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方法文章

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

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DOI：

10.3791/62691

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2021年7月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

本文内容

摘要

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。

摘要

星形胶质细胞是一类胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中发挥着至关重要的作用，包括支持神经元及其功能。这些细胞还能响应神经损伤，并保护组织免受退行性事件的侵害。体外研究星形胶质细胞的功能对于阐明这些过程所涉及的机制至关重要，并有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。本实验方案描述了一种通过3D生物打印含星形胶质细胞的生物墨水来构建富含星形胶质细胞的类神经组织结构的方法。本研究采用基于挤出式的3D生物打印机，并从小鼠C57Bl/6品系幼鼠的大脑皮层中提取星形胶质细胞。生物墨水由传代不超过3代的皮层星形胶质细胞与含有明胶、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和纤维蛋白原的生物材料溶液混合制备而成，同时添加层粘连蛋白，以获得最佳的生物打印性能。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，从而保证了打印过程中星形胶质细胞的高存活率，打印后立即检测显示细胞存活率为74.08% ± 1.33%。经过1周的培养后，星形胶质细胞的存活率显著提高至83.54% ± 3.00%，表明该3D结构为细胞生长提供了适宜的微环境。该生物材料组分支持细胞黏附并促进星形胶质细胞特性表达，细胞表现出特异性星形胶质细胞标志物——胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，并具有典型的星形胶质细胞形态。这一 可重复的实验方案提供了一种有价值的手段，用于构建富含星形胶质细胞、模拟细胞天然微环境的3D类神经组织，适用于致力于研究星形胶质细胞功能及其在神经系统疾病机制中作用的研究人员。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在维持大脑稳态中发挥关键作用。除了为神经元提供持续支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质的摄取、维持血脑屏障的完整性，并调控神经元突触的形成1,2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，当脑组织受损时，它们会启动反应性星形胶质细胞增生或反应性星形胶质化3,4，形成胶质瘢痕，以防止健康组织暴露于退行性致病因子中5。这一过程导致星形胶质细胞的基因表达、形态和功能发生改变6,7。因此，针对星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。

体外模型对于研究与神经系统损伤相关的机制至关重要。尽管皮质星形胶质细胞的成功分离和二维（2D）培养已有报道8，但该模型无法提供模拟细胞天然行为的真实环境，也无法重现大脑的复杂性9。在二维条件下，机械和生化支持不足、细胞间及细胞与基质间的相互作用较弱，以及细胞扁平化导致基底-顶端极性的缺失，均会影响细胞信号传导动态和实验结果，引起细胞形态和基因表达的改变，从而影响对治疗干预的响应10。因此，开发能够提供更接近真实神经环境的替代模型至关重要，以期实现研究成果向临床应用的转化。

三维（3D）细胞培养是一种更为先进的模型，能够更高保真度地模拟器官和组织的特征，包括中枢神经系统（CNS）11。在胶质细胞培养方面，3D模型有助于维持星形胶质细胞的形态、细胞基底-顶端极性以及细胞信号传导12,13。3D生物打印技术作为一种强大工具应运而生，可通过使用细胞和生物材料以受控方式生物制造出三维活体组织，从而重现天然组织的结构与特性。该技术的应用显著提高了实验结果的可预测性，并推动了中枢神经系统相关再生医学的发展14,15,16。

本文所述方案详细介绍了皮层星形胶质细胞的分离与培养方法。该方案还详细描述了一种可重复的方法，用于将星形胶质细胞包埋在明胶/甲基丙烯酰化明胶（GelMA）/纤维蛋白原中，并添加层粘连蛋白进行生物打印。本研究采用基于挤出式的生物打印机，以每毫升1 × 106个细胞的密度打印含有皮层星形胶质细胞的生物材料。通过控制打印速度，最大限度地减少了生物打印过程中的剪切应力，星形胶质细胞在打印后表现出较高的存活率。生物打印的结构体培养一周后，星形胶质细胞能够在水凝胶内伸展、贴附并存活，维持典型的星形胶质细胞形态，并表达特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4。

该方法适用于活塞驱动的基于挤出的生物打印机，可用于打印来源于不同来源的星形胶质细胞。本文提出的3D生物打印模型适用于多种神经工程应用，例如研究星形胶质细胞在健康组织中的功能机制，以及理解神经病理学的进展和治疗方案的开发。

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方案

所有涉及动物的实验均遵循国际实验动物使用指南（http://www.iclas.org），并经圣保罗联邦大学研究伦理委员会批准（CEUA 2019/ 9292090519）。

1. 小鼠脑组织解剖

  1. 将 10 mL 冷的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）转移至一个 100 mm 培养皿中，并将 1 mL 转移至一个 1.5 mL 微量离心管中。每只动物准备一个微量离心管。
    注意：培养皿和微量离心管均需置于冰上保存。
  2. 使用 DMEM/F12 培养基配制星形胶质细胞培养液，添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% 谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（P/S）。使用 0.2 µm 滤器过滤培养基以实现灭菌。
  3. 使用锋利的手术剪通过断头法处死出生后第 1 天的 C57Bl/6 小鼠幼崽。用镊子拉开皮肤，暴露颅骨。确保手术剪和镊子均已用 70% 乙醇灭菌。
  4. 使用锋利的弯头剪刀沿矢状面从枕骨大孔向头顶方向剪开颅骨。
    注意：务必避免损伤脑组织。
  5. 使用先前经 70% 乙醇灭菌的刮铲，将脑组织从颅腔中取出，并放入含有 10 mL 冷 HBSS 的培养皿中。
  6. 将盛有脑组织的培养皿置于体视显微镜下，使用两把钝头镊子去除脑表面的脑膜（图 1）。
  7. 用刮铲轻轻将大脑皮层从脑的其他部分沿中线卷离，从而分离皮层组织。
  8. 收集两侧皮层组织，并立即转移至含有 1 mL 冷 HBSS 的同一微量离心管中。

2. 星形胶质细胞的分离与培养

  1. 在超净工作台中，使用弯头显微剪将皮层组织剪成小块，用1 mL HBSS上下吹打3次进行洗涤。静置组织使其自然沉降。吸除HBSS，加入新鲜HBSS，重复该洗涤过程两次。
  2. 吸除HBSS，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育5分钟。
    注意：此阶段仅需胰蛋白酶消化即可。
  3. 通过轻柔吹打15次对组织进行机械性解离。
    注意：组织完全解离的标志是细胞悬液浊度增加，且悬液中无明显的大块组织残留。
  4. 将溶液转移至15 mL锥形离心管中，加入等体积胎牛血清（FBS）以中和胰蛋白酶活性，并使用孔径为0.4 µm的细胞滤网过滤溶液，以去除未解离的组织碎片。
  5. 用1 mL星形胶质细胞培养基冲洗滤网，收集滤过液，于200 × g、25 °C条件下离心5分钟。离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。
  6. 将细胞悬液转移至T25培养瓶中，补加培养基至总体积为3.5 mL，并将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。
  7. 确保细胞在24小时后已贴壁。随后更换培养基，并每隔3天更换一次。
  8. 培养7天后，用2 mL 1× PBS洗涤细胞，以去除小胶质细胞和少突胶质细胞。
  9. 将PBS替换为星形胶质细胞培养基，将培养瓶置于摇床中，180 rpm振荡过夜。
    ​注意：星形胶质细胞在培养约10–12天后可形成融合的单层细胞。

3. 明胶甲基丙烯酰基（GelMA）的合成

  1. 称取10 g猪皮来源的明胶，加入100 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，在加热板上以240 rpm转速、50 °C温度搅拌至完全溶解。
  2. 在通风橱内，加入2 mL甲基丙烯酸酐（MA）以实现较低程度的功能化修饰，并将明胶乳液在240 rpm转速、50 °C温度下持续搅拌2小时。
    警告：MA危险性说明：H302 + H332（吞咽或吸入有害），H311（皮肤接触有毒），H314（造成严重皮肤灼伤和眼损伤），H315（引起皮肤刺激），H317（可能引起过敏性皮肤反应），H318（造成严重眼损伤），H331（吸入有毒），H332（吸入有害），H335（可能引起呼吸道刺激）。操作指南：P261（避免吸入粉尘/烟/气体/烟雾/蒸气/喷雾），P305 + P351 + P338 + P310（若进入眼睛：用清水小心冲洗数分钟。如佩戴隐形眼镜且易于取出，请取出隐形眼镜并继续冲洗。立即呼叫中毒中心或就医），P301 + P312 + P330（若误吞：如有不适，立即呼叫中毒中心或就医。漱口）。
    注意：应极其缓慢地逐滴加入MA。
  3. 将明胶-MA溶液加入100 mL预热至50 °C的PBS中，使终体积达到200 mL，并在240 rpm转速、50 °C温度下继续搅拌10分钟。
  4. 截取约20 cm的透析膜（截留分子量12–14 kDa），浸泡于去离子水中直至变软。
    注意：用去离子水充满透析膜，以确保无孔洞或缺陷。
  5. 使用漏斗将明胶-MA溶液转移至透析膜中。
    注意：封闭两端时应预留足够内部空间，以容纳溶液膨胀。
  6. 将装有明胶-MA溶液的透析膜置于盛有2 L蒸馏水的容器中进行透析，在40 °C、500 rpm转速下持续搅拌5天。
    注意：覆盖容器以防止水分蒸发。
  7. 每日更换蒸馏水两次，每次更换时将透析膜翻转倒置以促进均匀透析。
  8. 第五天时，向透析后的明胶-MA溶液中加入200 mL预热至40 °C的超纯水，并在40 °C下搅拌15分钟。
  9. 将明胶-MA溶液分装至50 mL锥形管中，每管不超过25 mL，于-80 °C冷冻2天。
    ​注意：将离心管水平放置，以利于后续冻干。
  10. 将冷冻溶液冻干3–5天，并将所得冻干明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）置于防潮条件下保存。

4. 生物墨水制备

注意：为了获得 1 mL 的生物墨水，建议制备至少 3 mL 的生物材料溶液，因为在过滤过程中可能会有损失。

  1. 纤维蛋白原溶液的制备
    1. 用去离子水配制生理盐水（NaCl 0.9%），并将10 mg牛血浆纤维蛋白原溶解于1 mL生理盐水中，得到浓度为10 mg/mL的溶液。
      注意：由于纤维蛋白原会吸附到玻璃表面，因此请勿使用玻璃烧瓶配制纤维蛋白原溶液。
    2. 在37 °C下持续搅拌，直至纤维蛋白原完全溶解。
      注意：溶解纤维蛋白原时，可使用置于37 °C恒温烘箱内的旋转仪。也可在37 °C加热板上以磁力搅拌（180 rpm）溶解纤维蛋白原。在此条件下，10 mg/mL纤维蛋白原约需40分钟完全溶解。
  2. 明胶/GelMA 溶液的制备
    1. 称取 0.12 g 明胶，加入 1.9 mL 预热的 PBS（40 °C），配制成终浓度为 4%（w/v）的明胶溶液。涡旋振荡以促进溶解。
    2. 将乳液保持在40 °C直至完全溶解。
    3. 称取0.06 g冻干GelMA，转移至明胶溶液中，使GelMA终浓度为2%（w/v）。涡旋振荡以促进溶解。
    4. 将溶液保持在 40 °C 直至完全溶解。
  3. 含星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的制备
    1. 移取0.9 mL的10 mg/mL纤维蛋白原溶液，加入明胶/GelMA溶液中，使纤维蛋白原的终浓度为3 mg/mL。
    2. 称取0.015 g光引发剂（PI），转移至明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液中，使PI终浓度为0.5%（w/v）。通过上下翻转离心管混合溶液，并保持 在40 °C避光条件下孵育，以避免PI降解。
      注意：生物墨水在 4 °C 下储存时间最长不得超过 24 小时。
    3. 在层流条件下，使用 0.2 µm 滤器将溶液过滤至无菌的 15 mL 离心管中。
      注意：生物材料溶液应保持在 37–40 °C 以利于过滤。
    4. 将980 µL的生物材料溶液转移至15 mL锥形管中。
    5. 将层粘连蛋白用生理盐水稀释，配制成100 µg/mL的储存液。
    6. 移取20 µL层粘连蛋白，加入含有生物墨水的离心管中，使层粘连蛋白的终浓度为2 µg/mL。
    7. 轻轻吹打混匀，避免产生气泡。若仍有气泡存在，将锥形管在200 x g 2 分钟。将生物墨水置于 37 °C 环境中保存，直至与细胞混合。
    8. 用0.05%胰蛋白酶消化原代星形胶质细胞5分钟。
      注意：使用第1至第3代的星形胶质细胞。
    9. 用FBS以1:1的比例中和胰蛋白酶活性，将细胞转移至15 mL锥形管中。在200 x g 5 分钟。
    10. 计数细胞并转移 1 x 106 将细胞转移至另一离心管中。以200 x g离心 g 5 分钟。
    11. 轻轻敲击锥形管底部，弃去上清液，保留少量液体（约200 µL）以重悬细胞沉淀。
    12. 将1 mL明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液转移至含有细胞的离心管中，轻轻吹打混匀，获得终浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的均匀混合物。6 cells/mL

5. 交联剂溶液的制备

  1. 凝血酶的重悬
    1. 在15 mL锥形管中，用含0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的无菌去离子水配制100 U/mL的凝血酶储备液。将储备液分装至微量离心管中，于-20 °C保存。
      注意：由于凝血酶会吸附于玻璃表面，因此请勿使用玻璃容器配制储备液或储存分装液。
  2. 凝血酶-CaCl2溶液的配制
    1. 用移液器吸取100 µL凝血酶储备液，转移至含有8.9 mL无菌去离子水的50 mL锥形管中，得到终浓度为1 U/mL的凝血酶溶液。
    2. 用去离子水配制10%（w/v）的CaCl2溶液，并使用0.2 µm滤器进行除菌过滤。
    3. 取1.1 mL 10% CaCl2溶液加入含凝血酶的锥形管中，使CaCl2与凝血酶的终体积比为1:9。
      ​注意：应根据实验所需用量现配交联剂溶液，避免储存。

6. 使用挤出式生物打印机打印含星形胶质细胞的生物墨水

  1. 神经组织的设计
    1. 使用G代码：在X轴和Y轴上构建一个6 × 6 mm（方形）的网格，每条生物打印线之间间距为1 mm，在Z轴上设置6层（每层之间间隔0.2 mm）；设定挤出量（E）为0.01 mm，并在Z轴每一新层增加0.001 mm；打印速度（F）设定为400 mm/min（补充信息）。
  2. 生物打印机的设置
    1. 用紫外光照射设备15分钟，然后用70%乙醇擦拭表面。
    2. 使用电源开关打开生物打印机。通过USB线将设备连接至计算机。打开控制软件，连接至生物打印机并加载设计文件。
  3. 生物打印用注射器的准备
    1. 使用1,000 µL移液器将含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移至5 mL塑料注射器中。
      注意：转移过程应缓慢，以避免气泡产生。
    2. 在注射器上连接一支无菌的22 G钝头针。
      注意：将注射器置于4 °C环境中静置2分钟。
    3. 将注射器连接至生物打印机的打印头，并手动挤出生物墨水以排除残留气泡。
  4. 生物打印
    注意：生物打印操作在超净工作台外进行。
    1. 将一个35 mm培养皿放置在生物打印机载物台上，并将针头定位在距离培养皿表面0.1 mm的位置，以确保针头可自由移动。
      注意：每次生物打印使用一个独立的35 mm培养皿。
    2. 按下打印按钮。
    3. 生物打印完成后，确保注射器移离培养皿。随后盖上培养皿，准备进行交联处理。
      ​注意：单个结构的生物打印过程约需1分钟10秒。
  5. 生物打印结构的交联与培养
    1. 将培养皿置于强度为2 mW/cm2的紫外光下，上下各照射60秒，共两次，以实现GelMA的交联。
    2. 在超净工作台内，使用无菌刮铲将生物打印结构转移至24孔板中。
    3. 加入500 µL凝血酶/CaCl2溶液，静置30分钟以完成纤维蛋白交联。
    4. 移除交联溶液，用2 mL 1× PBS洗涤结构一次，随后更换为1 mL星形胶质细胞培养基，置于37 °C、5% CO2条件下培养。每隔3天更换一次培养基。

7. 星形胶质细胞活力的评估

  1. 生物打印星形胶质细胞的活性检测
    1. 使用刮铲将生物打印的构建物转移至35 mm培养皿中。
    2. 用1 mL的1×PBS洗涤构建物。
    3. 在构建物上加入100 µL的活/死细胞染色试剂，于37 °C孵育30分钟，并避光保存。
    4. 移除活/死细胞染色试剂，并用1 mL的1×PBS洗涤构建物。
    5. 使用刮铲将样品转移至共聚焦培养皿中，利用共聚焦显微镜在488 nm和570 nm激发光下观察构建物内的细胞以获取图像。
      注：建议使用10倍物镜对构建物内细胞进行整体观察。
    6. 确保样品放置平整。如有必要，可在样品上覆盖盖玻片以提高平整度。
      注：成像过程中，应确保共聚焦培养皿密封良好，防止样品干燥。
    7. 使用计算软件统计活细胞（绿色）和死细胞（红色）的数量。
  2. 二维星形胶质细胞培养的活性检测
    1. 将0.5 × 106个星形胶质细胞（传代1–3代）接种于35 mm共聚焦培养皿中，加入星形胶质细胞培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。
    2. 当细胞达到完全融合时，移除培养基，并用1 mL的1×PBS洗涤。
    3. 加入200 µL的活/死细胞染色试剂，将培养皿置于37 °C孵育30分钟，并避光处理。
    4. 移除活/死细胞染色试剂，并用1 mL的1×PBS洗涤细胞。
    5. 将培养皿置于配备数字相机的共聚焦显微镜下，使用488 nm和570 nm激发光进行图像采集。
    6. 使用计算软件统计活细胞（绿色）和死细胞（红色）的数量。

8. 星形胶质细胞的免疫染色

  1. 三维生物打印星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
    注意：若需检测其他细胞标志物，请相应更换一抗。
    1. 从孔中移除培养基，并用 1 mL 的 3× PBS 清洗结构。
    2. 向孔中加入含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS，直至完全覆盖结构，在 4 °C 下孵育 2 小时。
    3. 移除 PFA，并用 1 mL 的 3× PBS 清洗结构。
      注意：若将样品在 4 °C 的 PBS 中保存，此步骤可暂停数月。确保培养板密封，防止 PBS 蒸发。
    4. 用 0.1 mol/L 甘氨酸处理样品 5 分钟。
    5. 用 1 mL 的 1× PBS 洗涤 5 分钟。
    6. 在 25 °C 下，使用含 0.1% Triton X-100 和 10% FBS 的 PBS 对样品进行透化处理，持续 1 小时，并置于摇床上振荡。
    7. 在 4 °C 下，用鸡抗 GFAP 抗体（一抗稀释比例为 1:500）孵育结构过夜。
    8. 吸除一抗，用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。
      注意：一抗在 4 °C 保存时可重复使用多次。
    9. 在 25 °C 下，于避光条件下，在摇床上用 Alexa Fluor 488 标记的抗鸡二抗（二抗稀释比例为 1:500）和 1 µg/mL DAPI 孵育样品 1 小时。
      注意：样品需避光保存。
    10. 用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    11. 将结构转移至 35 mm 共聚焦培养皿中。
      注意：确保培养皿密封良好，防止样品干燥。
  2. 二维星形胶质细胞培养的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
    1. 在 35 mm 共聚焦培养皿中接种 0.5 × 106 个星形胶质细胞（传代 1–3 代），加入星形胶质细胞培养基，在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。
    2. 当细胞达到完全汇合时，移除培养基，并用 1 mL 的 1× PBS 清洗细胞。
    3. 重复步骤 8.1.2–8.1.10。
  3. 星形胶质细胞细胞骨架染色
    1. 重复步骤 8.1.1–8.1.6。
    2. 在结构上加入 200 µL 含 50 µg/mL 荧光标记鬼笔环肽的 PBS 溶液和 1 µg/mL DAPI。
    3. 在 25 °C 下避光孵育 1 小时，同时置于摇床上振荡。
    4. 用 1 mL PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次，然后用刮匙将结构转移至共聚焦培养皿中。
      ​注意：确保培养皿密封良好，防止样品干燥。

9. 共聚焦成像

  1. 将培养皿置于配备数字相机的共聚焦显微镜下进行成像（激发波长分别为 359、488 和 570 nm）。
  2. 使用 10 倍物镜进行整体观察，使用 40 或 63 倍物镜获取细胞的放大图像。
    注意：确保样品放置平整。如有必要，可在样品上覆盖盖玻片以提高平整度。

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结果

本研究旨在利用3D生物打印技术，通过逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水，构建类神经组织。星形胶质细胞从小鼠幼崽的大脑皮层中提取并分离（图1），随后加入生物材料混合物中，从而实现活体3D结构的生物制造。

采用 G 代码（补充文件）设计计算机辅助设计（CAD）模型，构建一个正方形（0.6 × 0.6 mm）互连框架结构，孔径为 1 mm，旨在促进营养物质和氧气的扩散。该框架由 6 层叠加组成，每层之间旋转 90°（图 2A i）。所设计的结构高度约为 5 mm（图 2A ii），便于组织操作。生物墨水的组成还支持制造不同形状的结构（图 2B）。

由明胶、GelMA...

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讨论

3D生物打印技术作为一种生物制造新方法应运而生，可构建在结构和生理功能上均接近天然组织的精细结构22，包括大脑23类神经组织的生物制造使得 体外 原生微环境建模，作为理解与中枢神经系统疾病发生及治疗相关的细胞与分子机制的重要工具11由于胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮层星形胶质细胞已被广泛应用于诸多研究中，例如脑发育研究24生物分子运输25，神经突起生长26以及类脑组织的生物制造14.

先前已报道了使用不同生物材料和支架技术构建星形胶质细胞三维培养的方法27,28,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）资助，资助编号为 2018/23039-3 和 2018/12605-8；科学技术发展国家理事会（CNPq），资助编号为 465656/2014-5 和 309679/2018-4；以及高等教育人员改进协调机构（CAPES），财务代码 001。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 生物打印机3D Biotechnology Solutions基于挤出式的生物打印机
钝头镊子Integra Miltex6--30用于脑组织解剖的镊子，已预先灭菌
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich9048-46-8无蛋白酶、无脂肪酸、基本无球蛋白
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
细胞培养瓶Fisher Scientific156340T25 培养瓶
细胞筛Corning Incorporated35234040 µm 细胞筛
共聚焦显微镜Leica配备 Olympus FluoView 300 共聚焦系统的共聚焦 TCS SP8 显微镜
锥形离心管Thermo Scientific339651, 33965215 mL 和 50 mL 无菌离心管
DAPIAbcamab224589DAPI 染色液
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50，1X（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 50/50 混合液），含 L-谷氨酰胺
透析管Sigma-AldrichD9527截留分子量 = 14 kDa
乙醇Fisher Scientific64-15-5试剂级
胎牛血清Gibco; Life Technologies Corporation12657011研究级
纤维蛋白原Sigma-Aldrich9001-32-5来自牛血浆的结晶粉末状纤维蛋白原
明胶Sigma-Aldrich9000-70-8来自猪皮的明胶粉末
甘氨酸Sigma-Aldrich56-40-6甘氨酸粉末
汉克平衡盐溶液（HBSS）Gibco; Life Technologies Corporation14175095无钙、无镁、无酚红
L-谷氨酰胺Sigma-Aldrich56-85-9L-谷氨酰胺结晶粉末
层粘连蛋白Sigma-Aldrich114956-81-9层粘连蛋白 1-2 mg/mL L，溶于 50 mM Tris-HCl
活死细胞成像试剂盒Thermo ScientificR37601活细胞中呈绿色荧光（激发/发射 488 nm/515 nm）；死细胞中呈红色荧光（激发/发射 570 nm/602 nm）
甲基丙烯酸酐Sigma-Aldrich760-93-0用于 GelMA 制备
微量离心管Corning IncorporatedMCT-150-C1.5 mL 微量离心管
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
22G 针头Fisher ScientificNC1362045无菌钝头针
手术剪Integra Miltex05--02用于脑组织解剖的锋利剪刀，已预先灭菌
多聚甲醛Sigma-Aldrich30525-89-4多聚甲醛粉末
青霉素/链霉素Gibco; Life Technologies Corporation15070063青霉素-链霉素（5,000 单位/mL 青霉素；5,000 µg/mL 链霉素）
培养皿Corning Incorporated430591, 43058835 mm 和 100 mm 无菌培养皿
鬼笔环肽Abcamab176753iFluor 488 试剂
光引发剂Sigma-Aldrich106797-53-92-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1×，细胞培养级，无钙、无镁
聚-L-赖氨酸Sigma-Aldrich25988-63-0聚-L-赖氨酸氢溴化物，分子量 30,000–70,000
一抗Abcamab4674鸡源多克隆抗 GFAP 抗体
二抗Abcamab150176Alexa Fluor 594 标记抗鸡抗体
刮铲MiltexV973-7024 号水泥刮铲，已预先灭菌
体视显微镜Fisherbrand3000038用于脑组织解剖的显微镜
5 mL 注射器BD1222C84无菌注射器
2 µm 注射器滤器Fisher Scientific09-740-105聚丙烯滤膜，用于灭菌
凝血酶Sigma-Aldrich9002--04-4来自牛血浆的结晶粉末状凝血酶
吐温 X-100Sigma-Aldrich9002-93-1实验室级
胰蛋白酶-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054无酚红胰蛋白酶，以 PBS 稀释至 1×
Versene 溶液Gibco; Life Technologies Corporation15040066Versene 溶液（0.48 mM），配方为每升 PBS 含 0.2 g EDTA(Na4)
多孔板Thermo Scientific144530无菌 24 孔板

参考文献

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079(2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414(2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401(2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848(2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001(2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036(2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517(2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757(2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

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