在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案 离体我们的实验流程可使卵室存活12小时，以便利用转盘共聚焦显微镜获取多点位的三维时间序列图像。
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本文内容
摘要
摘要
活细胞成像对于理解调控细胞器运动、细胞骨架重排或细胞内极性模式的细胞与分子机制尤为重要。在研究卵母细胞核定位时，活体成像技术对于捕捉该过程的动态事件至关重要。Drosophila 卵室是一种多细胞结构，因其体积较大且拥有丰富的遗传工具，是研究这一现象的理想模型系统。在 Drosophila 中期卵子发生过程中，细胞核会从卵母细胞中央位置迁移至偏心位置，这一过程由微管产生的力所介导。细胞核的迁移与定位对于决定胚胎及后续成体果蝇的极性轴具有必要性。该迁移过程的一个特征是其在三维（3D）空间中进行，因此必须采用活体成像技术。为了研究调控细胞核迁移的机制，我们建立了一种培养离体卵室并利用转盘共聚焦显微镜进行长达12小时时间序列活体成像的实验方案。总体而言，我们的培养条件能够长时间维持 Drosophila 卵室的存活，从而可在大量样本中实现对三维空间内细胞核迁移完成过程的可视化观察。
引言
多年来， 果蝇 卵母细胞已成为研究核迁移的模型系统。 果蝇 卵母细胞在一种称为卵室的多细胞结构中发育。卵室包含16个生殖细胞（15个滋养细胞和1个卵母细胞），其外围由一层上皮性的滤泡体细胞包裹。卵室的发育已被划分为14个阶段。图1A），在此期间卵母细胞将生长并积累胚胎早期发育所必需的储备物质。在发育过程中，随着微管的重排以及母源决定因子的不对称运输，卵母细胞沿前后轴和背腹轴建立极性。这些轴线将决定由该卵母细胞受精后所形成胚胎及成体的后续极性轴。1在卵子发生过程中，细胞核在卵母细胞内呈现不对称定位。在第6阶段，细胞核位于细胞中央。当卵母细胞接收到由后部滤泡细胞发出但尚未明确的信号后，在第7阶段，细胞核向卵母细胞前侧与外侧质膜交界处迁移。图1B)2,3这种不对称位置对于诱导背腹轴的确定是必需的。
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方案
1. 成像介质的制备
- 在使用当天配制新鲜培养基。用移液器吸取 200 µL Schneider 培养基（含 L-谷氨酰胺和 0.40 g/L NaHCO3，并添加 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）。
- 加入 30 µL 胰岛素（10 mg/mL）。
- 加入 4 µL 热灭活胎牛血清。
2. 观察室制备
- 用移液器吸头蘸取少量硅脂，均匀涂抹在穿孔载玻片底部小孔的周围（图 4D）。
- 放置一片尺寸为 24 × 50 mm、厚度为 0.13–0.16 mm 的盖玻片。
- 用移液器吸头的宽端按压盖玻片，使硅脂展平，从而密封盖玻片，并在载玻片内形成一圈硅脂环（图 4F,G）。
3. 卵巢解剖
- 将所需表型的雌蝇置于 CO2 垫上进行麻醉。
- 将雌蝇转移至解剖孔中，加入 150 µL 成像介质（图 4H）。
- 用镊子夹住雌蝇胸部，并....
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结果
迁移之前，细胞核处于动态状态，在定义为迁移前期的一段时间内围绕中心位置振荡。这些微小运动反映了推力与拉力之间的平衡，使细胞核在卵母细胞中央区域维持稳定。通过量化细胞核的运动轨迹，我们发现朝向前极质膜（APM）和侧极质膜（LPM）的轨迹比例相似。我们将轨迹性质定义为细胞核与质膜首次接触的位置6。因此，细胞核在沿质膜滑动并最终到达两个质膜交界处之前，会先接触APM或LPM（图5,影片1-2）。此外，我们发现不同的分子信号分别促进这两种轨迹。例如，位于细胞核与卵母细胞后部质膜之间的中心体聚集可促进APM方向的轨迹；相反，不对称定位于核膜上的微管相关蛋白Mushroom Body Defect（Mud）则支持沿LPM方向的运动轨迹6。此外，与野生型情况相比，中心体或Mud蛋白的缺失均会影响细胞核的迁移速度6。<.......
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讨论
其他方案描述了如何制备和培养果蝇卵室 离体 用于活体成像实验12,13该方案的创新之处在于使用由中空铝制载玻片、盖玻片和O形圈构建的成像室2/CO2 可渗透膜。该装置的主要优势在于限制Z轴方向的移动，同时不对样品施加压力。因此，卵母细胞仍可自由移动，这也是为何首先使用40倍物镜，其次沿40 µm范围采集z轴层扫图像，而第6期卵母细胞的高度约为20 µm。
尽管该实验方案相对简单，但每一步骤对检测都至关重要。微室的制备、通透性膜的处理以及腔室的密封，均需确保气体交换的进行，并防止成像介质及样品干燥。损伤卵室会危及样品存活，因此精细且准确的解剖技术至关重要。此外，必须彻底去除肌肉鞘，因为残留的组织碎片会导致卵室发生不期望的移动。
铝除了对样品安全外，还因其强度高、耐用性强以及易于清洁而被选用。目前尚未在这些条件下研究其他材料。尽管随着3D打印机的发展使用.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们非常感谢 Jean-Antoine Lepesant 和 Nicolas Tissot，他们最初开发了该实验方案，并与我们分享了图3的部分图形元素。我们感谢 Fanny Roland-Gosselin 拍摄了图4的照片。我们还感谢实验室其他成员提供的有益讨论，这些讨论有助于改进本技术，同时感谢 Nathaniel Henneman 对本文稿提出的修改意见。我们谨此致谢 Jacques Monod 研究所的 ImagoSeine 核心设施，该设施是法国生物成像网络（France-BioImaging，项目编号 ANR-10-INBS-04）的成员。Maëlys Loh 的研究得到了法国科研部（MESRI）博士奖学金的资助。Antoine Guichet 和 Fred Bernard 的研究得到了法国癌症研究基金会（ARC，项目编号 PJA20181208148）、抗击癌症企业协会（Association des Entreprises contre le Cancer，项目编号 Gefluc 2020 #221366）以及巴黎大学 IdEx“新兴项目”基金（ANR-18-IDEX-0001）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CO2麻醉垫 | Dutscher | 789060 | 麻醉果蝇 |
| 盖玻片（24×50 mm） | Knittel Glass | VD12450Y100A | 观察室制备 |
| 杜蒙特#5镊子 | Carl Roth | K342.1 | 解剖 |
| 不锈钢针 | Entosphinx | 20 | 解剖 |
| 热灭活胎牛血清 | SIGMA-ALDRICH | F7524 | 成像介质 |
| 牛胰岛素溶液 | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | 成像介质 |
| 青霉素/链霉素溶液 | SIGMA-ALDRICH | P0781 | 成像介质 |
| 通透性膜 | Leica | 11521746 | 观察室制备 |
| Schneider培养基 | Pan Biotech | P04-91500 | 成像介质 |
| 硅脂 | BECKMAN COULTER | 335148 | 观察室制备 |
| 转盘共聚焦显微镜 | Zeiss | CSU-X1 | 细胞核迁移观察 |
| Voltalef 10S油 | VWR | 24627 - 188 | 观察室制备 |
参考文献
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A.
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重印与许可
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