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时空 在体 内 使用光纤共聚焦激光显微内镜成像眼部药物递送系统

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DOI：

10.3791/62685

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2021年9月27日

 ,  ,  , 
1Laboratory for Translational and Molecular Imaging, Cancer and Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School, 2School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 3Singapore National Eye Centre, 4Singapore Eye Research Institute, 5Material Science & Engineering, National University of Singapore

本文内容

摘要

我们提出了一种利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）无创研究结膜下注射后脂质体在眼部时空分布的实验方案。

摘要

结膜下注射是一种具有吸引力的给药途径，因其可通过巩膜直接进入眼内，从而绕过角膜和结膜等眼前段屏障。尽管已有部分研究描述了药物经结膜下注射后的治疗效果和药代动力学，但极少有研究评估药物或药物递送系统（DDS）在眼内的分布情况。而后者对于优化眼内药物递送系统的设计以及提高药物的生物利用度至关重要，以实现理想的药物眼内定位和作用持续时间（例如急性作用与长效维持）。本研究建立了利用光纤共聚焦激光显微内镜（CLM）在活体小鼠中实时定性研究荧光脂质体经结膜下注射后在眼部分布的方法。该技术设计用于 体内 在显微水平上对组织进行肉眼观察，这也是首次完整描述利用CLM成像方法研究结膜下注射后眼内可注射物质时空分布的研究。

引言

药物在活体系统中的血液清除率、组织分布和靶点占有率是理解药物 体内处置的关键要素。在临床前动物模型中，这些参数通常通过在给药后特定时间点频繁采集血液和组织样本进行评估。然而，这些操作通常具有侵入性，常涉及非存活性测量，并且需要较大的动物群体以满足统计学效能要求。这可能导致额外的成本和时间消耗，同时引发因动物使用过多而带来的伦理问题。因此，非侵入性成像技术正迅速成为生物分布研究中的重要环节。共聚焦激光显微内镜（CLM1,2）特别适用于眼部应用，可对活体动物眼部中药物的时间-空间分布进行高灵敏度、高分辨率的非侵入性成像1,3,4。

共焦激光显微镜（CLM）有望促进对眼用药物递送系统（DDS）的高效筛选，例如 脂质体，在对药物递送系统（DDS）和药物生物利用度进行全面定量之前，因其在调节理化和生物物理性质方面的灵活性而具有吸引力5,6,7,8,9,10,11 可包载多种治疗性货物，并控制药物释放的组织部位及作用持续时间。脂质体已用于眼部给药，以递送大分子药物，如单克隆抗体贝伐珠单抗（bevacizumab）12，以及环孢素等小分子13 和更昔洛韦14载药脂质体相较于非脂质体药物具有更长的生物半衰期和持久的治疗效果 "游离药物" 配方 然而，药物在眼组织中的分布通常是根据眼内液体成分（即血液、房水和玻璃体）中的药物浓度推断得出的15,16,17）。作为最初的 体内 负载药物的命运由纳米载体本身的性质决定，因此荧光脂质体的CLM成像可作为药物的替代指标，用于揭示组织靶向性 原位 组织滞留时间。此外，通过共聚焦激光显微镜（CLM）获得的递送可视化证据可为药物递送系统（DDS）的重新设计提供指导，评估药物的治疗效果，并可能预测不良生物学事件（例如，由于药物递送系统在组织中长时间非预期定位导致的组织毒性）。

本文详细介绍了一种利用双波段共聚焦激光显微（CLM）系统在活体小鼠中研究脂质体眼内生物分布的逐步操作流程。该特定CLM系统可实时检测双色荧光信号（采用488 nm绿色和660 nm红色激发激光），成像速率为每秒8帧。通过将检测探头直接置于小鼠眼部，本方案展示了在经静脉预注射2%伊文思蓝（EB）染料的小鼠中，经结膜下给药后绿色荧光脂质体的图像采集与分析过程。EB染料可在红色荧光通道中清晰显示血管化结构。我们展示了一项研究的代表性结果，该研究采用粒径为100 nm的中性脂质体，其由磷脂POPC（即1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱）构成，并掺入5%的荧光素标记磷脂Fl-DHPE（即N-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺），POPC与Fl-DHPE的比例为95%:5%（图1B）。CLM系统可通过EB染色所呈现的眼部组织边界，以15 µm轴向分辨率和3.30 µm横向分辨率清晰捕捉绿色荧光素标记的脂质体分布情况。

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方案

本文所述所有方法均已获得新加坡SingHealth机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。实验所用6-8周龄、体重18-20 g的雌性C57BL/6 J小鼠购自新加坡InVivos公司，并饲养于新加坡杜克-国大医学院（Duke-NUS Medical School）温度与光照可控的动物实验设施中。动物实验操作均遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科学与视觉研究中使用动物的指南声明。

注意：主流程的示意图见图2。

1. 对比剂的制备：伊文思蓝（EB）和脂质体

  1. 配制2% EB染料溶液：将1 g EB溶解于50 mL无菌生理盐水中。使用0.22 µm滤器过滤溶液，收集至1.5 mL无菌离心管中，室温保存备用。
  2. 制备绿色荧光脂质体：将POPC/Fl-DHPE（95:5）溶于氯仿/甲醇（2:1）中，加入100 mL圆底烧瓶。在40 °C下以150 rpm转速使用旋转蒸发仪蒸发1小时，维持真空度为0 mbar1，形成均匀的脂质薄膜。
    注意：在比较脂质体特性（如粒径、电荷、脂质饱和度、脂质链长度）对分布的影响时，应保持Fl-DHPE或其他荧光脂质的摩尔百分比恒定，以确保观察到的结果是由所测试的脂质体特性引起，而非由疏水性染料负载量的差异所致。
  3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）在40 °C下水合脂质膜，使终浓度达到26.3 mM荧光脂质体，形成多层囊泡（MLV）。将MLV转移至玻璃注射器中，手动挤出（使用孔径为0.08 µm的聚碳酸酯滤膜，反复挤出30次），以获得目标粒径为100 nm的脂质体。
    注意：水合温度必须高于脂质的相变温度。
  4. 通过0.22 µm无菌注射器滤膜过滤脂质体溶液。使用动态光散射系统测定脂质体的流体动力学直径（DH）。

2. 在活体小鼠中给予 EB 和脂质体

  1. 通过尾静脉向小鼠静脉注射EB（2.5 mg/kg），在结膜下注射前2小时进行。
  2. 对于结膜下注射，首先通过5%异氟烷对小鼠进行镇静 在诱导室中通过吸入麻醉，使小鼠达到适当的麻醉水平。将小鼠转移至鼻罩装置，并在整个实验过程中于加热垫上以2%–2.5%异氟烷维持镇静状态。
  3. 修剪待注射眼附近的胡须，并在眼球表面直接滴加一滴0.5%盐酸丙美卡因表面麻醉剂。
  4. 用10 µL玻璃注射器（带32 G针头）吸取荧光脂质体（Fl-DHPE：0.78 mg/kg），并在注射前排出注射器内所有气泡。
    注意：小鼠结膜下间隙最多可容纳 20 µL 注射液18,19.
  5. 使用镊子轻轻提起结膜，缓慢注入结膜下间隙（图1A）。缓慢撤出针头，以防止回流。确保形成一个可见的、充满荧光脂质体的皮丘（bleb）。图1C).
  6. 注射后在小鼠眼部滴加一滴1%夫西地酸抗生素，并监测小鼠直至其恢复意识。

3. CLM 设置

  1. 开启CLM系统，并确保扫描探头的连接器和远端尖端均清洁。
  2. 按照制造商的说明，使用光纤连接器清洁器清洁扫描探头的连接器。
    1. 按压光纤连接器清洁器上的棘轮（通常为彩色）以露出清洁带。
    2. 将连接器与清洁带接触，并在保持接触的同时沿清洁带滑动连接器。
  3. 通过将探头尖端浸入制造商提供的清洗液，随后浸入冲洗液中，清洁探头的远端尖端（也称为扫描尖端）。如果尖端非常脏，可使用棉签进行更彻底的清洁。
  4. 将探头连接至CLM系统。在此时选择视野（FOV）以及采集文件的存储位置。
    注意：在此步骤中调节激光强度，以确保Fl-DHPE的荧光检测处于线性范围。为便于在不同时间点获取的图像之间进行比较，激光强度应保持一致。
  5. 按照说明让系统预热15分钟，并使用校准套件根据制造商的说明对系统进行校准。
    注意：校准套件中每种激光对应三个小瓶，分别含有以下溶液：清洗液、冲洗液以及用于内部校准的488/660 nm荧光染料溶液。系统会提示校准步骤，请依次遵循操作。
    1. 将探头尖端依次浸入清洗液瓶和冲洗液瓶（每个小瓶中停留5秒），然后将其置于空气中进行两个通道的背景信号记录。
      注意：此步骤至关重要，因为它可归一化探头中不同光纤的背景值，确保图像均匀性。
    2. 将探头尖端依次浸入清洗液瓶和冲洗液瓶（每个小瓶中停留5秒），然后将尖端浸入488 nm荧光染料瓶中5秒，以归一化探头中不同光纤的信号值。
    3. 将探头尖端依次浸入清洗液瓶和冲洗液瓶（每个小瓶中停留5秒），然后将尖端浸入冲洗液瓶中，直至3.5.2步骤中记录的荧光信号消失。随后将尖端浸入660 nm荧光染料瓶中，以归一化探头中不同光纤的信号值。
      注意：请按顺序完成所有校准步骤，以实现正确的校准并获得最佳图像质量。
  6. 完成探头校准后，检查探头的背景值是否尽可能低。对于所使用的CLM系统，应将背景值保持在100以下。若背景值高于100（或用户定义的阈值），或探头看起来较脏，应使用棉签反复清洁探头并重新校准。此操作旨在确保背景噪声维持在相近水平。
    注意：定义最大背景值（例如步骤3.6中所述的100）非常重要，以确保探头状态一致，从而实现不同时间点所获取图像之间的准确定量比较。该数值可能因系统和探头状态不同而有所差异。
  7. 开启动物体温控制器（ATC），将ATC调节至37 °C。用手术单覆盖加热垫，并将鼻罩固定在加热垫上。
    注意：必须使用带有加热垫的ATC，以确保在整个成像过程中动物体温维持稳定。
  8. 将解剖显微镜的支架夹紧在桌面上以固定。在放置动物后，旋转并调节显微镜目镜，使操作者坐姿时能通过目镜舒适地观察小鼠眼部。
  9. 在诱导室中使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉。待小鼠无反应后将其转移至鼻罩，并在整个实验过程中于加热垫上维持2%–2.5%异氟烷以保持麻醉状态。
  10. 修剪小鼠的胡须，并向眼部滴加一滴0.5%盐酸丙氧麻黄碱麻醉液。
  11. 为确保眼部清洁，滴加数滴生理盐水冲洗眼表。
  12. 调节显微镜，使小鼠眼部在0.67倍放大倍率下直接聚焦。
    注意：务必使用生理盐水润滑眼睛。若在整个成像过程中未保持眼部润滑，眼睛可能变干，导致晶状体结晶。结果在CLM成像过程中，晶状体可能发出背景红色荧光。

4. 采用共焦激光显微镜对小鼠眼睛进行活体成像及图像采集

  1. 打开激光器，将探头置于眼睛上，开始记录采集，以观察眼睛在图3所示眼图区域中的荧光信号。
    注意：像握笔一样握住探头，使探头远端直接对准待成像区域。
  2. 当所有区域均已被标记并标注后，停止记录。采集文件将自动保存至步骤3.4中选择的文件位置。
    注意：文件将以视频格式保存，可导出为单张图像。请根据眼图对标记进行标注，以准确知晓记录时每一帧画面中探头所处的具体位置。

5. 图像分析

  1. 使用相同的 CLM 采集软件导出图像采集文件以进行进一步分析。单击 文件 | 导出，并选择要导出的格式。Mkt 格式文件可在 CLM 查看软件中调整查找表（LUT），并进一步导出为图像文件格式。
  2. 为准确比较荧光强度，在导出所有图像文件时，应对每个通道使用相同的 LUT 设置。
    注意：选择 LUT 的最小值和最大值阈值时，应参考对照小鼠（未注射脂质体）的阈值，以尽量减少背景荧光信号。
  3. 在合适的图像处理软件或免费程序（例如 ImageJ）中打开图像。绘制感兴趣区域（ROI）。
    注意：此处的 ROI 指在图像处理程序中定义的感兴趣区域。大多数情况下，ROI 为整个扫描图像。然而，在对角膜缘成像时，探头无法单独获取角膜缘区域的图像，因此必须绘制 ROI 以“量化”角膜缘区域的荧光强度，如 图 4 所示。为保持一致性，所有图像应使用相同的 ROI。
  4. 测量并记录绿色荧光的 ROI 数值。将数值输入电子表格中，并整理 ROI 的平均值和荧光强度（a.u.）数值。

6. 组织学评估

  1. 采用当地IACUC批准的方法处死 小鼠。 
  2. 摘除眼球，并将眼球置于1 mL的4%甲醛或10%福尔马林溶液中固定过夜。
  3. 修剪多余的脂肪组织，将眼球包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在-80 °C超低温冰箱中冷冻至少一天。
  4. 在恒温为-20 °C的冷冻切片机中切出5 µm厚的切片，将切片转移至多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。
    注：组织学可作为DDS分布的额外验证手段。然而，该方法需要额外的优化步骤、专业技术，并需牺牲动物，而本研究旨在通过使用CLM减少动物使用。

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结果

本方案展示了共聚焦激光显微镜（CLM）在评估经结膜下注射给予的绿色荧光脂质体眼部时空分布方面的应用价值。为了利用CLM系统的双色检测能力（激发波长为488 nm和660 nm），将用于注射的100 nm中性POPC脂质体掺入5%的Fl-DHPE（其组成及表征数据见图1B），同时经静脉注射伊文思蓝（EB）以标记眼部解剖结构。由于巩膜上层存在一层较薄的巩膜外层和结膜组织，二者均富含血管，因此EB可使巩膜区域呈现红色（图4A，标记为S）；而角膜无血管分布（图4A，标记为C），不会被染色，呈现黑色。这使得在荧光成像过程中能够清晰区分这两个区域。

代表性结果来自一项持续7天的分布研究（n = 4只小鼠）。由于第1天和第3天图像中的荧光强度较高（图5B），为便于观察，已对像素强度进行了降低处理。荧光强度的实际数值反映在图表中（

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讨论

结果表明，共聚焦激光显微镜（CLM）为成像脂质体在眼部的分布提供了一种简单且可行的方法。我们先前已证明可利用CLM随时间表征不同脂质体制剂在小鼠眼内的定位情况1。对于非侵入性应用，CLM能够对同一动物的眼前表面进行实时成像，从而深入了解脂质体在眼内的分布情况。这使得CLM适用于在进行更全面的定量分析之前，对纳米载体/药物递送系统（DDS）进行预筛。鉴于不同DDS具有独特的理化性质，采用传统组织学方法来表征其在眼部亚区室中的分布极具挑战性。后者需要对整个眼球进行 exhaustive 切片，并通过荧光显微镜对各个切片进行单独成像，才能整体评估DDS的清除情况。

与共聚焦激光显微（CLM）图像结果一致（图5B、C），在注射脂质体后第1天采集的眼组织中，通过组织学方法可在角膜、角膜缘和巩膜区域观察到绿色荧光信号（图7）。值得注意的是，CLM的检测灵敏度优于荧光显微镜——在巩膜区域的脂质体可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由南洋理工大学-西北大学纳米医学研究所（NNIN）提供的资助（授予SV）以及新加坡国家研究基金会资助AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2部分支持，并由中国台湾星集团（A*STAR）管理的新加坡卫生与生物医学科学（HBMS）产业对接基金前期布局（IAF-PP）资助H18/01/a0/018支持（授予AMC）。感谢杜克-国大转化与分子影像学实验室（LTMI）成员在研究的后勤协调、实施、设备培训方面提供的协助。特别感谢Wisna Novera女士在编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.08 µm 聚碳酸酯滤膜Whatman, 美国110604
0.22 µm 注射器滤器Fisherbrand, 爱尔兰09-720-3
0.5% 盐酸丙美卡因无菌眼用溶液Alcon, 新加坡
10 µL 玻璃注射器Hamilton, 美国65460-06
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）Avanti, 美国850457
32 G 针头（Hamilton, 0.5” PT4）Hamilton, 美国7803-04
带加热板的动物体温控制器（15 cm × 20 cm）WPI, 美国ATC 2000 & 61800
Cellvizio 双波段系统，S1500 探头及 Quantikit（第 3.5 步校准套件）Mauna Kea Technologies, 法国探头直径：1.5 mm，视场：600 µm × 500 µm，轴向分辨率：15 µm，横向分辨率：3.3 µm
氯仿Sigma Aldrich, 美国472476
Dumont #5 镊子，DumostarWPI, 美国50023311 cm，直头，尖端尺寸：0.1 mm × 0.06 mm
伊文思蓝Sigma Aldrich, 美国E2129
夫西地酸滴眼液LEO Pharma, 丹麦
ImageJ美国国立卫生研究院，美国https://imagej.nih.gov/ij/
异氟烷Piramal, 美国
Malvern Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical, 英国
甲醇Sigma Aldrich, 美国179337
小型挤出器（Mini Extruder）Avanti, 美国610020
N-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（三乙基铵盐）（FL-DHPE）Invitrogen, 美国F362
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco, 美国10010023
带台夹支架的体视显微镜系统Olympus, 东京, 日本SZ51 & SZ2-STU3

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