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方法文章

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

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DOI：

10.3791/62654

⸱

2021年5月6日

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin A和CHIR99021。

摘要

由人胚胎干细胞（hESCs）衍生的肝细胞样细胞（HLCs）在疾病建模和药物筛选应用方面具有广阔前景。本文提供了一种高效且可重复的hESCs向功能性HLCs分化的实验方法。内胚层谱系的建立是向HLCs分化过程中的关键步骤。本方法通过在hESCs向定型内胚层（DE）分化阶段持续添加Activin A和CHIR99021，调控关键信号通路，随后依次生成肝前体细胞，最终在完全明确的试剂条件下，分阶段获得具有典型肝细胞形态的HLCs。该方法所获得的hESC来源HLCs表达各阶段特异性标志物（包括白蛋白、HNF4α核受体和牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）），并表现出成熟且功能性肝细胞的特有特征（包括吲哚菁绿染色、糖原储存、苏木精-伊红染色以及CYP3A活性），可为肝细胞样细胞在肝脏疾病研究中的应用提供有效平台。

引言

肝脏是一个高度代谢活跃的器官，具有多种功能，包括解毒、糖原储存以及蛋白质的分泌和合成1。多种病原体、药物及遗传因素均可引起肝脏的病理改变，影响其正常功能2,3。肝细胞作为肝脏的主要功能单位，在人工肝支持系统和药物毒性清除中发挥着重要作用。然而，在基于细胞的治疗以及肝脏疾病研究中，原代人肝细胞的来源十分有限。因此，开发新的功能性人肝细胞来源是再生医学领域的重要研究方向。自1998年人胚胎干细胞（hESCs）建立以来4，由于其具有强大的分化潜能（在适宜环境下可分化为多种组织）和高度的自我更新能力，hESCs被研究人员广泛视为理想的细胞来源，可用于生物人工肝、肝细胞移植乃至肝组织工程5。

目前，通过富集内胚层可显著提高肝细胞分化效率6。在干细胞向内胚层谱系分化的过程中，转化生长因子β（TGF-β） 信号通路和WNT信号通路的水平是内胚层形成阶段的关键调控节点。高水平激活TGF-β和WNT信号通路可促进内胚层的发育7,8。Activin A属于TGF-β超家族的一种细胞因子，因此在人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）的内胚层诱导中被广泛应用9,10。GSK3是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。研究人员发现，GSK3β的特异性抑制剂CHIR99021能够激活典型的WNT信号，并在特定条件下促进干细胞分化，表明CHIR99021在诱导干细胞向内胚层分化方面具有潜在应用价值11,12,13。

本文报道了一种高效且可重复的方法，可有效诱导人胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝样细胞（HLCs）。通过依次添加Activin A和CHIR99021，可获得约89.7±0.8%的SOX17（定型内胚层标志物）阳性细胞。随后进一步成熟培养 体外，这些细胞表达肝特异性标志物，并呈现类似肝细胞的形态（基于苏木精-伊红染色（H & E）及功能，如吲哚菁绿（ICG）摄取、糖原储存和CYP3活性。结果表明，通过该方法可成功将hESCs分化为成熟且具有功能的肝样细胞（HLCs），并为肝病相关研究提供基础 体外 药物筛选

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方案

1. 干细胞维持

注意：以下所述的细胞维持方案适用于以贴壁单层培养的 hES03 细胞系。本论文中所有后续方案的操作均应在生物安全柜中进行。

  1. 通过将5倍浓缩的补充培养基稀释至mTesR基础培养基中，制备1倍mTesR干细胞培养基。
  2. 在冰上将5 mL hESC级Matrigel与5 mL DMEM/F12混合，制备30倍hESC级Matrigel储存液。于-20 °C保存。
  3. 取33.3 µL 30倍hESC级Matrigel，用1 mL DMEM/F12稀释，制备1倍hESC级Matrigel工作液。
  4. 提前在4 °C条件下，用每孔1 mL的1倍hESC级Matrigel溶液包被无菌6孔组织培养板，过夜孵育。使用前于室温（RT）放置至少30分钟。
  5. 将冻存的hESC置于37 °C水浴中静置解冻3分钟，不振摇。随后立即用移液器将细胞转移至含有4 mL预热至37 °C的mTesR培养基的15 mL离心管中，轻轻吹打混匀2次。
  6. 在室温下以200 ×g离心2分钟，沉淀hESC细胞。
  7. 吸除上清液，轻轻将细胞重悬于1 mL mTesR培养基中。
  8. 吸去培养板中的DMEM/F12溶液，将细胞以每2 mL mTesR培养基接种1 × 105个细胞的密度接种至6孔板的一个孔中。
  9. 置于含5% CO2的培养箱中孵育，每日更换预热的mTesR培养基以维持细胞生长。当细胞融合度达到约70–80%，或细胞克隆开始相互接触时进行传代。

2. 干细胞传代与分化

  1. 传代细胞时，吸除培养基，加入1 mL/孔的酶溶液（例如Accutase ），在37 °C孵育5分钟。然后用移液器将细胞转移至含有4 mL预热至37 °C的DMEM/F12培养基的15 mL离心管中。
  2. 在室温下以200 ×g离心2分钟。
  3. 吸除上清液，并用1 mL mTesR培养基轻柔重悬细胞沉淀。
  4. 提前使用250 µL 1× hESC级Matrigel培养基包被24孔板。按照上述方法，以每孔1 - 1.5 × 105个细胞的密度，将hESC接种于500 µL mTesR培养基中。
  5. 将细胞置于CO2培养箱中，在37 °C孵育24小时。

3. 内胚层形成

  1. 用含有0.2% BSA的DPBS配制100 µg/mL的Activin A储存液，并用DMSO配制3 mM的CHIR99021储存液。
  2. 通过在RPMI培养基中添加1× B27，制备I阶段分化基础培养基。
  3. 将Activin A加入预热的I阶段分化基础培养基中，使其终浓度为100 ng/mL，同时加入CHIR99021使其终浓度为3 µM。
  4. 吸除细胞中的mTesR培养基，替换为添加了分化因子的I阶段分化培养基（例如，每孔24孔板加入0.5 mL）。
  5. 将细胞置于37 °C的CO2培养箱中孵育3天，每天更换含有新鲜分化因子的I阶段培养基（第0–2天）。
    ​注意：分化3天后，分化细胞应表达定型内胚层（DE）细胞的标志物，如FOXA2、SOX17、GATA4、CRCR4和FOXA1（进入下一步前，SOX17阳性细胞比例至少需达到80%）。

4. 肝祖细胞的分化

  1. 通过将 Knockout 血清替代物（KOSR）溶解于 Knock Out DMEM 中，配制成终浓度为 20% 的第二阶段分化基础培养基。
  2. 向适当体积的 KOSR/Knockout DMEM 中添加 1% DMSO、1× GlutaMAX、1× 非必需氨基酸（NEAA）溶液、100 µM 2-巯基乙醇和 1× 青霉素/链霉素（P/S），配制成含上述成分的第二阶段分化培养基。
  3. 在分化第 3 天，吸除原有培养基，更换为第二阶段分化培养基（例如，24 孔板每孔 0.5 mL），随后继续培养 24 小时。
  4. 在分化第 4 天，吸除培养基，更换为第二阶段分化培养基（例如，24 孔板每孔 1 mL）。
  5. 每隔一天更换一次培养基（例如在第 6 天更换）。
    ​注意：分化培养 8 天后，分化所得细胞应表达肝前体细胞的相关标志物，如 HNF4α、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPA（进入下一步前，HNF4α 阳性细胞比例至少需达到 80%）。

5. 肝细胞分化

  1. 使用含0.2% BSA的DBPS配制10 µg/mL肝细胞生长因子（HGF）和20 µg/mL抑癌素（OSM）的储存液，并用0.22 µm滤膜过滤。
  2. 配制III阶段分化基础培养基（HepatoZYME-SFM（HZM）培养基，添加10 µM氢化可的松-21-半琥珀酸酯和1×青霉素-链霉素溶液）。
  3. 将HGF加入预热的III阶段分化培养基中，使其终浓度为10 ng/mL；将OSM加入同一培养基中，使其终浓度为20 ng/mL。
  4. 在分化第8天，吸除细胞中的II阶段培养基，更换为III阶段培养基（例如，24孔板每孔1 mL）。
  5. 将细胞置于37 °C、CO2培养箱中继续培养10天，每隔一天更换一次III阶段培养基，并重新添加新鲜的分化因子（第8–18天）。
    ​注意：分化18天后，分化所得细胞应表达肝细胞的特征性标志物，如AAT、ALB、TTR、HNF4α、NTCP、ASGR1、CYP3A4。白蛋白阳性细胞的比例通常超过90%。

6. RNA 提取、cDNA 合成及 RT-qPCR 分析

  1. 吸弃细胞培养基，加入适量 RNAiso Plus 试剂（例如，24 孔板每孔加 0.3 mL）。将上清液收集至 1.5 mL 离心管中，室温静置 5 分钟。
  2. 加入 60 µL 氯仿试剂，室温放置 5 分钟，然后在 12,000 x g 下离心 15 分钟。
  3. 吸取 125 µL 上清液转移至另一离心管中，加入 160 µL 异丙醇，充分混匀后室温静置 10 分钟。
  4. 在 12,000 x g 下离心 10 分钟。
  5. 弃去上清液，向沉淀中加入 75% 乙醇，在 7,500 x g 下离心 5 分钟。
  6. 室温干燥后，加入 40 µL DEPC 处理水溶解 RNA。进行 qPCR 时，按照逆转录试剂盒说明书，使用 2 µg 总 RNA 进行逆转录。
  7. 按照试剂盒说明书，使用商业化的试剂盒进行 RT-qPCR。
  8. 以未诱导的干细胞为参照标准化基因表达水平，并以 GAPDH 为内参进行归一化后确定表达倍数变化。

7. 分化作用的免疫荧光验证

  1. 通过将0.1% Tween-20加入PBS中，制备1× PBST洗涤缓冲液。
  2. 吸去贴壁细胞的培养基，并在摇床上用PBS于室温下短暂洗涤一次。
  3. 吸去PBS，每孔加入500 µL冰甲醇（24孔板），于-20 °C过夜固定细胞。
  4. 去除甲醇，并在摇床上用PBS于室温下每次10分钟，共洗涤3次。
  5. 用含5% BSA的PBS溶液500 µL，在摇床上室温封闭细胞1–2小时。
  6. 用封闭液将一抗按1:200比例稀释。
  7. 每孔加入300 µL一抗溶液，在摇床上4 °C避光孵育过夜。
  8. 过夜孵育后，在摇床上用PBST于室温下每次10分钟，共洗涤3次。
  9. 用封闭液将二抗按1:1000比例稀释，制备二抗溶液。
  10. 每孔加入300 µL二抗溶液，在摇床上室温避光孵育1小时。
  11. 吸去二抗溶液，并在摇床上用PBST于室温下每次10分钟，共洗涤3次。
  12. 加入300 µL浓度为1 µg/mL的DAPI溶液孵育3–5分钟，然后用PBST洗涤两次。
  13. 吸去PBST后，加入适量PBS，用于荧光显微镜下拍照。

8. 蛋白质印迹分析

  1. 通过将 0.1% Tween-20 加入 Tris 缓冲盐水（TBS）中，制备 1x TBST 洗涤缓冲液。
  2. 根据制造商说明书，使用商用试剂盒制备 SDS-PAGE 电泳缓冲液和 Western 转膜缓冲液。
  3. 将总细胞蛋白（40 µg）在 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上进行分离，并在 SDS-PAGE 电泳缓冲液中以 15 mA 恒定电流电泳约 2 小时。
  4. 在低温条件下，以 300 mA 恒定电流将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 2 小时。
    注意：运行时间和转膜时间可能因所用设备以及凝胶类型和浓度的不同而有所变化。
  5. 在摇床上，用含 3% BSA 的 TBST 溶液室温封闭膜 1 小时。
  6. 在摇床上，加入一抗溶液（1:1000 稀释），4 °C 过夜孵育。
  7. 过夜孵育后，在摇床上用 TBST 室温洗涤印迹膜 3 次，每次 15 分钟。
  8. 在摇床上，加入二抗溶液（1:2000 稀释），室温孵育 2 小时。
  9. 弃去二抗溶液，在摇床上用 TBST 室温洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。
  10. 使用化学发光试剂显色，随后进行自显影检测免疫反应条带。以 β-actin 作为上样对照。

9. 吲哚菁绿摄取

  1. 在DMSO中配制200 mg/mL的吲哚菁绿储备液。
  2. 将吲哚菁绿溶液加入III期分化培养基中，配制成终浓度为1 mg/mL的工作液。
  3. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1–2小时。
  4. 吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次。
  5. 在显微镜下拍照。

10. 过碘酸-雪夫（PAS）染色和苏木精-伊红（H&E）染色

  1. 吸弃贴壁细胞的培养基，并用 PBS 短暂洗涤两次。
  2. 进行细胞固定时，吸弃 PBS，加入预冷的甲醇，在 -20 °C 下孵育过夜。
  3. 采用 PAS 染色法观察糖原储存情况，并使用试剂盒按照制造商说明书进行 H & E 染色以观察双核细胞。
  4. 使用荧光显微镜拍摄图像。

11. CYP 活性检测

  1. 根据制造商的说明，使用市售的基于细胞的检测方法（P450-Glo Assays）测定CYP450活性。
  2. 进行三次独立重复实验。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。

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结果

人胚胎干细胞向肝样细胞分化的示意图及各分化阶段的代表性明场图像见图1。在第I阶段，加入Activin A和CHIR99021处理3天，诱导干细胞形成内胚层细胞。在第II阶段，内胚层细胞经分化培养基处理5天后，分化为肝前体细胞。在第III阶段，早期肝细胞在HGF和OSM存在下培养10天后进一步成熟并分化为肝样细胞（图1A）。在分化的最终阶段，细胞呈现出典型的肝细胞表型（细胞呈多边形，分布均匀且规则）（图1B）。

为进一步确认肝细胞分化，采用RT-qPCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测内胚层细胞、肝祖细胞以及成熟肝细胞的标志物（图2）。分化的细胞在各个阶段均表现出较高的分化相关基因和蛋白表达水平，例如第3天内胚层标志物SOX17（89.7±0.8%），第8天肝祖细胞标志物HNF4α（81.3±2.9%），第14天AFP（86.6±0.3%），以及第...

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讨论

本文介绍一种分三阶段诱导hESCs 生成HLCs的逐步方法。第一阶段使用Activin A和CHIR99021将hESCs分化为定型内胚层（DE）；第二阶段使用KO-DMEM和DMSO将DE进一步分化为肝前体细胞；第三阶段使用HZM培养基联合HGF、OSM及氢化可的松21-半琥珀酸钠盐，将肝前体细胞继续分化为肝样细胞（HLCs）。

使用本方案时需考虑以下关键步骤。细胞的初始分化密度以及培养基更换的准确时机是成功分化的关键因素。开始分化时，必须确保初始接种密度适当，细胞汇合度约为30-40%，此时细胞刚刚开始相互接触，且在视野下细胞间隙均匀分布呈网状结构。在分化过程中，必须在规定时间精确更换相应的分化培养基，尤其是在第一阶段以及每个更换阶段的关键时刻，以确保细胞以模拟胚胎发育过程的模式和阶段进行分化。

将人胚胎干细胞（hESCs）分化为定型内胚层（DE）的第一阶段尤为重要。在分化第一阶段，通常会有大量细胞脱离并漂浮起来，此阶段是细胞命运决定的关键时期，但此时细胞仍保留增殖能力。因此，第一阶段结束时，细胞汇合度可达约90...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（项目编号：81870432 和 81570567，授予 X.L.Z.；项目编号：81571994，授予 P.N.S.）；中国广东省自然科学基金（项目编号：2020A1515010054，授予 P.N.S.）；李嘉诚汕头大学基金会（项目编号：L1111 2008，授予 P.N.S.）的资助。我们谨向汕头大学医学院林 Stanley 教授致以诚挚感谢，感谢其提供的有益建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇SigmaM7522用于肝祖细胞分化
488标记山羊抗小鼠IgGZSGB-BIOZF-0512用于免疫荧光，二抗
488标记山羊抗兔IgGZSGB-BIOZF-0516用于免疫荧光，二抗
AccutaseStem Cell Technologies7920用于细胞传代
Activin ApeproTech120-14E用于定型内胚层形成
抗-白蛋白（ALB）Sigma-AldrichA6684用于免疫荧光和Western blot，一抗
抗-人Oct4AbcamAb19587用于免疫荧光，一抗
抗-α-甲胎蛋白（AFP）Sigma-AldrichA8452用于免疫荧光和Western blot，一抗
抗-SOX17Abcamab224637用于免疫荧光，一抗
抗-肝细胞核因子4α（HNF4α）Sigma-AldrichSAB1412164用于免疫荧光，一抗
B-27添加剂Gibco17504-044用于定型内胚层形成
BSABeyotimeST023-200g用于细胞封闭
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046用于定型内胚层形成
DAPIBeyotimeC1006用于细胞核染色
DEPC水BeyotimeR0021用于RNA溶解
DM3189MCEHY-12071用于定型内胚层形成
DMEM/F12Gibco11320-033用于细胞培养
DMSOSigma-AldrichD5879用于肝祖细胞分化
DPBSGibco14190-144用于细胞培养
GlutaMAXGibco35050-061用于肝祖细胞分化
H&E染色试剂盒BeyotimeC0105S用于H&E染色
肝细胞生长因子（HGF）peproTech100-39用于肝细胞分化
HepatoZYME-SFM（HZM）Gibco17705-021用于肝细胞分化
氢化可的松-21-半琥珀酸酯Sigma-AldrichH4881用于肝细胞分化
吲哚菁绿Sangon BiotechA606326用于吲哚菁绿染色
Knock Out DMEMGibco10829-018用于肝祖细胞分化
Knock Out SR多物种GibcoA31815-02用于肝祖细胞分化
Matrigel hESC认证级Corning354277用于细胞培养
MEM非必需氨基酸（NeAA）Gibco11140-050用于肝祖细胞分化
mTesR 5X添加剂Stem Cell Technologies85852用于细胞培养
mTesR基础培养基Stem Cell Technologies85851用于细胞培养
Oncostatin（OSM）peproTech300-10用于肝细胞分化
P450 - CYP3A4（Luciferin - PFBE）PromegaV8901用于CYP450活性检测
PAS染色试剂盒SolarbioG1281用于PAS染色
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Gibco15140-122用于细胞分化
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgGZSGB-BIOZB-2305用于Western blot，二抗
Western blot一抗稀释缓冲液 BeyotimeP0256用于一抗稀释
ReverTraAce qPCR RT试剂盒TOYOBOFSQ-101用于cDNA合成
RNAiso PlusTaKaRa9109用于RNA提取
RPMI 1640Gibco11875093用于定型内胚层形成
脱脂奶粉Sangon BiotechA600669用于二抗配制
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742用于RT-PCR分析
Torin2MCEHY-13002用于定型内胚层形成
TweenSigma-AldrichWXBB7485V用于洗涤缓冲液配制

参考文献

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肝样细胞定向分化定型内胚层肝祖细胞Activin ACHIR99021阶段式分化CYP3A4 活性疾病建模
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