本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin A和CHIR99021。
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方法文章
一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由人胚胎干细胞（hESCs）衍生的肝细胞样细胞（HLCs）在疾病建模和药物筛选应用方面具有广阔前景。本文提供了一种高效且可重复的hESCs向功能性HLCs分化的实验方法。内胚层谱系的建立是向HLCs分化过程中的关键步骤。本方法通过在hESCs向定型内胚层（DE）分化阶段持续添加Activin A和CHIR99021，调控关键信号通路，随后依次生成肝前体细胞，最终在完全明确的试剂条件下，分阶段获得具有典型肝细胞形态的HLCs。该方法所获得的hESC来源HLCs表达各阶段特异性标志物（包括白蛋白、HNF4α核受体和牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）），并表现出成熟且功能性肝细胞的特有特征（包括吲哚菁绿染色、糖原储存、苏木精-伊红染色以及CYP3A活性），可为肝细胞样细胞在肝脏疾病研究中的应用提供有效平台。
引言
肝脏是一个高度代谢活跃的器官，具有多种功能，包括解毒、糖原储存以及蛋白质的分泌和合成1。多种病原体、药物及遗传因素均可引起肝脏的病理改变，影响其正常功能2,3。肝细胞作为肝脏的主要功能单位，在人工肝支持系统和药物毒性清除中发挥着重要作用。然而，在基于细胞的治疗以及肝脏疾病研究中，原代人肝细胞的来源十分有限。因此，开发新的功能性人肝细胞来源是再生医学领域的重要研究方向。自1998年人胚胎干细胞（hESCs）建立以来4，由于其具有强大的分化潜能（在适宜环境下可分化为多种组织）和高度的自我更新能力，hESCs被研究人员广泛视为理想的细胞来源，可用于生物人工肝、肝细胞移植乃至肝组织工程5。
目前，通过富集内胚层可显著提高肝细胞分化效率6。在干细胞向内胚层谱系分化的过程中，转化生长因子β（TGF-β） 信号通路和WNT信号通路的水平是内胚层形成阶段的关键调控节点。高水平激活TGF-β和WNT信号通路可促进内胚层的发育7,8。Activin A属于TGF-β....
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方案
1. 干细胞维持
注意：以下所述的细胞维持方案适用于以贴壁单层培养的 hES03 细胞系。本论文中所有后续方案的操作均应在生物安全柜中进行。
- 通过将5倍浓缩的补充培养基稀释至mTesR基础培养基中，制备1倍mTesR干细胞培养基。
- 在冰上将5 mL hESC级Matrigel与5 mL DMEM/F12混合，制备30倍hESC级Matrigel储存液。于-20 °C保存。
- 取33.3 µL 30倍hESC级Matrigel，用1 mL DMEM/F12稀释，制备1倍hESC级Matrigel工作液。
- 提前在4 °C条件下，用每孔1 mL的1倍hESC级Matrigel溶液包被无菌6孔组织培养板，过夜孵育。使用前于室温（RT）放置至少30分钟。
- 将冻存的hESC置于37 °C水浴中静置解冻3分钟，不振摇。随后立即用移液器将细胞转移至含有4 mL预热至37 °C的mTesR培养基的15 mL离心管中，轻轻吹打混匀2次。
- 在室温下以200 ×g离心2分钟，沉淀hESC细胞。
- 吸除上清液，轻轻将细胞重悬于1 mL mTesR培养基中。
- 吸去培养板中的DMEM/F12溶液，将细胞以每2 mL mTesR培养基接种1 × 105个细胞的密度接种至6孔板的一个孔中....
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结果
人胚胎干细胞向肝样细胞分化的示意图及各分化阶段的代表性明场图像见图1。在第I阶段，加入Activin A和CHIR99021处理3天，诱导干细胞形成内胚层细胞。在第II阶段，内胚层细胞经分化培养基处理5天后，分化为肝前体细胞。在第III阶段，早期肝细胞在HGF和OSM存在下培养10天后进一步成熟并分化为肝样细胞（图1A）。在分化的最终阶段，细胞呈现出典型的肝细胞表型（细胞呈多边形，分布均匀且规则）（图1B）。
为进一步确认肝细胞分化，采用RT-qPCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测内胚层细胞、肝祖细胞以及成熟肝细胞的标志物（图2）。分化的细胞在各个阶段均表现出较高的分化相关基因和蛋白表达水平，例如第3天内胚层标志物SOX17（89.7±0.8%），第8天肝祖细胞标志物HNF4α（81.3±2.9%），第14天AFP（86.6±0.3%），以及第.......
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讨论
本文介绍一种分三阶段诱导hESCs 生成HLCs的逐步方法。第一阶段使用Activin A和CHIR99021将hESCs分化为定型内胚层（DE）；第二阶段使用KO-DMEM和DMSO将DE进一步分化为肝前体细胞；第三阶段使用HZM培养基联合HGF、OSM及氢化可的松21-半琥珀酸钠盐，将肝前体细胞继续分化为肝样细胞（HLCs）。
使用本方案时需考虑以下关键步骤。细胞的初始分化密度以及培养基更换的准确时机是成功分化的关键因素。开始分化时，必须确保初始接种密度适当，细胞汇合度约为30-40%，此时细胞刚刚开始相互接触，且在视野下细胞间隙均匀分布呈网状结构。在分化过程中，必须在规定时间精确更换相应的分化培养基，尤其是在第一阶段以及每个更换阶段的关键时刻，以确保细胞以模拟胚胎发育过程的模式和阶段进行分化。
将人胚胎干细胞（hESCs）分化为定型内胚层（DE）的第一阶段尤为重要。在分化第一阶段，通常会有大量细胞脱离并漂浮起来，此阶段是细胞命运决定的关键时期，但此时细胞仍保留增殖能力。因此，第一阶段结束时，细胞汇合度可达约90.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号：81870432 和 81570567，授予 X.L.Z.；项目编号：81571994，授予 P.N.S.）；中国广东省自然科学基金（项目编号：2020A1515010054，授予 P.N.S.）；李嘉诚汕头大学基金会（项目编号：L1111 2008，授予 P.N.S.）的资助。我们谨向汕头大学医学院林 Stanley 教授致以诚挚感谢，感谢其提供的有益建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M7522 | 用于肝祖细胞分化 |
| 488标记山羊抗小鼠IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | 用于免疫荧光，二抗 |
| 488标记山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | 用于免疫荧光，二抗 |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | 用于细胞传代 |
| Activin A | peproTech | 120-14E | 用于定型内胚层形成 |
| 抗-白蛋白（ALB） | Sigma-Aldrich | A6684 | 用于免疫荧光和Western blot，一抗 |
| 抗-人Oct4 | Abcam | Ab19587 | 用于免疫荧光，一抗 |
| 抗-α-甲胎蛋白（AFP） | Sigma-Aldrich | A8452 | 用于免疫荧光和Western blot，一抗 |
| 抗-SOX17 | Abcam | ab224637 | 用于免疫荧光，一抗 |
| 抗-肝细胞核因子4α（HNF4α） | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | 用于免疫荧光，一抗 |
| B-27添加剂 | Gibco | 17504-044 | 用于定型内胚层形成 |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 用于细胞封闭 |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | 用于定型内胚层形成 |
| DAPI | Beyotime | C1006 | 用于细胞核染色 |
| DEPC水 | Beyotime | R0021 | 用于RNA溶解 |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | 用于定型内胚层形成 |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | 用于细胞培养 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | 用于肝祖细胞分化 |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | 用于细胞培养 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 用于肝祖细胞分化 |
| H&E染色试剂盒 | Beyotime | C0105S | 用于H&E染色 |
| 肝细胞生长因子（HGF） | peproTech | 100-39 | 用于肝细胞分化 |
| HepatoZYME-SFM（HZM） | Gibco | 17705-021 | 用于肝细胞分化 |
| 氢化可的松-21-半琥珀酸酯 | Sigma-Aldrich | H4881 | 用于肝细胞分化 |
| 吲哚菁绿 | Sangon Biotech | A606326 | 用于吲哚菁绿染色 |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | 用于肝祖细胞分化 |
| Knock Out SR多物种 | Gibco | A31815-02 | 用于肝祖细胞分化 |
| Matrigel hESC认证级 | Corning | 354277 | 用于细胞培养 |
| MEM非必需氨基酸（NeAA） | Gibco | 11140-050 | 用于肝祖细胞分化 |
| mTesR 5X添加剂 | Stem Cell Technologies | 85852 | 用于细胞培养 |
| mTesR基础培养基 | Stem Cell Technologies | 85851 | 用于细胞培养 |
| Oncostatin（OSM） | peproTech | 300-10 | 用于肝细胞分化 |
| P450 - CYP3A4（Luciferin - PFBE） | Promega | V8901 | 用于CYP450活性检测 |
| PAS染色试剂盒 | Solarbio | G1281 | 用于PAS染色 |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 15140-122 | 用于细胞分化 |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | 用于Western blot，二抗 |
| Western blot一抗稀释缓冲液 | Beyotime | P0256 | 用于一抗稀释 |
| ReverTraAce qPCR RT试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 | 用于cDNA合成 |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | 用于RNA提取 |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | 用于定型内胚层形成 |
| 脱脂奶粉 | Sangon Biotech | A600669 | 用于二抗配制 |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | 用于RT-PCR分析 |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | 用于定型内胚层形成 |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | 用于洗涤缓冲液配制 |
参考文献
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular....
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