通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

摘要

这一简化的实验方案详细描述了从组织固定到利用荧光标记微生物，以检测和成像复杂组织样本中细菌的工作流程 原位 杂交

摘要

测量微生物在其内部的定位 体内 肠道微生物群与脊椎动物肠道之间的功能关系研究中，理解其空间背景至关重要。肠道微生物群的空间分布受到肠道黏液、隐窝和皱襞等物理结构的严格调控，同时也受宿主控制的pH值、氧气供应和免疫因子等特性的影响。这些因素共同限制了共生微生物和病原体在肠道内稳定定植的能力。在微米尺度上，微生物的组织方式决定了不同微生物之间以及微生物与宿主之间的近距离相互作用，而这些相互作用进一步影响器官的整体功能和宿主健康。

该方案能够实现从细胞间距离到整个器官尺度的肠道微生物群空间结构的可视化。该方法基于在保持肠道结构和黏液特性的前提下对肠道组织进行固定。固定后的样品经包埋、切片和染色处理，通过荧光标记特异性地显示特定细菌种类。 原位 杂交（FISH）。宿主特征，如黏液和宿主细胞组分，使用荧光标记的凝集素进行标记。最后，利用共聚焦显微镜对染色切片进行成像，采用高倍率拼图扫描成像技术，以跨越微米至厘米尺度的长度范围。此类成像技术可应用于动物模型的肠道切片以及人体组织活检样本，以确定健康与疾病状态下肠道微生物群的生物地理分布。

引言

微生物可视化技术的起源与微生物学本身一样古老，当时安东尼·范·列文虎克使用他的显微镜观察细菌（他称之为“animalcules”） "微生物") 来自17名受试者牙菌斑和粪便样本中的微生物^th 世纪以来，人们已开发出多种技术，用于可视化与宿主相关的细菌、真菌和病毒群落——即微生物群——在空间上的组织结构。¹阐明这些微生物的定位对于确定其在动物宿主内的功能至关重要。细菌的生物地理分布对共生菌和致病菌均具有重要意义，因为其与特定位置（如上皮层）、营养底物以及其他特定微生物的接近程度，可能决定细菌产生介导种间及跨界相互作用的代谢产物。

在口腔、肠道或肺部等多个不同部位，分隔细菌与宿主组织的关键结构是黏液层——一种由宿主产生的结构，既可防止微生物易位至宿主上皮细胞，又可作为微生物群的营养来源^2,3,4。表征该屏障的破损与变化具有重要意义，有助于深入理解宿主与微生物群之间的相互作用机制，而这些机制仅通过测序手段无法获得^5,6,7。例如，成像技术揭示了抗生素暴露可破坏黏液层及微生物群的组织结构^7,8，而泻药可能导致黏液层耗竭，并与免疫参数的显著变化相关⁵。

本方案概述了微生物群和宿主组织的固定、染色与成像通用流程（图1），基于Johansson和Hansson⁹的研究建立。尽管本方案以肠道组织切片为模型，但可轻松适用于其他类型的组织。该方案可用于处理实验动物或人类临床样本；文中已包含处理这两类样本的注意事项。在本示例中，宿主上皮和管腔细菌通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色同时标记，黏液使用荧光素（FITC）标记的凝集素Ulex europaeus凝集素I（UEA-1）标记，特定细菌分类群则通过荧光原位杂交（FISH）进行标记。FISH探针通常靶向分类群的16S rRNA基因设计，以确保因结合高拷贝转录本而产生强信号。

在此示例中，探针靶向细菌家族 Muribaculaceae 的 16S rRNA（图2）。然而，可根据具体的生物学问题，轻松替换为其他不同的FISH探针和/或凝集素染料。先前已验证的FISH探针可在ProbeBase¹⁰（一个针对rRNA的寡核苷酸探针在线资源）或SILVA¹¹（一个核糖体RNA数据库）上查找。对于新探针的设计，读者可参考如HiPR-FISH⁸或Oligominer¹²等新开发的分析流程。利用本方案，可观察到肠道腔内细菌的紧密排列结构，以及消化道不同区域肠黏液的多种特征。本文所述的工作流程可实现对微生物群在其宿主环境空间背景下的定量分析。

方案

本方案中所述的所有动物实验和组织采集均遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）的指南，并已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准。实验使用无菌Swiss Webster小鼠，所有动物年龄为8至10周，雌雄均有，每笼至少两只小鼠共同饲养。动物安乐死采用二氧化碳窒息法，随后进行二次颈椎脱位或心脏穿刺。

1. 设计成像实验：注意事项与样品采集

1. FISH探针设计
   1. 如果存在合适的FISH探针，应选择一种已有发表文献报道的探针，其在标记细胞中的信号强度应明显高于背景。
   2. 验证新探针 体外 以确定它们与目标细菌固定样本的结合效率，以及对其他非靶标细菌的非特异性结合。
   3. 检查所有拟使用的16S FISH探针，确保其与目标生物的16S序列或待分析样品的16S rRNA测序结果匹配，以确认预期比例的阳性匹配存在，并确保探针不会非特异性地结合其他微生物群成员。
      1. 使用工具（如 Clustal Omega）将 FISH 探针与全长序列或扩增子序列变体进行比对¹³，以评估探针与其靶标之间潜在的结合能力。
      2. 此外 计算机模拟 检测、测试未经验证探针在纯培养物上的FISH染色准确性和水平^8,14.

注意：在对多个群落成员进行染色时，如果所用荧光染料的激发和发射光谱不重叠（除非使用具备线性解混能力的成像系统），探针可组合使用（例如，科特异性探针与属特异性探针联用）。此外，可通过设置特异性对照/随机序列探针，或使用非荧光标记探针进行竞争实验，以验证杂交的特异性。

1. 样本类型与组织采集
   1. 使用锋利且洁净的工具，从无菌动物体内切取肠段 用于成像的Swiss Webster小鼠。尽量减少对样本的扰动，操作切片时应仅触碰边缘，以避免影响成像区域。解剖后应尽快固定样本，防止降解。
      ​注意：对于动物实验，优先选用未冲洗的完整肠段；肠膜有助于保持肠腔和黏膜结构的完整性。
   2. 使用70%乙醇在不同样本和取样位点之间擦拭工具以清洁。每个肠段或活检位置至少获取三个生物学重复，注意取样位置的一致性，因为黏液、肠组织结构以及微生物群在不同位置存在显著差异。

2. 组织样本固定与浸润

1. 固定
   1. 在合适的容器中配制新鲜的甲醇-氯仿-乙酸（methacarn）固定液，配比为：60% 无水甲醇、30% 氯仿和 10% 冰醋酸。在通风橱中分装各试剂。选择可通过略微打开盖子进行排气的容器。由于甲醇-氯仿-乙酸不兼容聚苯乙烯材料，应使用聚乙烯容器配制，并用玻璃量筒或血清移液管量取氯仿和冰醋酸。
      注意：混合过程中会产生气体，可能导致容器内压力升高。从通风橱取出后，若不立即添加样本，建议将容器相对密封。氯仿具有毒性，避免吸入、吞食或经皮肤吸收。甲醇有毒且高度易燃，避免吸入、吞食或经皮肤吸收。冰醋酸易燃，对皮肤和眼睛具有强腐蚀性。
   2. 分装后，关闭容器，轻轻摇晃混合，然后排气；重复此操作直至不再明显产生气体（盖下压力不再显著升高）。
      注意：不得将甲醇-氯仿-乙酸排入下水道；应收集并按照机构指南作为危险化学废物处理。使用铅笔标记组织学包埋盒，因为许多记号笔的墨水会在甲醇-氯仿-乙酸溶液中脱落。
   3. 用镊子轻轻夹住组织边缘，将肠段放入组织学包埋盒中。关闭包埋盒，并将其完全浸入新鲜的甲醇-氯仿-乙酸溶液中。确保在包埋盒浸入时，固定液使用时间不超过数小时。
   4. 对于在无通风橱的临床环境中采集的临床样本，使用带切口盖子的聚乙烯储存容器，切口允许组织学包埋盒通过。在不传递样本时，用胶带将切口封住，以防止有毒气体逸出。
      注意：建议使用美纹纸胶带，以避免胶水被溶解——某些类型的胶带（如塑料封箱胶带）可能无法耐受甲醇-氯仿-乙酸的气体。
   5. 固定时间至少为 3 小时，最长不超过两周。
      注意：较厚的样本可能需要超过 3 小时的固定时间。 可根据需要选择固定时间，以便对在不同甲醇-氯仿-乙酸溶液中固定的包埋盒进行同步石蜡浸润处理（例如，对在两周内采集并固定的样本组同时进行石蜡浸润）。
2. 石蜡浸润与包埋
   1. 将石蜡放入耐热容器中，在 60 °C 的烘箱中过夜熔化。由于石蜡颗粒在熔化前占据更多空间，确保熔化的石蜡量足以覆盖所有包埋盒。
      注意：温度不应超过 60 °C，否则可能产生人为假象。
   2. 通过将液体倒入适当的废液容器并立即替换为以下试剂来清洗组织。
      1. 在无水甲醇中孵育 30 分钟，重复一次。
      2. 在无水乙醇中孵育 20 分钟，重复一次。
      3. 在二甲苯 中孵育 15 分钟，重复一次。
      4. 快速更换洗涤液，注意避免包埋盒干燥。确保烧杯或容器中的洗涤液完全覆盖包埋盒。
         注意：二甲苯易燃，吸入其蒸气可能抑制中枢神经系统，在高浓度暴露（>200 ppm）下可能产生潜在的长期神经毒性后果。仅在通风橱中操作二甲苯。由于二甲苯具有危害性，应尽量使用覆盖组织学包埋盒所需的最小用量。
   3. 包埋过程中，使用镊子将肠段沿包埋盒长度方向平行放置（而非直立），以获得纵向和横向切面，而非横截面的“圆环”状切片，从而为定量成像提供更多可分析的样本区域（图 1B）。
   4. 将包埋盒略微打开（约 1–2 cm 或 0.5 英寸），使石蜡能够进入但不丢失组织片段。此步骤建议佩戴双层手套或使用镊子，以防手指过热或轻微烫伤。将包埋盒浸入熔化石蜡中并关闭，然后将容器放回 60 °C 烘箱。确保包埋盒内部充满石蜡，无大气泡残留。
   5. 在 60 °C 孵育 2 小时后，将容器从烘箱中取出。用镊子小心取出包埋盒，逐一放置在铝箔上冷却。在室温下保存，直至准备进行包埋和切片。
   6. 使用切片机对石蜡块进行切片，切至足够深度以暴露管腔内容物，从而获得绒毛和/或隐窝以及管腔内容物和黏液的纵向切面。注意及时更换刀片，因为粪便材料比组织更快使刀片变钝。切片厚度设为 4 µm，以获得最佳图像清晰度。将切片转移至普通未涂层载玻片上。
   7. 对于 FISH 染色，应尽快对肠段切片进行染色（即切片后数周内），以获得较强的 FISH 信号。若不进行 FISH 染色，凝集素 + DAPI 染色可在较久远的样本（即数月前的样本）上进行，且信号无明显损失。

3. 染色细菌与宿主特征

1. 准备
   1. 将烤箱加热至 60 °C。预热一个空的考普林瓶（Coplin jar），并在玻璃瓶中准备足量的二甲苯，以确保能将考普林瓶中的玻片覆盖两次。瓶盖周围需用封口膜（parafilm）密封，防止二甲苯挥发。使二甲苯温度升至 60 °C。
      注意：标准考普林瓶可容纳 8 张玻片，玻片可用约 50 mL 液体覆盖（根据品牌不同，用量可能在 40 至 60 mL 之间）。其他研究团队已成功使用毒性较低的二甲苯替代品完成脱蜡步骤（步骤 3.2）^8,9。
   2. 若另有可用的烤箱，将杂交炉预热至 50 °C。否则，可在步骤 3.2.3 完成后使用同一烤箱进行此步骤。
   3. 配制 FISH 杂交液：20 mM Tris-HCl，pH 7.4；0.9 M NaCl；0.01%²⁶ - 0.1%⁹ (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）溶于无核酸酶水中。如需要，加入 5–50% (v/v) 甲酰胺。 在脱蜡过程中将该杂交液于 50 °C 预热。
      注意：甲酰胺是一种具有致畸作用的酰胺类物质；操作时应佩戴手套和护目镜。即使小剂量接触眼睛、皮肤或黏膜也会引起刺激。大量吸入甲酰胺蒸气可能需要医疗干预。甲酰胺可于 -20 °C 冰箱中以 100% 浓度储存。
2. 染色前玻片准备：脱蜡
   1. 将玻片放入考普林瓶中，确保组织切片不与其他玻片或瓶壁接触，于 60 °C 烤箱中烘烤 10 分钟。
   2. 在通风橱中，将从烤箱预热的二甲苯倒入考普林瓶，注意避免直接倾倒于样本上方，以防组织脱落。将考普林瓶放回 60 °C 烤箱。剩余二甲苯的玻璃瓶保留在通风橱中。
   3. 将使用过的二甲苯倒入适当的废液容器中处理，注意不要扰动玻片上的组织切片，并使用镊子固定玻片以防其从考普林瓶中滑落。补充剩余的二甲苯至考普林瓶中，在通风橱内室温孵育 10 分钟。
   4. 将切片在 99.5% 乙醇中室温孵育 5 分钟。孵育后，从考普林瓶中取出玻片，用实验室擦拭纸或纸巾擦干玻片背面，并短暂风干至乙醇液滴完全消失。
      注意：擦拭玻片背面有助于更清晰地观察干燥进程。
3. 使用 FISH 进行细菌染色
   1. 使用液体阻断剂或 PAP 笔围绕每个组织切片区域画圈，以限制液体扩散范围。确保墨水不接触切片本身。尽可能紧贴每个组织切片画圈，但不接触组织，以最小化杂交液需覆盖的表面积。
   2. 配制杂交液：每 50 µL 预热的杂交液中加入 0.5 µg 探针（例如，0.5 µL 的 1 µg/µL 探针）。用移液器将杂交液滴加至玻片上的切片区域（约每张切片 20 µL，具体取决于切片/圆圈大小）。自此步骤起，在孵育和储存过程中需避免杂交液和玻片暴露于光线下。
   3. 确保所用液体体积在覆盖柔性塑料盖玻片后能完全覆盖整个切片。将玻片置于湿盒中孵育以减少蒸发。可用移液枪吸头盒作为湿盒，在底部放置浸透杂交液或磷酸盐缓冲液（PBS）的擦拭纸或纸巾以提供湿度。根据探针组合的不同，在 45–50 °C 下孵育 >3 小时。
   4. 在孵育期间，将 FISH 洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；0.9 M NaCl）预热至 50 °C。准备足量洗涤缓冲液以覆盖考普林瓶中的玻片。
   5. 移除塑料盖玻片；将玻片放入已预热至 50 °C 的 FISH 洗涤缓冲液的 考普林瓶中 。将考普林瓶放回 50 °C 烤箱中孵育 10–20 分钟。对于较厚的样本，可在考普林瓶中加入缓冲液后轻轻移除盖玻片，以避免切片被拖拽或涂抹。
4. 染色黏液及宿主特征
   1. 在 PBS 中配制通用 DNA/黏液复染液：终浓度为 10 µg/mL DAPI + 40 µg/mL 黏液染料 UEA-1。准备足量复染液，以在无盖玻片的情况下覆盖所有样本点，避免因额外使用盖玻片而损伤组织。
      注意：在无盖玻片条件下覆盖样本点所需的液体体积大于步骤 3.3.2 中使用的 20 µL。对于中等大小的切片（约 10 mm 直径），每点 200 µL 即可充分覆盖；建议先在空白玻片上测试该体积。
   2. 移除 FISH 洗涤缓冲液，并用 PBS 替换考普林瓶中的液体。在考普林瓶重新加满 PBS 后立即倾倒 PBS。
   3. 从瓶中取出玻片，用移液器将复染液滴加至切片上，注意避免移液枪头接触组织。用液体完全覆盖整个切片，并在 4 °C 避光条件下孵育 45 分钟。
   4. 用新鲜 PBS 快速洗涤 3 次：用镊子固定玻片，将 PBS 倒入水槽后立即补充新鲜 PBS。
   5. 用擦拭纸或纸巾擦干玻片背面，借助连接移液枪头的真空管线辅助，使大部分 PBS 从切片表面蒸发。再次注意避免移液枪头接触切片。
   6. 使用封片剂（不含 DAPI）封片，并在室温下加盖玻璃盖玻片使其固化，确保盖玻片平整且封片剂中无气泡。
   7. 用透明指甲油沿盖玻片边缘涂抹以固定盖玻片，注意远离玻片边缘，以确保在成像时玻片能在显微镜载片架中平稳放置。
   8. 将玻片置于 4 °C 避光环境中保存数周，以防止荧光信号衰减。

4. 成像与图像分析

1. 可视化染色结果
   1. 选择同时包含组织和管腔的区域，以成像微生物群-宿主界面。为了对黏液层厚度和管腔内微生物空间分布进行定量成像，应选择上皮绒毛和/或隐窝切面呈纵向而非横断面的视野。避免选择黏液层与上皮之间存在较大间隙的区域，以防止切片假象。
   2. 利用DAPI信号定位和聚焦，以确定组织位置并校正焦平面，避免FISH荧光信号发生光漂白。
   3. 调整成像设置。为观察细菌的 DAPI 染色，需提高激光功率和增益，直至上皮细胞的 DAPI 信号达到过饱和状态 "吹出。"
      注意：切勿过度染色，否则会导致细胞核发生光漂白和视觉伪影，且无法恢复。
   4. 对于所有其他通道，使用能够使信号明显高于背景的最低激光功率，并注意避免信号过饱和。
      注意：在进行拼接扫描时，这一点尤为重要，因为当相邻图像区域存在重叠时，光漂白问题会更加显著。
   5. 使用40倍或更高倍数的放大倍率对单个细菌进行成像。
   6. 获取图像。
      1. 获取平铺扫描图像，以获得管腔内黏液层厚度及微生物空间分布的定量数据。确保各图像区域之间有15%的重叠，并检查是否存在渐晕或照明不均现象，这些现象可能因 <1倍放大。设置拼接扫描时，需仔细检查所有图像拼接区域中的组织是否均处于焦点范围内，因为模糊或失焦的图像无法进行分析（图3B).
      2. 如果可能，通过旋转扫描区域，使上皮组织和黏液层与成像 Tile 区域平行而非呈一定角度，以尽量减少成像特定长度上皮组织所需的 Tile 数量。否则，应寻找一段与成像区域平行或垂直的上皮组织，以达到类似效果。

结果

为研究特定肠道共生菌在小鼠肠道内的定植位置，本研究采用已定植单一细菌分离株的无菌 Swiss Webster 小鼠。在本实验中，标记的细菌物种包括：i) 一株来自 Muribaculaceae 科的人源分离株⁵, Muribaculum intestinale小鼠微生物群中丰富且普遍存在的细菌类群¹⁵，以及 ii) Bacteroides thetaiotaomicron，一种遗传上易于操作的常见肠道细菌。经过两周的适应期后，小鼠被实施安乐死，取含有粪便颗粒的一段结肠组织，切片并用新鲜配制的甲醇-冰醋酸-氯仿固定液（methacarn）固定。固定两天后，组织经甲醇、乙醇和二甲苯逐级脱水，浸蜡包埋，随后切取面向肠腔的4 µm厚切片。这些样本随后用一种特异性的FISH探针（3'端Cy3标记）进行染色 Muribaculum 使用 Oligominer 软件设计的引物¹²，并使用 NuPACK 和 mathFISH 检查二级和三级结构以及最小非特异性结合^16,17样品还使用与罗丹明结合的凝集素UEA-1（可染色黏液中的岩藻糖基化聚糖）和DAPI进行复染。染色切片采用40倍油镜配合超分辨率成像模块进行观察。

图1：肠道微生物群-宿主界面可视化工作流程。（A）流程示意图。（B）两种切片方向将产生横切面（本流程推荐）或横截面“环状”切片。（C）厚度差异较大的组织在包埋后可能导致切片仅对其中一种组织最理想。缩写：FISH = fluorescence in situ hybridization；DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：成像结肠可显示定位情况 Muribaculum intestinale 相对于无菌小鼠模型中的黏液。 切片用 DAPI（蓝色）染色， Muribaculaceae FISH 探针（红色）和 UEA-1（绿色）。（A无菌小鼠单菌定植的远端结肠 Muribaculum intestinale 和 (B小鼠双定植远端结肠 Muribaculum intestinale 和 Bacteroides thetaiotaomicron. 比例尺 = 20 µm。 (C 和 DCy3-FISH（左）、DAPI（中）以及管腔插图部分的Cy3-FISH与DAPI合并通道图像A）和（B），比例尺 = 5 µm。在（A）和（C），所有呈细菌形态且大小与细菌相当的DAPI信号均用Cy3标记（单箭头），而在（B）和（D），除了这些Cy3和DAPI双阳性细胞（单箭头）外，还可观察到DAPI染色但Cy3阴性的细菌细胞（双箭头），这与单定植和双定植状态的预期结果一致。除较长的丝状细菌外，较大的（>4 µm 长度）的DAPI阳性结构（钝头箭头所示）为植物材料或宿主细胞的细胞核。缩写：FISH = 荧光原位杂交 原位 杂交；DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：常见问题。（A）切片过浅将无法获得肠腔的横截面。（左）一段肠道组织被切至适当深度，可同时观察到肠腔以及上皮的纵切面；（右）一段肠道组织切片过浅，仅显示出隐窝的横截面，且未见连续的黏液层或细菌。（B）组织或盖玻片覆盖不均可能导致拼接图像模糊且照明不均。本例中，拼接扫描的某个位置（右上角）处于失焦状态。（C）正常背景（左）与高背景（右）示例。本例中为DAPI信号，注意上皮区域、细胞核外的非特异性信号。所有比例尺 = 20 µm。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

上述方案提供了一种可重复的方法，用于可视化宿主与微生物群之间的界面。这些检测方法在方案优化方面已取得显著进展，从荧光原位杂交（FISH）标记的优化¹⁸，到黏液的保存与成像技术的改进⁹。固定与包埋还可实现样本的有效储存；此外，石蜡浸透的组织盒可直接邮寄，无需特殊限制，因为样本已完全固定并处于惰性状态。

意义及替代方法
荧光原位杂交（FISH）与黏液染色相结合，能够分析特定组织位置的微生物群组成，以及单个细菌与宿主之间的相互作用。其他涉及微生物群内特定部位分析的技术通常无法探究这些相互作用的单细胞特性，例如激光捕获显微切割联合测序技术¹⁹。然而，基于测序的技术具有优势，能够在比16S rRNA探针更精细和更广泛的层面上捕获微生物群的遗传构成。

本方案的一个局限性在于，它仅能提供宿主微生物群在某一时间点的静态图像。若要在活体动物中进行实时成像，需要特殊的成像技术以促进深层组织中荧光信号的获取（例如活体双光子显微镜和光片荧光显微镜^20,21）。在这些方法中，模型生物要么被带有可结合其包膜分子的染料标记的细菌定植²⁰，要么被携带荧光蛋白的基因工程菌定植²¹。在后一种情况下，荧光蛋白的成熟是一个关键问题，因为大多数标准荧光蛋白需要氧气才能发光。因此，需要至少具有微需氧环境（纳摩尔浓度氧气）的模型生物，例如好氧的斑马鱼肠道²¹。

在本实验方案中，使用甲醇-卡诺固定液（methanol-Carnoy）作为固定剂，而非多聚甲醛或福尔马林，因其不含水。这可防止在样品处理过程中黏液层发生水合、脱水及塌陷，从而有助于准确测量黏液层厚度。尽管甲醇-卡诺固定结合石蜡包埋已成为该领域的常用方法，但已有研究探索了不同的固定剂和包埋技术以优化黏液保存效果^9,22，部分研究表明树脂包埋可能优于石蜡包埋²²。然而，石蜡包埋与甲醇-卡诺固定的另一个重要局限在于会丧失荧光蛋白的荧光信号，这一问题可通过使用其他固定剂（如福尔马林或多聚甲醛（PFA））或改进的包埋技术加以避免²³。每种固定剂均有其优缺点，选择应基于成像需求而定。若将生物学重复样本分别用PFA和甲醇-卡诺固定，并从两组样本中分别获取图像，则可结合多种成像方式。

在个别情况下，FISH 已与免疫荧光结合使用，采用特异性的抗 Muc2C3 兔多克隆抗体^9,24。这些结果尚未被广泛使用其他 Muc2 抗体重现，表明抗体的选择可能对 FISH 与免疫荧光联合实验的成功至关重要。针对特定抗体获得成功免疫染色的条件，可能不利于保留 FISH 染色信号。

故障排除
在本方案中，样本采集、切片和染色是防止产生成像伪影的关键步骤。例如，在采集样本时以及包埋前对组织施加压力，可能导致微生物群的错位定位，并影响黏液的质量。另一个重要考虑因素是，应避免将厚度差异较大的组织片段放入同一个包埋盒中，例如将一段内容较少的小肠与远端结肠中的粪便颗粒混合放置。不同厚度的组织会导致成像困难：包埋后，对某一组织片段在特定深度进行横切面切片时，可能并不适用于另一片段的成像（例如，每种组织的管腔将处于不同的成像深度）（图1B、C 和 图3A）。此外，在对动物模型粪便颗粒进行成像时，可将其包裹于腹膜中²⁴。该技术中，取一小段新鲜分离的腹膜，轻轻包裹在粪便颗粒外，可在本方案所述清洗步骤中有效维持粪便颗粒的结构完整性。

与处理含有内容物的动物组织不同，对人类肠道样本进行成像存在一些挑战。具体而言，肠镜检查前通常需进行肠道准备，这很可能破坏肠道活检或切除手术前的管腔内容物和黏膜层。此外，在采集活检样本时，记录组织的方向性有助于在缺乏肠道内容物的情况下识别特定结构特征（例如肠腔与黏膜下层）。使用3%琼脂和/或琼脂-明胶混合物进行预包埋可能有助于维持组织的极性²⁵；然而，文献报道琼脂在脱水和切片过程中存在问题，因此可能需要调整处理时间。

获得良好FISH染色效果的关键在于针对特定FISH探针调整甲酰胺浓度。甲酰胺可调控FISH探针与其靶标的杂交严谨性。必须确保：a）为特定微生物群落选择合适的甲酰胺浓度；b）所使用的探针组合本身能够适用某一适宜的甲酰胺浓度——这一点可能影响多探针联合使用时的最佳探针选择。mathFISH（http://mathfish.cee.wisc.edu/）等网站可辅助计算特定探针所需的合适甲酰胺浓度。若缺乏有关合适甲酰胺浓度的信息，可先用0%和10%甲酰胺对该实验方案进行测试。

包埋样品的切片需要将组织块切至足够深度，以获得管腔切面；若切片过浅，则只能得到绒毛/隐窝的横截面，无法观察到管腔内容物（图3A）。为获得最佳的FISH信号，应在切片后尽快进行染色，并使用新鲜的DAPI（或保存于-20 °C的DAPI）以解决背景问题（图3C）。切片若存放超过一个月再进行FISH染色，可能导致染色效果较差或不一致。

如果组织或盖玻片相对于载玻片并非完全平整，则在平铺扫描的各个位置处样本可能无法完全聚焦（图3B），从而导致无效操作和潜在的光漂白。该问题可通过采用更小范围的平铺扫描来解决，确保所有位置均处于焦点范围内。使用钝刀片切片还可能导致黏液和管腔内容物脱落，在成像时表现为大面积的暗区。最后，杂交过程中溶液蒸发或产生气泡，可能导致组织中FISH探针染色不均。

另一个影响FISH探针结合效率的关键参数是不同探针之间的竞争。验证FISH探针是否标记了细菌的一个有效方法是观察FISH探针信号与DAPI染色信号的共定位情况（图2C、D）。在需要使用多个rRNA探针的样品中，调节杂交温度、探针浓度和甲酰胺浓度等参数至关重要，以确保探针能够高效地结合到正确的目标物种上¹⁸。

成像注意事项
FISH染色的细菌最好使用共聚焦显微镜和至少40倍的物镜进行观察。虽然推荐使用63倍物镜以单细胞水平成像细菌，但也可通过最大化数字变焦或使用超分辨率系统来采用40倍物镜。配备超分辨率功能的系统还可能提供单个细菌细胞的亚细胞分辨率。较低倍率的物镜可用于大致了解细菌的定位及黏液层的厚度。

强烈建议获取16位图像而非8位图像，因为更高的动态范围有助于同时捕获上皮细胞核部极强的DAPI信号以及管腔内细菌相对较弱的信号。除了使用上述成像装置外，另一个重要的成像考虑因素是荧光染料的选择。为了最佳区分不同类型的细菌，应确保所用荧光染料的激发光谱和发射光谱不发生重叠（除非在具备线性光谱拆分能力的系统上进行成像）。此外，探针可联合使用（例如，科特异性探针与属特异性探针联用），以鉴定更多的群落成员。若使用线性光谱拆分或未经验证的探针，则必须在纯培养物上测试FISH染色的准确性和染色水平^8,14。

图像采集完成后，可使用多种工具对宿主-微生物群界面进行定量分析，例如 BacSpace²⁶HiPR-FISH⁸以及其他分割工具²⁷BacSpace 是一款 MATLAB 软件，可用于对组织和管腔成分进行分割，并从图像中去除植物材料²⁶该程序还可分析二维条件下的黏液层厚度，并基于不同通道中的像素距离对空间分布进行量化。²⁶相反，HiPR-FISH 图像分析软件可实现对 FISH 染色细胞的分割⁸最后，其他已针对细菌分割优化的工具 体外 实验²⁷ 也可适用于此应用。

结论
原位 成像技术能够在饮食、黏液和宿主上皮隐窝所形成的多种微环境背景下，对微生物群落中各个分类单元进行定量分析。生物体之间的相互作用决定了与宿主相关的微生物系统的生物学特性，并为这些结构在扰动过程中发生的变化提供关键分析，进而影响健康。值得注意的是，对微生物群进行成像的能力 原位 通过上述方案可深入揭示微生物群落与动物宿主之间相互关系的生物地理学特征。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝箔
氯仿	Fisher	C298-500	有毒
柯普林瓶（Coplin jar）	Fisher	08-813E
盖玻片，22 × 22 mm，厚度1号	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	重悬至5 mg/mL
空移液器吸头盒			用于熔化石蜡
无水乙醇，分子级	--	--
FISH探针
FISH杂交溶液	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4，0.9 M NaCl，0.01% (w/v) SDS，溶于无核酸酶水中。可选添加5–50% (v/v) 甲酰胺
FISH洗涤缓冲液	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7.4，0.9 M NaCl
荧光标记的欧洲白荆豆凝集素（UEA-1）	Vector Laboratories	FL-1061（荧光素标记）或 RL-1062-2（罗丹明标记）	UEA-1可标记岩藻糖基化聚糖，因此不适用于无菌小鼠或岩藻糖基转移酶2（FUT2）缺陷宿主的样本。
镊子
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F9037
通风橱
冰醋酸	Fisher	A38-212	腐蚀性且易燃
HybriSlip柔性塑料盖玻片，22 × 22 mm × 0.25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	用于FISH杂交步骤，可用玻璃盖玻片替代
ImmEdge疏水屏障PAP笔	Vector Laboratories	H-4000
吸水纸（Kimwipes）
甲醇	Fisher	A412	有毒且易燃
切片机			用于组织切片
多功能标本储存容器，473 mL	Fisher	14-955-117A	可用任意玻璃或聚乙烯容器替代。甲醇-卡诺夫固定液（Methacarn）不适用于聚苯乙烯或金属容器。
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	任何指甲油均可使用
烘箱			所需温度范围：45–60 °C
石蜡：Leica Paraplast	Leica	39601006
PBS磷酸盐缓冲液（10倍浓缩液）	Fisher	BP3991	使用时稀释至1倍浓度
氯化钠	Fisher	S271
十二烷基硫酸钠（SDS），20%溶液，无RNase	Invitrogen	AM9820
Tissue-Loc HistoScreen包埋盒	Thermo Scientific	CA83009-999
Trizma盐酸盐溶液，1M Tris-HCl，pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1000
无核酸酶水	Fisher	BP2484100
二甲苯	Fisher	X3P-1GAL	有毒且易燃