）视网膜下腔的可行手术方法；然而，这并不意味着这是唯一经过优化的方法。不同的玻璃体视网膜外科医生可能对器械和手术技术有各自的偏好。例如，本植入装置的设计仅适用于由较硬的细胞载体支撑的平面移植物，因此可能不适用于相对柔软（或卷曲）的移植物。RPE细胞悬液移植则可省去本技术中的大部分步骤。因此，具体的手术细节需根据不同的递送策略进行相应调整。

随着人们对利用细胞治疗手段治疗退行性视网膜疾病兴趣的不断增长，非人灵长类（NHP）动物模型将在临床前研究中发挥关键作用，用于研究影响视网膜色素上皮（RPE）移植物存活的各种因素。本文提出了若干策略，以实现将单层RPE移植物更顺利地递送至NHP眼底黄斑下区域。同时，还推荐了有助于更好地术中观察并发症的方法。预计随着细胞治疗应用的不断拓展，这些方法将持续得到改进。未来的方法学论文还应考虑提出一套全面的检测指标，以评估移植物在结构和功能等多个方面的表现。

披露

Boris Stanzel 持有美国专利 9980851，该专利于本研究中所使用的一种仪器（RPE 刮匙）相关。Boris Stanzel 收到来自 C. Zeiss Meditec 和 Geuder 的演讲酬金。其他作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由新加坡A*STAR的IAF-PP（HMBS领域）（OrBID）：眼科生物材料与设备项目（H17/01/a0/013）、新加坡国立大学启动基金（NUHSRO/2016/100/SU/01）、新加坡国立大学健康系统临床科学家计划（NCSP）基金以及新加坡国家研究基金会竞争性研究计划（NRF-CRP21-2018-0008）资助，资助对象为X.S.；同时感谢Hong Leong捐赠教授席基金对G.E.H.和B.V.S.的支持。我们谨向新加坡眼科研究所转化前临床模型平台的兽医团队致以谢意，感谢他们在非人灵长类动物手术准备及术后随访中提供的支持。我们还衷心感谢蔡司医疗技术新加坡公司（C. Zeiss Meditec Singapore）的Jill Teo及其同事，为配备集成术中OCT装置的OPMI-Lumera 700显微镜提供了技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 美多里西尔（托吡卡胺 1.0%）无菌眼用制剂AlconSIN 4715P手术操作
10% 中性缓冲福尔马林Leica3800598组织学操作
2.5% 美得福林（盐酸去氧肾上腺素）眼用溶液AlconNo. 01785手术操作
25 G AWH Vivid ChandelierSynergetics56.54.25P手术操作
25 Ga 双刃玻璃体切割器联合广角 Stellaris Elite 套件Bausch & LombSE5525WVB手术操作
AMO ENDOSOL 眼科灌注用平衡盐溶液Abbott Medical Optics15020手术操作
盐酸米诺环素Apotex Inc2084104免疫抑制
AUROVISC - 羟丙甲纤维素眼用溶液 USP 2% w/vAurolabTN 00002387手术操作
Autoclave MELAG, VacuklavMELAG1131-B2300手术操作
Autostainer XL (ST5010)Leica2433组织学操作
平衡盐溶液Beaver Visitec581732手术操作
棉签WINNER MEDICAL1NA6-100手术操作
Diagnosys Espion E3 控制台Diagnosys272眼科成像
多西环素Yung ShinMAL 19950403AEZ免疫抑制
伊红 YMerck Millipore1.15935.0100组织学操作
ERG-Jet 接触镜电极FabrinalF-06眼科成像
可伸缩 PolyTip 套管针 25 G/38 GMedOne3247手术操作
FlexTip 刷头（25 g）1.5 mmMedOne3222手术操作
10% 荧光素钠 FaureCuratis AG5030376眼科成像
纱布拭子WINNER MEDICAL1NP3275手术操作
Hamilton 气密注射器 250 µLHamilton81101手术操作
Heidelberg Spectralis HRA + OCT 计算机系统Heidelberg EngineeringN.A.眼科成像
苏木精 Gill IIMerck Millipore3801520组织学操作
倒置显微镜 Eclipse Ti-E 主机（100-240V）Nikon33131组织学操作
氯胺酮注射液Ceva37711/58317手术操作
碳酸锂Merck Millipore1.05680.0250组织学操作
猴血浆素原Molecular InnovationsSKU-CYPLG手术操作
非接触式广角 128 度眼底镜C. Zeiss MedtechResight 700手术操作
无纺布眼科手术巾Alcon8065103120手术操作
眼科角膜/巩膜 V-Lance 刀 20 GAlcon8065912001手术操作
石蜡包埋工作站LeicaEG1150 H组织学操作
高熔点石蜡 ParaplastLeica39601095组织学操作
品红 BMerck Millipore1.15935.0025组织学操作
预粉外科手套MAXITEX85-173-2/85-173-3/85-173-4手术操作
PRODINE 聚维酮碘溶液 BPICM PHARMAPMLBLP20-01手术操作
Righton 裂隙灯 MW50D 型号（RAA133CB）Righton-Oph5200162眼科成像
旋转式切片机LeicaRM2255组织学操作
Safil 聚乙醇酸编织涂层可吸收外科缝线 7/0B.BraunG1048711手术操作
SHINCORT I.M. INJ. 曲安奈德 40 mg/mLYung ShinSHI40 SGP-2610015-001手术操作
一次性皮下注射针头 21 GB.Braun4657527手术操作
一次性皮下注射针头 23 GB.Braun4657667手术操作
西罗莫司PfizerSIN12034P免疫抑制
不锈钢皮下针电极OcuScienceF-E2眼科成像
Stellaris Elite 视觉增强系统Bausch & LombBL15455手术操作
Sterican 一次性胰岛素注射针头 长斜面 27 G 12 mmB.Braun4665406手术操作
Sterican 一次性胰岛素注射针头 长斜面 30 G 12 mmB.Braun4656300手术操作
手术衣 + 2 条手巾STERILAPP10 00 01手术操作
Tegaderm 敷料膜3M1626W手术操作
TERUMO 注射器 1 cc/mL 鲁尔滑动接头配 26 G 针头TerumaSS-01S手术操作
TERUMO 注射器 3 cc/mL 鲁尔锁扣接头TerumaSS-03L手术操作
TERUMO 注射器 5 cc/mL 鲁尔锁扣接头TerumaSS-05L手术操作
TobraDex（妥布霉素、地塞米松）无菌眼用软膏AlconNo. 01577手术操作
Topcon 视网膜相机 TRC-50DXTopcon948605眼科成像
Vidisic 凝胶Bausch & LombGB41789155517手术操作
Xylazil-20Ilium38653/50276手术操作
Zeiss Opmi Rescan 700Carl Zeiss Meditec AG7210手术操作

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

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