本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
星形胶质细胞是一类胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中发挥着至关重要的作用，包括支持神经元及其功能。这些细胞还能响应神经损伤，并保护组织免受退行性事件的侵害。体外研究星形胶质细胞的功能对于阐明这些过程所涉及的机制至关重要，并有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。本实验方案描述了一种通过3D生物打印含星形胶质细胞的生物墨水来构建富含星形胶质细胞的类神经组织结构的方法。本研究采用基于挤出式的3D生物打印机，并从小鼠C57Bl/6品系幼鼠的大脑皮层中提取星形胶质细胞。生物墨水由传代不超过3代的皮层星形胶质细胞与含有明胶、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和纤维蛋白原的生物材料溶液混合制备而成，同时添加层粘连蛋白，以获得最佳的生物打印性能。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，从而保证了打印过程中星形胶质细胞的高存活率，打印后立即检测显示细胞存活率为74.08% ± 1.33%。经过1周的培养后，星形胶质细胞的存活率显著提高至83.54% ± 3.00%，表明该3D结构为细胞生长提供了适宜的微环境。该生物材料组分支持细胞黏附并促进星形胶质细胞特性表达，细胞表现出特异性星形胶质细胞标志物——胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，并具有典型的星形胶质细胞形态。这一 可重复的实验方案提供了一种有价值的手段，用于构建富含星形胶质细胞、模拟细胞天然微环境的3D类神经组织，适用于致力于研究星形胶质细胞功能及其在神经系统疾病机制中作用的研究人员。
引言
星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在维持大脑稳态中发挥关键作用。除了为神经元提供持续支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质的摄取、维持血脑屏障的完整性，并调控神经元突触的形成1,2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，当脑组织受损时，它们会启动反应性星形胶质细胞增生或反应性星形胶质化3,4，形成胶质瘢痕，以防止健康组织暴露于退行性致病因子中5。这一过程导致星形胶质细胞的基因表达、形态和功能发生改变6,7。因此，针对星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的新疗法。
体外模型对于研究与神经系统损伤相关的机制至关重要。尽管皮质星形胶质细胞的成功分离和二维（2D）培养已有报道8，但该模型无法提供模拟细胞天然行为的真实环境，也无法重现大脑的复杂性9。在二维条件下，机械和生化支持不足、细胞间及细胞与基质间的相互作用较弱，以及细胞扁平化导致....
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方案
所有涉及动物的实验均遵循国际实验动物使用指南（http://www.iclas.org），并经圣保罗联邦大学研究伦理委员会批准（CEUA 2019/ 9292090519）。
1. 小鼠脑组织解剖
- 将 10 mL 冷的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）转移至一个 100 mm 培养皿中，并将 1 mL 转移至一个 1.5 mL 微量离心管中。每只动物准备一个微量离心管。
注意：培养皿和微量离心管均需置于冰上保存。 - 使用 DMEM/F12 培养基配制星形胶质细胞培养液，添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% 谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（P/S）。使用 0.2 µm 滤器过滤培养基以实现灭菌。
- 使用锋利的手术剪通过断头法处死出生后第 1 天的 C57Bl/6 小鼠幼崽。用镊子拉开皮肤，暴露颅骨。确保手术剪和镊子均已用 70% 乙醇灭菌。
- 使用锋利的弯头剪刀沿矢状面从枕骨大孔向头顶方向剪开颅骨。
注意：务必避免损伤脑组织。 - 使用先前经 70% 乙醇灭菌的刮铲，将脑组织从颅腔中取出，并放入含有 10 mL 冷 HBSS 的培养皿中。
- 将盛有脑组织的培养皿置于体视显微镜下，使用两把钝头镊子去除脑表面的脑膜（图 1）。
- 用刮铲轻轻将大脑皮层....
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结果
本研究旨在利用3D生物打印技术，通过逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水，构建类神经组织。星形胶质细胞从小鼠幼崽的大脑皮层中提取并分离（图1），随后加入生物材料混合物中，从而实现活体3D结构的生物制造。
采用 G 代码（补充文件）设计计算机辅助设计（CAD）模型，构建一个正方形（0.6 × 0.6 mm）互连框架结构，孔径为 1 mm，旨在促进营养物质和氧气的扩散。该框架由 6 层叠加组成，每层之间旋转 90°（图 2A i）。所设计的结构高度约为 5 mm（图 2A ii），便于组织操作。生物墨水的组成还支持制造不同形状的结构（图 2B）。
由明胶、GelMA.......
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讨论
3D生物打印技术作为一种生物制造新方法应运而生，可构建在结构和生理功能上均接近天然组织的精细结构22，包括大脑23类神经组织的生物制造使得 体外 原生微环境建模，作为理解与中枢神经系统疾病发生及治疗相关的细胞与分子机制的重要工具11由于胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮层星形胶质细胞已被广泛应用于诸多研究中，例如脑发育研究24生物分子运输25，神经突起生长26以及类脑组织的生物制造14.
先前已报道了使用不同生物材料和支架技术构建星形胶质细胞三维培养的方法27,28,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP）资助，资助编号为 2018/23039-3 和 2018/12605-8；科学技术发展国家理事会（CNPq），资助编号为 465656/2014-5 和 309679/2018-4；以及高等教育人员改进协调机构（CAPES），财务代码 001。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 生物打印机 | 3D Biotechnology Solutions | 基于挤出式的生物打印机 | |
| 钝头镊子 | Integra Miltex | 6--30 | 用于脑组织解剖的镊子，已预先灭菌 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | 无蛋白酶、无脂肪酸、基本无球蛋白 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| 细胞培养瓶 | Fisher Scientific | 156340 | T25 培养瓶 |
| 细胞筛 | Corning Incorporated | 352340 | 40 µm 细胞筛 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | 配备 Olympus FluoView 300 共聚焦系统的共聚焦 TCS SP8 显微镜 | |
| 锥形离心管 | Thermo Scientific | 339651, 339652 | 15 mL 和 50 mL 无菌离心管 |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI 染色液 |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50，1X（Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 50/50 混合液），含 L-谷氨酰胺 |
| 透析管 | Sigma-Aldrich | D9527 | 截留分子量 = 14 kDa |
| 乙醇 | Fisher Scientific | 64-15-5 | 试剂级 |
| 胎牛血清 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | 研究级 |
| 纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | 来自牛血浆的结晶粉末状纤维蛋白原 |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | 来自猪皮的明胶粉末 |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | 甘氨酸粉末 |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | 无钙、无镁、无酚红 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-谷氨酰胺结晶粉末 |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | 层粘连蛋白 1-2 mg/mL L，溶于 50 mM Tris-HCl |
| 活死细胞成像试剂盒 | Thermo Scientific | R37601 | 活细胞中呈绿色荧光（激发/发射 488 nm/515 nm）；死细胞中呈红色荧光（激发/发射 570 nm/602 nm） |
| 甲基丙烯酸酐 | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | 用于 GelMA 制备 |
| 微量离心管 | Corning Incorporated | MCT-150-C | 1.5 mL 微量离心管 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 22G 针头 | Fisher Scientific | NC1362045 | 无菌钝头针 |
| 手术剪 | Integra Miltex | 05--02 | 用于脑组织解剖的锋利剪刀，已预先灭菌 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | 多聚甲醛粉末 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | 青霉素-链霉素（5,000 单位/mL 青霉素；5,000 µg/mL 链霉素） |
| 培养皿 | Corning Incorporated | 430591, 430588 | 35 mm 和 100 mm 无菌培养皿 |
| 鬼笔环肽 | Abcam | ab176753 | iFluor 488 试剂 |
| 光引发剂 | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1×，细胞培养级，无钙、无镁 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | 聚-L-赖氨酸氢溴化物，分子量 30,000–70,000 |
| 一抗 | Abcam | ab4674 | 鸡源多克隆抗 GFAP 抗体 |
| 二抗 | Abcam | ab150176 | Alexa Fluor 594 标记抗鸡抗体 |
| 刮铲 | Miltex | V973-70 | 24 号水泥刮铲，已预先灭菌 |
| 体视显微镜 | Fisherbrand | 3000038 | 用于脑组织解剖的显微镜 |
| 5 mL 注射器 | BD | 1222C84 | 无菌注射器 |
| 2 µm 注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-740-105 | 聚丙烯滤膜，用于灭菌 |
| 凝血酶 | Sigma-Aldrich | 9002--04-4 | 来自牛血浆的结晶粉末状凝血酶 |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | 实验室级 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | 无酚红胰蛋白酶，以 PBS 稀释至 1× |
| Versene 溶液 | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene 溶液（0.48 mM），配方为每升 PBS 含 0.2 g EDTA(Na4) |
| 多孔板 | Thermo Scientific | 144530 | 无菌 24 孔板 |
参考文献
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7
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