使用光纤共聚焦激光微内窥镜检查的眼部药物输送系统的时空 体内 成像

血液清除率，组织分布和药物在生命系统中的目标占用是了解 体内 药物处置的支柱。在临床前动物模型中，这些参数通常通过在药物给药后的特定时间点频繁的血液和组织采样来评估。然而，这些程序通常是侵入性的，通常包括非生存测量，并且需要大型动物队列进行统计。可能会产生额外的成本和时间，以及过度使用动物的道德问题。因此，非侵入性成像正迅速成为生物分布研究中不可或缺的一步。共聚焦激光微内窥镜检查（^CLM1，2）非常适合眼部应用，以高灵敏度和高分辨率对活体动物眼中治疗药物的时空分布进行非侵入性成像^1，3，4。

CLM有可能在全面定量DDS和药物生物利用度之前促进对眼部药物递送系统（DDS）（如脂质体）的稳健筛选。脂质体因其在调整其物理化学和生物物理性质^5，6，^{7，8，9，10，11}以封装各种治疗货物和控制药物释放的组织部位和作用持续时间方面的灵活性而具有吸引力。脂质体已用于眼部应用中的大分子递送，例如单克隆抗体贝伐珠单抗¹²，以及小分子如环孢菌素¹³和更昔洛韦¹⁴。与非脂质体"游离药物"制剂相比，药物负载的脂质体具有更长的生物学半衰期和更长的治疗效果。然而，眼组织中的药物分布通常由眼睛液体成分（即血液、房水和玻璃体房）中的药物浓度推断^15，16，17。由于装载的药物货物的初始体内命运由纳米载体本身的性质定义，因此荧光脂质体的CLM成像可以作为药物的替代物，以揭示组织靶向和原位组织停留时间。此外，使用CLM递送的视觉证据可以指导DDS的重新设计，评估药物的治疗益处，甚至可能预测不良生物事件（例如，由于DDS长时间不期望定位而导致的组织毒性）。

本文详细介绍了如何研究具有双波段CLM系统的活小鼠中脂质体的眼部生物分布的分步程序。这种特定的CLM系统可以实时检测双色荧光（在488 nm和660 nm处使用绿色和红色激发激光器），频率为8帧/秒。通过将检测探针物理放置在眼睛上，该协议演示了在用2%Evans Blue（EB）染料预先注射（IV）的小鼠结膜下给药时对绿色荧光脂质体的图像采集和分析。EB染料有助于可视化红色荧光通道中的血管化结构。我们展示了一项研究的代表性结果，该研究评估了由磷脂POPC（即1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱）组成的100nm中性脂质体，并掺杂荧光素标记的磷脂Fl-DHPE（即 N-（荧光素-5-硫代氨基甲酰基）-1，2-二己基癸酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺）的比例为95%POPC:5%Fl-DHPE（图1B).CLM能够通过划定EB染色的眼组织边界，以15μm轴向和3.30μm横向分辨率捕获绿色荧光素标记的脂质体。

此处描述的所有方法均已获得新加坡兴业医疗机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。从新加坡InVivos获得雌性C57BL / 6 J小鼠（6-8周龄;18-20g），并饲养在新加坡杜克 - 新加坡国立大学医学院的温度和光控动物馆中。根据视觉和眼科研究协会（ARVO）声明中关于在眼科和视觉研究中使用动物的指南对动物进行治疗。

注: 图 2 显示了突出显示主要过程的流程图。

1.造影剂的制备:埃文斯蓝（EB）和脂质体

1. 对于2%EB染料溶液，将1gEB溶解在50mL无菌盐水中。使用0.22μm过滤器过滤溶液到1.5mL无菌管中，并将其储存在室温下以备后用。
2. 对于绿色荧光脂质体，将 POPC/Fl-DHPE （95:5）、氯仿/甲醇 （2:1） 加入 100 mL 圆底烧瓶中。使用旋转蒸发器在40°C下以150rpm的速度运行1小时，真空保持在0 ^mbar1 以形成薄脂膜。
   注意:当比较脂质体性质（例如，大小，电荷，脂质饱和度，脂质链长度）对分布的影响时，保持固定百分比的Fl-DHPE或其他荧光脂质，以确认观察到的结果是由于所测试的性质的影响，而不是对大疏水染料的可变负载。
3. 在40°C下用磷酸盐缓冲盐水（达到26.3mM的荧光脂质体）水合脂膜以形成多层状囊泡（MLV）。将MLV装入玻璃注射器进行手动挤出（使用0.08μm孔径聚碳酸酯过滤器30次），以达到所需的100nm尺寸。
   注意:水合作用的温度必须高于脂质的转变温度。
4. 通过使脂质体通过0.22μm无菌注射器过滤器来过滤脂质体。使用动态光散射系统确认脂质体的流体动力学直径（_DH）。

2. 活小鼠EB和脂质体的给药

1. 通过尾静脉（2.5mg / kg）向小鼠注射EB IV（静脉注射），结膜下注射前2小时。
2. 对于结膜下注射，首先，在诱导室中通过吸入使用5%异氟醚镇静小鼠，以实现足够的麻醉平面。将小鼠转移到鼻锥中，并在整个过程中在加热垫上将镇静剂保持在异氟醚的2%-2.5%。
3. 修剪眼睛附近的晶须，直接在眼睛上滴一滴局部麻醉剂0.5%盐酸马赛卡因溶液。
4. 在注射前将10μL玻璃注射器（32 G针头）与荧光脂质体（Fl-DHPE:0.78mg / kg）一起加载，并消除注射器中的所有气泡。
   注意:最多20μL注射液可以容纳在小鼠的结膜下空间^18，19。
5. 使用镊子，稍微抬起结膜，缓慢注入结膜下空间（图1A）。慢慢抽出针头，防止回流。确保形成充满荧光脂质体的可见疱（图1C）。
6. 注射后在眼睛上滴一滴抗生素1%夫西地酸，并监测小鼠直到它恢复意识。

3. CLM 设置

1. 打开CLM系统，并确保连接器和扫描探头的远端都干净。
2. 按照制造商的说明，使用光学连接器清洁剂清洁扫描探头的连接器。
   1. 按下光学连接器清洁剂的拉轮（通常为彩色）以显示清洁带。
   2. 将连接器与清洁带接触的位置，并在保持接触的同时沿碳带滑动接头。
3. 通过将探头的远端尖端（也称为扫描尖端）浸入清洁溶液中，然后清洁制造商提供的冲洗溶液。如果尖端非常脏，也可以使用棉质尖端涂抹器进行更彻底的清洁。
4. 将探头连接到 CLM 系统。此时选择视场 （FOV） 和采集文件的位置。
   注意:在此步骤中调整激光强度，以确保Fl-DHPE的荧光检测在线性范围内。激光强度应保持一致，以便比较在不同时间点拍摄的图像。
5. 按照说明让系统预热 15 分钟，然后使用校准套件根据制造商的说明校准系统。
   注意:在校准套件中，每个激光器有三个样品瓶，其中包含以下溶液:清洁溶液，冲洗溶液和用于内部校准的荧光团488/660nm溶液。校准步骤由系统提示，并相应地遵循。
   1. 将尖端浸入清洁小瓶中，然后冲洗小瓶（每个小瓶中5秒）。将其放在空中，以便为两个通道进行后台录制。
      注意:此步骤非常关键，因为它可以归一化探头不同光纤的背景值并确保图像均匀性。
   2. 将尖端浸入清洁小瓶中，然后冲洗小瓶（每个小瓶中5秒）。将尖端浸入荧光团488nm小瓶中5秒钟，以归一化来自探针中不同光纤的信号值。
   3. 将尖端浸入清洁小瓶中，然后冲洗小瓶（每个小瓶中5秒）。将尖端浸入冲洗小瓶中，直到荧光信号记录在3.5.2中。消失。将尖端浸入荧光团660nm小瓶中，以归一化来自探针中不同光纤的信号值。
      注:请遵循所有校准步骤，以实现正确的校准和最佳图像质量。
6. 校准探头后，检查以确保探头的背景值尽可能低。对于使用的 CLM 系统，请将背景值保持在 100 以下。使用棉签涂刀对探头进行重复清洁，如果值高于100/定义的用户值或探头看起来很脏，则进行校准。这是为了确保背景噪音保持在相同的值附近。
   注意:定义最大背景值（例如，步骤 3.6 中所述的 100）以确保探测条件相似非常重要。这将允许对在不同时间点拍摄的图像进行适当的定量比较。该值在不同的系统和探头条件下可能有所不同。
7. 打开动物温度控制器 （ATC）。将 ATC 调节至 37 °C。 用手术悬垂物盖住加热垫，并将鼻锥固定在加热垫上。
   注意:需要带有加热垫的ATC，以确保动物在整个成像过程中保持温暖。
8. 将解剖显微镜的支架夹在桌面上以固定它。当用户坐下时，旋转并调整显微镜的目镜，以符合人体工程学的方式通过目镜查看鼠标眼睛（放置动物后进行调整）。
9. 在诱导室中使用5%异氟醚镇静小鼠。一旦动物无反应，将小鼠转移到鼻锥，并在整个过程中在加热垫上保持镇静剂在2%-2.5%异氟醚。
10. 修剪小鼠的胡须，并将一滴麻醉剂0.5%盐酸马替卡因溶液滴入眼睛。
11. 为确保眼睛清洁，滴几滴生理盐水清洗眼表。
12. 调整显微镜，使鼠标眼睛以0.67倍放大倍率直接聚焦。
    注意:确保用生理盐水润滑眼睛。如果眼睛在整个成像过程中没有润滑，它们可能会变干，导致晶状体结晶。因此，在CLM成像过程中，透镜可以发出背景红色荧光。

4. 使用CLM和采集对小鼠眼睛进行实时成像

1. 打开激光，将探头放在眼睛上，然后开始记录采集，以观察眼睛图上指示的区域的荧光， 如图3所示。
   注意:像笔一样握住探头，探头的远端直接放在要成像的区域上。
2. 标记和标记所有区域后停止录制。采集文件将自动保存在步骤 3.4 中选择的文件位置。
   注意:该文件将另存为视频文件，可以导出为单个图像。根据眼图标记标志，以确切地知道探头在录制完成的确切帧中的位置。

5. 图像分析

1. 使用相同的CLM采集软件，导出图像采集文件以进行进一步分析。单击 "文件|导出 并选择要导出到的格式。Mkt 格式文件将允许调整查找表 （LUT） 并使用 CLM 查看器软件进一步导出为图像文件格式。
2. 为了准确比较荧光强度，请在导出所有图像文件时使用为每个通道调整的相同LUT。
   注意:选择相对于对照小鼠（未注射脂质体）的最小和最大LUT阈值，以最小化背景荧光读数。
3. 在适当的图像处理软件/免费软件程序（例如，ImageJ）中打开图像。绘制感兴趣的区域 （ROI）。
   注意:此处的 ROI 是指处理程序中感兴趣的区域。在大多数情况下，ROI将是扫描的整个图像。然而，在对边缘进行成像的情况下，探头不能单独获得边缘的图像。因此，必须绘制ROI以"量化"边缘区域的荧光，如图 4所示。要保持 ROI 的一致性，请在所有映像上使用相同的 ROI。
4. 测量并记录绿色荧光的ROI值。在电子表格中输入值。将 ROI 的平均值和荧光强度 （a.u.） 值制成表格。

6. 组织学评估

1. 使用当地IACUC批准的方法对小鼠实施安乐死。
2. 对眼睛进行去核，并将眼睛固定在1 mL 4%甲醛或10%福尔马林溶液中过夜。
3. 修剪多余的脂肪，将眼睛嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，并将其在-80°C冰箱中冷冻至少一天。
4. 在低温恒温器中切割厚度为 5 μm 的切片，切割温度保持在 20 °C。 将切片转移到聚-L-赖氨酸涂层的显微镜载玻片上。
   注:组织学可以作为DDS分布的额外验证。然而，它需要额外的优化，技术专长和动物牺牲，该研究旨在通过使用CLM来减少这些。

该协议证明了CLM在评估通过结膜下注射给药的绿色荧光脂质体的时空眼部分布方面的效用。为了利用CLM系统的双色能力（488 nm和660 nm激发波长），将100 nm中性POPC脂质体掺杂5%Fl-DHPE（组成和表征数据如图 1B所示），并将EB注射IV以识别眼睛中的特征。存在一层薄薄的上睑和结膜，它们都是高度血管化的，允许巩膜区域用EB染成红色（图4A，标记为S），而不含任何脉管系统的角膜（图4A，标记为C）不会被染色并显示为黑色。这使得在荧光成像过程中两个区域之间能够产生明显的差异。

代表性结果来自一项跨越7天的分布研究（n = 4只小鼠）。由于第1天和第3天图像中的荧光强度很高（图5B），像素强度降低以获得更好的可视化效果。荧光强度的实际值反映在图表中（图6）。为了确保从图像中观察到的是来自脂质体的荧光而不是可能已从脂质体中脱落的游离染料，包括注射荧光素（Fl）染料的对照小鼠（图5A）。

随着时间的推移，在边缘和巩膜区域都观察到脂质体的减少（通过代表绿色荧光信号的减少）。当脂质体从颞叶注射到结膜下空间的上部区域（图3）时，它们自然地被放置在颞膜和上巩膜的顶部（图4B），然后到达结膜下空间的其他区域。在注射后的第1天，在巩膜中检测到的荧光比颞叶和上缘区域高出6倍（图6）。到第3天和第7天，巩膜中观察到脂质体显着减少（从第1天到第3天（第1天→3）为60%，从第3天到第7天（第3天→7天）为88%），在上部区域，第1→3 天和第3→7 天分别减少了66%和93%， p分别<0.001）（图6）。这种减少归因于通过结膜和上睑处发现的血液和/或淋巴管的眼部清除机制。脂质体也可能通过巩膜扩散并被脉络膜清除，脉络膜也是高度血管化的。

发现脂质体在边缘以较慢的方式清除。对于颞叶边缘和上缘，注射后第1天至第3天的荧光信号变化不显着，表明中性脂质体优先于边缘区域，特别是角膜外围（图5B）。边缘区域的脂质体从第3天开始清除（d3→7:时间性为-89%（p<0.01），-53%为上层（p <0.05））。到第7天，超过90%的脂质体从所有边缘区域清除（p <0.05），除了上边缘1S，其中50%的脂质体仍然可以被检测到（p >0.05）。这表明，与其他区域相比，中性脂质体在上缘/角膜边缘的停留时间要高得多（图5和图6）。由于它们与注射部位的距离，在所有时间点在鼻腔和下部区域检测到最低量的荧光（图6A，B）。

在先前报道的关于眼睛中脂质体清除率的更全面的研究中1，我们已经讨论了在结膜下注射后可以从眼部组织中清除脂质体的几种途径。虽然脂质体可以通过结膜、上睑和脉络膜的体循环和淋巴清除来清除，这些质质体是高度血管化的，但它们也可以通过巩膜的被动扩散到达更深的眼内组织。流体流动也可以通过小梁网或巩膜流出物运输脂质体，这可以使脂质体回到巩膜。通过撕裂消除也是可能的，注射部位的微小泄漏可能允许角膜通过被动扩散渗透。

图1:眼中脂质体的结膜下注射。 （A）绿色荧光脂质体和结膜下注射的图形表示。（B）用于眼部CLM成像的FL-DHPE掺杂脂质体制剂的组成和性质。（C）结膜下注射时形成水疱的绿色荧光脂质体。该图经Chaw S.Y.等人许可改编1。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2:眼部 CLM 手术时间表。请单击此处查看此图的大图。

图 3:CLM 扫描的眼图。 区域 1 是指边缘区域，而区域 2 是指巩膜区域。视频和图像从1T以逆时针方向拍摄，其次是2T以类似的逆时针方向拍摄。由于针头从2T向2S插入注射，因此感兴趣的区域主要是1T，1S，2T和2S。插入显示探头相对于鼠标眼睛的大小。该图经Chaw S.Y.等人许可改编1。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:图像分析。（A）ImageJ使用为边缘（L）和巩膜（S）（B）定义的兴趣区域（ROI）进行荧光标记脂质体的J分析，在边缘区域量化用于脂质体的存在。在边缘检测到的脂质体的可能位置是1）角膜边缘，2）边缘或3）巩膜边缘。该图经Chaw S.Y.等人许可改编1。请点击此处查看此图的放大版本。

图5:边缘和巩膜的对比分布。 对于（A）荧光素（Fl）对照，（B）100nm中性脂质体（POPC-100）的每个队列中一只代表性小鼠的边缘（1S:上，1N:鼻）和巩膜（2S:上，2N:鼻，2I:下，2T:时间）区域的对比分布（1S:上，1N:鼻腔，1I:下，1T:颞）和巩膜（2S:上，2N:猝）区域的对比分布。红色表示 EB 染色。比例尺 = 50 μm. （C） 将拍摄的图像组装在眼图上，以便更好地理解。该图经Chaw S.Y.等人许可改编1。请点击此处查看此图的放大版本。

图6:7天内巩膜（A）和边缘（B）区域100nm中性POPC脂质体的清除动力学（每组n = 4只小鼠）。 通过双因子方差分析比较平均荧光强度，并相对于前一个时间点进行多重比较;d1→3 和 d3→7;*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7:注射Fl-DHPE脂质体一天后小鼠眼睛横截面（5μm）的代表性组织学图像。 虚线表示可以观察到脂质体的位置，用绿色表示。比例尺 = 500 μm. 请点击此处查看此图的放大版本。

作者没有什么可透露的。