从人类胚胎干细胞中引导肝细胞样细胞诱导的有效方法

摘要

本手稿描述了人类胚胎干细胞（hESC）分化成功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细协议，在hESC分化过程中连续补充Activin A和CHIR99021，以最终内分泌体（DE）。

摘要

从人类胚胎干细胞中提取的肝细胞样细胞（HMC）的潜在功能对疾病建模和药物筛选应用有很大的希望。如果这里是将 hESC 区分为功能性 HMC 的有效且可重复的方法。建立内皮体血统是区分HLC的关键步骤。通过我们的方法，我们通过在 hESC 分化过程中持续补充 Activin A 和 CHIR99021 来调节关键信号通路，然后生成肝祖细胞，最后在具有完全定义试剂的阶段性方法中使用典型的肝细胞形态学的 HLC。这种方法产生的 hESC 衍生 HLC 表示特定阶段标记（包括白蛋白， HNF4®核受体和陶罗乔拉酸钠共运多肽（NTCP），并表现出与成熟和功能性肝细胞（包括花青绿色染色、糖原储存、血氧林-异丙辛染色和CYP3活性）相关的特殊特性，为肝病研究中基于HLC的应用的发展提供了平台。

引言

肝脏是一种高度代谢的器官，起着多种作用，包括脱氧、储存糖原、蛋白质的分泌和合成^等。各种病原体、药物和羊群可引起肝脏病理变化，影响其功能^。肝细胞作为肝脏的主要功能单位，在人工肝脏支持系统和药物毒性消除方面发挥着重要作用。然而，在细胞治疗和肝病研究中，原发性人类肝细胞的资源有限。因此，开发新的功能性人类肝细胞来源是再生医学领域的一个重要研究方向。自1998^年建立HESC以来，由于具有优越的分化潜力（可以在合适的环境中分化成各种组织）和高度的自我更新性，为生物关节肝、肝细胞移植甚至肝^{组织工程提供了}理想的来源细胞，因此，hESC得到了广泛的应用。

目前，通过丰富内分^泌物6，可以大大提高肝分化效率。在干细胞分泌成内分泌物的系数中，转化生长因子β（TGF-β）信号和WNT信号通路的水平是内分泌形成阶段节点的关键因素。激活高水平的TGF-β和WNT信号可以促进内分泌^体7、8的发展。阿克蒂文A是属于TGF-β超级家庭的细胞因子。因此，Activin A广泛应用于人类诱导多能干细胞（hiPSC）和hESC^9、10的内皮体诱导。葛兰素史克3是一种血清素-三氨酸蛋白激酶。研究人员发现，CHIR99021是葛兰素史克3®的特异性抑制剂，可以刺激典型的WNT信号，并在一定条件下促进干细胞分化，表明CHIR99021有可能诱导干细胞分化成内分泌物11、12、13。

在这里，我们报告一种高效和可重复的方法，用于有效诱导 hESC 分化为功能 HHLC。Activin A 和 CHIR99021 的连续添加产生了约 89.7 ±0.8% SOX17 （DE 标记） 阳性细胞。 在体外进一步成熟后，这些细胞表示肝特异性标记，并施加肝细胞状形态（基于血氧林-肌辛染色（H &E））和功能，如吸收花青绿色（ICG）、糖原储存和CYP3活性。结果表明，HESC可以通过这种方法成功分化为成熟的功能HLC，为肝病相关研究和 体外 药物筛选提供依据。

方案

1. 干细胞维护

注:下文所述的细胞维护协议适用于在附着单层中维护的 hES03 细胞系。对于本手稿中的所有以下协议，细胞应在生物安全柜下处理。

1. 通过稀释5倍补充介质到mTesR基础介质，准备1xmTesR干细胞培养介质。
2. 通过在冰面上稀释 5 毫升符合 hESC 资格的矩阵凝胶，用 5 毫升的 DMEM/F12 来制备 30 倍 hESC 合格的矩阵介质。存储在-20°C。
3. 通过稀释 33.3 μL 的 30x hESC 合格矩阵凝胶与 1 mL 的 DMEM/F12 来准备 1x hESC 合格矩阵介质。
4. 涂层无菌 6 井，组织培养处理板与 1mL 的 1x hESC 合格矩阵在每口井提前和存储在 4 °C 过夜。在使用前在室温下 （RT） 离开至少 30 分钟。
5. 在37°C的水浴中解冻冷冻保存的hESC3分钟，无需摇晃。然后立即将细胞通过管道输送到包含 4 mL 预热 37 °C mTesR 介质的 15 mL 离心管中，轻轻上下吹笛 2 次。
6. 在RT以200 x g 的速度将hESC离心2分钟。
7. 吸气超自然，并轻轻地在1mL的mTesR介质中恢复细胞。
8. 从板中吸气 DMEM/F12 介质，将细胞播种到 6 井板的井中，密度为 1 x 10⁵ 细胞，在 2 mL 的 mTesR 中。
9. 在 5% 的 CO₂ 孵化器中孵化，并通过每天更换预热的 mTesR 介质来维护细胞。通过细胞在大约70-80%的汇合或当细胞群落开始接触。

2. 干细胞的传递和分化

1. 对于传递细胞，吸气介质，用每口酶溶液1mL孵育细胞（例如，在37°C处使用Acutase5分钟。 然后通过管道将细胞转移到含有 4 mL DMEM/F12 预热至 37 °C 的 15 mL 离心管。
2. 在RT以200 x g 的速度将细胞离心2分钟。
3. 吸气介质，并轻轻地在 1 mL 的 mTesR 介质中恢复细胞颗粒。
4. 提前用 250μL 的 1x hESC 合格矩阵介质涂层，准备 24 井板。种子 hESC 如上所述，密度为 1 - 1.5 x^{10 5} 细胞每井在 500 μL 的 mTesR 介质。
5. 允许细胞在 CO 2 孵化器中以 37 °C 的 37 °C 孵化₂₄ 小时。

3. DE 形成

1. 准备库存解决方案 100μg/mL Activin A 与 DPBS 包含 0.2% BSA 和 3 mM CHIR99021 与 DMSO.
2. 通过用 1x B27 补充 RPMI 介质来准备阶段 I 区分基础介质。
3. 将 Activin A 添加到 100 ng/mL 的最终浓度和 CHIR99021，最终浓度为 3 μM，以适当量预热的阶段 I 分化基本介质。
4. 从细胞中吸入 mTesR 介质，代之以包含添加分化因子的 I 阶段分化介质（例如，24 井板每口井 0.5 mL）。
5. 允许细胞在 CO 2 孵化器中以 37 °C 孵育₃ 天，每天用新添加的分化因子（第 0-2 天）替换第一阶段介质。
   注:经过3天的分化后，分化细胞应表示DE细胞的标记，如FOXA2、SOX17、GATA4、CRCR4和FOXA1（进行SOX17所需的至少80%）。

4. 肝祖细胞的分化

1. 通过溶解淘汰血清置换 （KOSR） 到敲出 DMEM 中 20% 的最终浓度来准备第二阶段分化基础介质。
2. 准备第二阶段分化介质，含有 1% DMSO， 1x 麸质MAX， 1x 非必需氨基酸 （NEAA） 溶液， 100 μM 2-甲基苯甲醇和 1x 青霉素/链霉素 （P/S） 到适当的体积 KOSR/敲击 DMEM.
3. 在分化的第 3 天，吸气介质并替换为 II 级介质（例如，24 个井板每口井 0.5 mL）。然后孵育24小时。
4. 在分化的第 4 天，吸气介质并替换为第二阶段介质（例如，24 井板每口井 1 mL）。
5. 每隔一天更换一次介质（在第 6 天更换介质）。
   注:经过8天的分化后，分化细胞应表示肝祖细胞的适当标记，如HNF4®、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA（进行所需的HNF4®的至少80%）。

5. 肝细胞分化

1. 用DBPS（含0.2%BSA）准备10微克/mL肝细胞生长因子（HGF）、20微克/mL翁科斯塔汀（OSM）库存解决方案，并使用0.22微米滤膜进行过滤。
2. 准备第三阶段分化基础介质（肝酶-SFM （HZM） 介质，辅以 10 μM 氢皮质松-21-混合和 1x P/S）。
3. 将 HGF 添加到最终浓度为 10 ng/mL，OSM 将最终浓度为 20 ng/mL 添加到适当的预热 III 阶段分化介质中。
4. 在分化的第8天，从细胞中吸气第二阶段介质，代之以第三阶段介质（例如，24个井板每口井1毫升）。
5. 允许细胞_{在二氧化碳} 孵化器中以37°C孵育10天，每隔一天用新添加的分化因子（第8-18天）更换第三阶段介质。
   注:经过18天的分化后，分化细胞应表示肝细胞的特征标记，如AAT、ALB、TTR、HNF4®、NTCP、ASGR1、CYP3A4。白蛋白阳性细胞的百分比通常超过90%。

6. RNA 隔离、cDNA 合成和 RT-qPCR 分析

1. 从细胞中吸气介质，并添加适量的 RNAiso Plus 试剂（例如，24 井板每口井 0.3 mL）。在 1.5 mL 管中收集超自然人，让站在 RT 上 5 分钟。
2. 加入60μL的氯仿试剂，并将其留在RT 5分钟。然后离心机在12，000 x g15 分钟。
3. 收集125μL超自然，并将其转移到另一个离心管。加入160μL的异丙酚，混合好，并在RT站10分钟。
4. 离心机在12，000 x g 10分钟。
5. 去除超自然，在沉淀物中加入75%的乙醇，在7，500 x g 下将离心机加入5分钟。
6. 在 RT 干燥后，加入 40μL 的 DEPC 处理水溶解。对于 qPCR，根据制造商的协议，用反向转录套件反向转录 2 μg 的总 RNA。
7. 根据制造商的协议使用商业套件执行 RT-qPCR。
8. 使基因表达与非诱导干细胞正常化，并确定GAPDH正常化后的折叠变异。

7. 免疫荧光分化验证

1. 通过向 PBS 添加 0.1% 补间-20 来准备 1 倍 PBST 洗涤缓冲区。
2. 从附着细胞中吸气介质，并在摇床的RT上用PBS短暂清洗。
3. 吸气 PBS 和孵化细胞与 500μL 的冰冷甲醇每井 24 井板修复细胞在 -20 °C 过夜。
4. 在 RT 上取出甲醇，用 PBS 在摇床上清洗细胞 3 次，每次 10 分钟。
5. 在摇床的RT上用PBS中500μL的5%BSA准备1-2小时的块状细胞。
6. 在用于阻塞的相同溶液中，在1:200稀释原抗体。
7. 在摇床4°C的夜间将固定细胞孵化在300μL原抗体溶液中。
8. 隔夜孵化后，每次在RT摇床上用PBST清洗细胞3次，每次10分钟。
9. 在 1:1000 时在阻塞溶液中准备次要抗体解决方案。
10. 在摇床的RT中孵育300μL的二次抗体溶液，防止光线照射1小时。
11. 吸气二次抗体溶液，每次在摇床的RT上用PBST清洗细胞3次，每次10分钟。
12. 用 300μL 的 1μg/mL DAPI 孵化细胞 3-5 分钟，然后用 PBST 清洗两次。
13. 吸气PBST后，添加适量的PBS，用于在荧光显微镜下拍照。

8. 西方污点分析

1. 通过在三叶草缓冲盐 （TBS） 中添加 0.1% Tween-20 来准备 1 倍 TBST 洗涤缓冲区。
2. 根据制造商的协议，使用商业套件准备 SDS-PAGE 电泳缓冲器和西转移缓冲器。
3. 在 10% 硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上解决总细胞蛋白 （40 μg）， 并在 SDS-PAGE 电泳缓冲器中以 15 mA 恒定电流运行约 2 小时。
4. 在300毫亚恒流下，将凝胶转移到聚乙烯二氟化物（PVDF）膜，在低温下持续2小时。
   注:运行时间和传输时间可能因所用设备以及凝胶的类型和百分比而异。
5. 用TBST中准备的3%BSA在摇床的RT上块住膜1小时。
6. 在摇床上以 4 °C 的夜间浸入原抗体溶液（1:1000 稀释）。
7. 隔夜孵育后，用TBST清洗印迹膜3次，每次在RT摇床上洗15分钟。
8. 在摇床的RT中孵化在二次抗体溶液（1:2000稀释）中2小时。
9. 丢弃二次抗体溶液，用 TBST 清洗膜 3 次，每次在摇床的 RT 上洗 15 分钟。
10. 使用化学发光试剂可视化免疫活性带，然后进行自辐射。使用β行为作为加载控制。

9. 花青素绿色吸收

1. 在DMSO中准备200毫克/mL的花青绿色库存解决方案。
2. 通过补充第三阶段分化介质与花青素绿色溶液，以最终浓度为1毫克/mL来准备工作解决方案。
3. 在37°C中孵化，5%CO₂ 孵化器，1-2小时。
4. 吸气介质，用 PBS 清洗细胞 3 次。
5. 在显微镜下拍照。

10. 定期酸-希夫（PAS）染色和血氧林-欧辛（H&E）染色

1. 从附着细胞中吸气介质，用 PBS 短暂洗两次。
2. 对于细胞固定，吸气PBS和孵育细胞与冰冷甲醇在-20°C过夜。
3. 通过 PAS 染色可视化糖原存储，并按照制造商的说明使用套件使用 H &E 染色观察二元细胞。
4. 用荧光显微镜拍摄图像。

11. CYP 活动的分析

1. 根据制造商的说明，使用市售的基于单元的检测（P450-Glo测定）测量 CYP450 活动。
2. 使用三个独立的重复进行测试。数据表示为平均± SD。

结果

HLC 感应的示意图图和每个分化阶段的代表性亮场图像显示在图 1 中。在第一阶段，Activin A和CHIR99021被添加3天，以诱导干细胞形成内皮细胞。在第二阶段，内皮细胞在用分化介质治疗5天后分化成肝祖细胞。在第三阶段，早期肝细胞在HGF和OSM（图1A）中10天后成熟并分化为HLC。在分化的最后阶段，细胞表现出典型的肝细胞表型（细胞是多边形的，分布均匀和定期）（图1B）。

为了进一步确认肝分化，RT-qPCR、免疫荧光染色和西斑用于检测内皮细胞、肝祖细胞和成熟肝细胞的标记物（图2）。分化细胞显示每个阶段与分化相关的基因和蛋白质的表达水平很高，如第3天SOS17（89.7±0.8%）， 肝祖标记HNF4®（81.3±2.9%）在第8天，法新社（86.6±0.3%）在第14天，成熟肝细胞标记ALB（94.5±1.1%）在第18天。这些结果表...

讨论

在这里，我们提出了一个分步方法，将 HSC 分为三个阶段。在第一阶段，阿克蒂文A和CHIR99021用于区分氢氟碳化合物到DE。在第二阶段，KO-DMEM和DMSO用于区分DE到肝祖细胞。在第三阶段，HZM加HGF、OSM和氢皮质松21-血氧钠盐用于继续将肝祖细胞分化为HLC。

在使用协议时，需要考虑以下关键步骤。细胞的初始分化密度和中等变化的准确时间是成功分化的重要因素。当我们开始分化时，我们必须确保初始播种密度是适当的，在大约30-40%的交汇点，当细胞刚刚开始相互接触时，细胞间空间均匀地排列在视觉领域的网络中。在分化过程中，必须在指示的时间，特别是在每个替换阶段的第一阶段和关键时刻精确改变相应的分化介质，以确保细胞在模拟胚胎发育过程的模式和阶段中分化。

将 HESC 分化为 DE 的第一阶段尤为重要。通常有大量的细胞在分化阶段分离和漂浮，这是细胞命运的关键阶段，但在这个时候，细胞仍然保留着增殖的能力。因此，在第一阶段结束时，细胞的汇合率可以达到90-100%左右。此外，应当指出，在第三阶段分化（即第8天）开始时，细胞的细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma	M7522	用于肝祖细胞分化
488 标记的山羊抗小鼠 IgG	ZSGB-BIO	ZF-0512	用于 IF，第二抗体
488 标记的山羊抗兔 IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	用于 IF，第二抗体
Accutase	Stem Cell Technologies	7920	用于细胞传代
激活素 A	peproTech	120-14E	用于确定性内胚层形成
抗白蛋白 （ALB）	Sigma-Aldrich	A6684	用于 IF 和 WB，一抗
- 人 Oct4	Abcam	Ab19587	用于 IF，一抗
- &α;-胎蛋白 （AFP）	Sigma-Aldrich	A8452	用于 IF 和 WB，一抗
-SOX17	Abcam	ab224637	对于 IF，一抗
抗肝细胞核因子 4 α （HNF4α）	Sigma-Aldrich	SAB1412164	用于 IF，一抗
B-27 补充剂	Gibco	17504-044	用于确定性内胚层形成
BSA	Beyotime	ST023-200g	用于细胞封闭
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046	用于确定性内胚层形成
DAPI	Beyotime	C1006	用于细胞核染色
DEPC-水	Beyotime	R0021	用于 RNA 溶出
DM3189		MCE HY-12071	用于确定性内胚层形成
DMEM/F12	Gibco	11320-033	用于细胞培养
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	用于肝祖细胞分化
DPBS	Gibco	14190-144	用于细胞培养
GlutaMAX	Gibco	35050-061	用于肝祖细胞分化
H&E 染色套件	Beyotime	C0105S	For H&E 染色
肝细胞生长因子 （HGF）	peproTech	100-39	用于肝细胞分化
HepatoZYME-SFM （HZM）	Gibco	17705-021	用于肝细胞分化
氢化可的松-21-半琥珀酸	Sigma-Aldrich	H4881	用于肝细胞分化
吲哚菁	Sangon Biotech	A606326	用于吲哚菁染色
Knock Out DMEM	Gibco	10829-018	用于肝祖细胞分化
Knock Out SR 多物种	Gibco	A31815-02	用于肝祖细胞分化
经 hESC 验证的 Matrigel	宁	354277	用于细胞培养
MEM NeAA	Gibco	11140-050	用于肝祖细胞分化
mTesR 5X补充剂	Stem Cell Technologies	85852	用于细胞培养
mTesR 基础培养基	Stem Cell Technologies	85851	用于细胞培养
抑瘤素 （OSM）	peproTech	300-10	用于肝细胞分化
P450 - CYP3A4 （荧光素 - PFBE）	Promega	V8901	用于 CYP450 活性
PAS 染色试剂盒	Solarbio	G1281	用于 PAS 染色
笔/链球菌	Gibco	15140-122	用于细胞分化
过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG	ZSGB-BIO	ZB-2305	用于 WB，二抗
一抗稀释缓冲液 用于 Western Blot	Beyotime	P0256	用于一抗稀释
ReverTraAce qPCR RT 试剂盒	TOYOBO	FSQ-101	用于 cDNA 合成
RNAiso Plus	TaKaRa	9109	用于 RNA 分离
RPMI 1640	Gibco	11875093	用于确定性内胚层形成
脱脂牛奶	Sangon Biotech	A600669	用于第二抗体制备
SYBR Green 预混液	Thermo Fisher Scientific	A25742	用于 RT-PCR 分析
Torin2	MCE	HY-13002	用于确定性内胚层形成
Tween	Sigma-Aldrich	WXBB7485V	用于洗涤缓冲液制备