Drosophila 卵母细胞中的核迁移

摘要

在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案 离体我们的实验流程可使卵室存活12小时，以便利用转盘共聚焦显微镜获取多点位的三维时间序列图像。

摘要

活细胞成像对于理解调控细胞器运动、细胞骨架重排或细胞内极性模式的细胞与分子机制尤为重要。在研究卵母细胞核定位时，活体成像技术对于捕捉该过程的动态事件至关重要。Drosophila 卵室是一种多细胞结构，因其体积较大且拥有丰富的遗传工具，是研究这一现象的理想模型系统。在 Drosophila 中期卵子发生过程中，细胞核会从卵母细胞中央位置迁移至偏心位置，这一过程由微管产生的力所介导。细胞核的迁移与定位对于决定胚胎及后续成体果蝇的极性轴具有必要性。该迁移过程的一个特征是其在三维（3D）空间中进行，因此必须采用活体成像技术。为了研究调控细胞核迁移的机制，我们建立了一种培养离体卵室并利用转盘共聚焦显微镜进行长达12小时时间序列活体成像的实验方案。总体而言，我们的培养条件能够长时间维持 Drosophila 卵室的存活，从而可在大量样本中实现对三维空间内细胞核迁移完成过程的可视化观察。

引言

多年来， 果蝇 卵母细胞已成为研究核迁移的模型系统。 果蝇 卵母细胞在一种称为卵室的多细胞结构中发育。卵室包含16个生殖细胞（15个滋养细胞和1个卵母细胞），其外围由一层上皮性的滤泡体细胞包裹。卵室的发育已被划分为14个阶段。图1A），在此期间卵母细胞将生长并积累胚胎早期发育所必需的储备物质。在发育过程中，随着微管的重排以及母源决定因子的不对称运输，卵母细胞沿前后轴和背腹轴建立极性。这些轴线将决定由该卵母细胞受精后所形成胚胎及成体的后续极性轴。¹在卵子发生过程中，细胞核在卵母细胞内呈现不对称定位。在第6阶段，细胞核位于细胞中央。当卵母细胞接收到由后部滤泡细胞发出但尚未明确的信号后，在第7阶段，细胞核向卵母细胞前侧与外侧质膜交界处迁移。图1B)^2,3这种不对称位置对于诱导背腹轴的确定是必需的。

图1：Drosophila melanogaster 卵室。（A）来自转基因果蝇的固定卵巢管，该果蝇表达标记核膜的 Fs(2)Ket-GFP 和标记质膜的 ubi-PH-RFP。卵巢管由处于不同发育阶段的卵室组成。成熟方向沿前后轴进行，前端（左侧）为生殖干细胞所在的生殖囊（germarium），后端（右侧）为较晚的发育阶段。（B）活体卵室在卵子发生第6阶段通过转盘共聚焦显微镜获得的Z轴投影图像（左），其中卵母细胞的细胞核位于中央。在第7阶段，细胞核将迁移至不对称位置（右），紧贴前部质膜（位于卵母细胞与滋养细胞之间）以及侧部质膜（位于卵母细胞与滤泡细胞之间）。该位置将诱导卵室背侧的确定，从而建立背腹轴。请点击此处查看此图的放大版本。

几十年来，研究人员通过免疫染色固定组织的方式研究这一核迁移过程。该方法已明确证实，该过程依赖于密集的微管网络。^4,5最近，我们开发了一种实验方案，提供了与卵母细胞数小时活体成像相容的条件，从而能够对这一过程进行动态研究。⁶.

因此，我们首次能够描述细胞核在迁移过程中具有优先且特征性的轨迹：一条沿着卵母细胞的前部质膜（APM），另一条沿着卵母细胞的侧部质膜（LPM）图2这些最新结果强调了在研究核迁移等动态过程时，活体成像方案的重要性。

图 2：细胞核不同迁移路径的示意图。 在卵子发生第6阶段，卵母细胞是一个具有中央细胞核的大细胞。在此阶段，前后极性轴已建立，卵母细胞的后侧/侧部质膜与滤泡细胞接触，而前部质膜（黄色）则与滋养细胞接触²。我们先前报道过，细胞核可沿前部质膜（APM）、侧部质膜（LPM）迁移，或穿过细胞质迁移（STAD，即直接迁移至前背侧皮层）⁶。 请点击此处查看该图的放大版本。

卵母细胞核迁移是一个持续约3小时的现象⁶，迄今为止，触发实际迁移起始的事件尚不清楚。用于研究该机制的蛋白质突变体也可能延迟迁移的起始。这些未知因素促使我们进行长时间（10–12小时）的图像采集。因此，确保卵母细胞保持存活至关重要。随着卵室的发育，其沿前后轴从球形逐渐伸长为椭圆形。这种伸长由滤泡细胞的旋转驱动，该过程发生在第1至第8发育阶段，且旋转方向垂直于前后轴⁷。此外，卵室周围包裹着一层具有脉动特性的管状肌肉鞘，其生理功能是持续推动发育中的滤泡向输卵管方向移动⁸。为了限制解剖后卵室因振荡而产生的运动，我们设计了一个高度为150 µm的观察微室（图3A）。该高度略高于第10和第11阶段滤泡的尺寸，能够在显著限制样本垂直移动的同时，保留卵室的旋转能力，从而最大限度减少滤泡发育过程中的缺陷。随后，我们利用转盘共聚焦显微镜，通过多点时间序列成像对解剖后的卵室进行长达12小时的活体成像。本文中，我们描述了研究第6至第7发育阶段卵母细胞核迁移的实验方案。

图3：观察腔室的示意图。（A）（俯视图）铝制载玻片的精确尺寸，以及位于载玻片中央孔洞的高度（A'）和周长（A''）。（B）（底视图）盖玻片封闭孔洞，并用硅脂密封固定在载玻片上。（C）（俯视图）解剖后的卵管在成像培养基中发育，其表面覆盖一层透气膜，卤代烃油用于稳定该膜。请点击此处查看此图的放大版本。

为了追踪卵母细胞中细胞核的迁移并精确评估其运动轨迹，需要同时标记核膜和质膜。为此，选择了两种具有高信噪比且在活体成像过程中信号不衰减的转基因标记物。为标记质膜，采用了一种 P[ubi-PH-RFP] 推荐使用编码人磷脂酶C∂1（PLC∂1）Pleckstrin同源（PH）结构域与RFP融合的质粒。该PH结构域可结合卵母细胞质膜上分布的磷脂酰肌醇二磷酸PI(4,5)P2。⁹细胞核膜， P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP 一种蛋白捕获品系，其中GFP被插入编码该蛋白的基因内部 果蝇 ß-importin 呈现均匀且强烈的信号¹⁰将年轻的果蝇（1-2日龄）置于含有干酵母的新鲜培养瓶中，饲喂24-48小时，然后再进行卵巢解剖。

在该活体成像实验中，使用一块厚度为1 mm的铝片，该铝片对样品无反应性，并被切割成显微镜载玻片的尺寸。铝片中央有一个直径为16 mm的孔，该孔被扩孔至深度0.85 mm。此扩孔区域中心还设有一个直径6 mm、深度150 µm的附加孔（图3A）。在铝制腔室底部，用硅脂（对样品惰性）将盖玻片粘附固定（图3B）。将样品置于充满培养基的孔中后，用一层允许O₂/CO₂交换的膜覆盖培养基，并在周围加入卤代烃油（图3C）。

解剖时建议使用尖端尺寸为 0.05 x 0.02 mm 的不锈钢镊子，以及直径为 0.20 mm 的针头用于分离卵巢管图4B, C）。使用配备相机的转盘共聚焦倒置显微镜CSU-X1对迁移的细胞核进行成像。通过每15分钟一次的时间序列在多视野下采集图像， 24 °C15 分钟的时间间隔可以在限制荧光蛋白光漂白和样品光毒性的同时，实现多位置图像采集。此外，更短的时间间隔并不能显著增加核运动轨迹追踪的信息量。视频数据经过处理和分析 通过 Fiji 软件¹¹.

方案

1. 成像介质的制备

1. 在使用当天配制新鲜培养基。用移液器吸取 200 µL Schneider 培养基（含 L-谷氨酰胺和 0.40 g/L NaHCO₃，并添加 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）。
2. 加入 30 µL 胰岛素（10 mg/mL）。
3. 加入 4 µL 热灭活胎牛血清。

2. 观察室制备

1. 用移液器吸头蘸取少量硅脂，均匀涂抹在穿孔载玻片底部小孔的周围（图 4D）。
2. 放置一片尺寸为 24 × 50 mm、厚度为 0.13–0.16 mm 的盖玻片。
3. 用移液器吸头的宽端按压盖玻片，使硅脂展平，从而密封盖玻片，并在载玻片内形成一圈硅脂环（图 4F,G）。

3. 卵巢解剖

1. 将所需表型的雌蝇置于 CO₂ 垫上进行麻醉。
2. 将雌蝇转移至解剖孔中，加入 150 µL 成像介质（图 4H）。
3. 用镊子夹住雌蝇胸部，并用另一把镊子夹捏背部腹部的体壁，将其打开。
4. 分离并取出一对卵巢，打开体壁后卵巢应清晰可见。
5. 仔细去除子宫、输卵管和肌鞘（图 4I）。
6. 在成像腔内滴加 10–15 µL 成像介质，并将一个卵巢转移至其中（图 4J,K）。

4. 卵室分离

1. 分离卵巢管时，用解剖针夹住卵巢的后端（朝向较晚发育阶段的一端），再用另一根解剖针轻轻牵拉生殖囊，逐步将卵巢管分离。
2. 去除卵室上残留的肌鞘；一根解剖针固定肌鞘，另一根通过较大的卵室（第9阶段或更晚阶段）牵拉卵巢管。
3. 让去鞘的卵巢管自然沉降并与盖玻片接触。
4. 借助镊子将晚期阶段的卵室及其他剩余卵巢组织从微室中移除。使用解剖针将各卵巢管彼此分开，以利于成像（图4L）。

5. 观察室封闭

1. 裁剪一小块透性膜（10 × 10 mm）（图 4M，N）。
2. 小心地将膜覆盖在成像培养基表面，以排除任何气泡（图 4O）。
3. 在膜的轮廓周围、孔的边缘处涂上一层薄薄的卤代烃油，将培养室密封（图 4P，Q）。

6. 成像

1. 使用40倍物镜（HCX PL Apo，1.25NA，油浸）将成像装置放置在倒置显微镜的载物片 holder 上。
2. 定位并保存不同6期卵母细胞的位置，这些卵母细胞的细胞核已准备迁移。
3. 设置488 nm和561 nm激光器。在实测输出激光功率为150 mW的条件下，分别使用30%的激光功率，曝光时间分别为300 ms和500 ms。
4. 设置实验。以15分钟为时间间隔，进行持续12小时的时间序列成像，每个时间点采集以细胞核为中心、共41个层面、层间间距为1 µm的图像。
   ​注意：根据上述曝光时间，该设置下每个位置的图像采集耗时约45秒。由于更换位置存在延迟，建议在此条件下最多设置12个位置。

7. 图像分析

1. 使用 Fiji 软件中的 Orthogonal view 插件处理视频，并手动追踪细胞核。

图 4：微室安装步骤图示。（A,B,C）所需工具的准备：解剖用培养皿、镊子、针具、成像介质、硅脂、透性膜以及铝制载片。（D）使用移液枪头尖端将硅脂涂抹于铝制载片背面。（E）将玻璃盖玻片粘附在硅脂上，形成微室的底部。（F,G）使用移液枪头较宽的一端对盖玻片施加压力，以在微室内形成密封连接。（H,I）在成像介质中解剖果蝇卵巢。（J）向微室内滴加一滴成像介质。（K,L）在微室内使用针具分离卵管。（M,N,O）将透性膜裁剪为 10 × 10 mm 的正方形，并覆盖在微室内的液滴上。（P,Q）使用卤代烃油密封微室。样本现已准备好进行成像。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

迁移之前，细胞核处于动态状态，在定义为迁移前期的一段时间内围绕中心位置振荡。这些微小运动反映了推力与拉力之间的平衡，使细胞核在卵母细胞中央区域维持稳定。通过量化细胞核的运动轨迹，我们发现朝向前极质膜（APM）和侧极质膜（LPM）的轨迹比例相似。我们将轨迹性质定义为细胞核与质膜首次接触的位置⁶。因此，细胞核在沿质膜滑动并最终到达两个质膜交界处之前，会先接触APM或LPM（图5,影片1-2）。此外，我们发现不同的分子信号分别促进这两种轨迹。例如，位于细胞核与卵母细胞后部质膜之间的中心体聚集可促进APM方向的轨迹；相反，不对称定位于核膜上的微管相关蛋白Mushroom Body Defect（Mud）则支持沿LPM方向的运动轨迹⁶。此外，与野生型情况相比，中心体或Mud蛋白的缺失均会影响细胞核的迁移速度⁶。<...

讨论

其他方案描述了如何制备和培养果蝇卵室 离体 用于活体成像实验^12,13该方案的创新之处在于使用由中空铝制载玻片、盖玻片和O形圈构建的成像室₂/CO₂ 可渗透膜。该装置的主要优势在于限制Z轴方向的移动，同时不对样品施加压力。因此，卵母细胞仍可自由移动，这也是为何首先使用40倍物镜，其次沿40 µm范围采集z轴层扫图像，而第6期卵母细胞的高度约为20 µm。

尽管该实验方案相对简单，但每一步骤对检测都至关重要。微室的制备、通透性膜的处理以及腔室的密封，均需确保气体交换的进行，并防止成像介质及样品干燥。损伤卵室会危及样品存活，因此精细且准确的解剖技术至关重要。此外，必须彻底去除肌肉鞘，因为残留的组织碎片会导致卵室发生不期望的移动。

铝除了对样品安全外，还因其强度高、耐用性强以及易于清洁而被选用。目前尚未在这些条件下研究其他材料。尽管随着3D打印机的发展使用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CO2麻醉垫	Dutscher	789060	麻醉果蝇
盖玻片（24×50 mm）	Knittel Glass	VD12450Y100A	观察室制备
杜蒙特#5镊子	Carl Roth	K342.1	解剖
不锈钢针	Entosphinx	20	解剖
热灭活胎牛血清	SIGMA-ALDRICH	F7524	成像介质
牛胰岛素溶液	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	成像介质
青霉素/链霉素溶液	SIGMA-ALDRICH	P0781	成像介质
通透性膜	Leica	11521746	观察室制备
Schneider培养基	Pan Biotech	P04-91500	成像介质
硅脂	BECKMAN COULTER	335148	观察室制备
转盘共聚焦显微镜	Zeiss	CSU-X1	细胞核迁移观察
Voltalef 10S油	VWR	24627 - 188	观察室制备