一种优化的O9-1/水凝胶系统用于研究神经嵴细胞中的机械信号

摘要

此处详细描述了研究机械信号的分步实验方案 体外 使用多能性O9-1神经嵴细胞和不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶。

摘要

神经嵴细胞（NCCs）是脊椎动物胚胎中具有多向分化潜能的细胞，能够迁移并分化为多种细胞类型，进而形成多种器官和组织。组织硬度产生的机械力作为一种物理信号，在NCC分化过程中发挥关键作用，但其作用机制尚不明确。本文所述方法详细介绍了如何优化制备不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶，准确测定其硬度，并评估机械信号对O9-1细胞（一种模拟NCC的细胞系）的影响 体内 NCCs

水凝胶刚度采用原子力显微镜（AFM）进行测量，并据此显示出不同的刚度水平。在不同刚度的水凝胶上培养的O9-1神经嵴细胞表现出不同的细胞形态以及应激纤维相关基因的表达差异，表明机械信号变化引发了不同的生物学效应。此外，该结果证实调节水凝胶刚度可实现有效的 体外 通过改变凝胶刚度并分析神经嵴细胞（NCCs）中分子与遗传调控，来操控机械信号传导的系统。在相应分化培养基的影响下，O9-1 NCCs 可分化为多种细胞类型，且便于化学信号的操控 体外因此，这 体外 该系统是研究机械信号在神经嵴细胞（NCCs）中的作用及其与化学信号相互作用的强大工具，将有助于研究人员更深入地理解神经嵴发育及相关疾病的分子与遗传机制。

引言

神经嵴细胞（NCCs）是一类在脊椎动物胚胎发育过程中存在的干细胞，具有显著的迁移能力，并参与多种器官和组织的发育。NCCs 可分化为多种不同类型的细胞，包括感觉神经元、软骨、骨、黑色素细胞和平滑肌细胞，其分化命运取决于神经嵴细胞的轴向起源位置以及局部微环境的引导作用^1,2。由于 NCCs 具有向多种细胞类型分化的潜能，因此在神经嵴（NC）发育的任何阶段发生导致调控异常的遗传缺陷，都可能引发多种先天性疾病²。例如，在 NCCs 的形成、迁移和发育过程中出现干扰，会导致一组统称为神经嵴病（neurocristopathies）的发育障碍^1,3。这些疾病包括因 NCCs 形成失败而导致的颅面畸形，如 Treacher Collins 综合征；也包括由于 NCCs 具有转移性迁移能力而引发的多种癌症，例如黑色素瘤^3,4,5,6。在过去的几十年中，研究人员对 NCCs 在发育和疾病中的作用及其机制取得了显著进....

方案

1. 水凝胶制备

注意：所有步骤必须在细胞培养罩内进行，使用前需用乙醇消毒并经紫外线（UV）灭菌，以维持无菌环境。工具（如镊子和移液器）必须用乙醇喷洒处理。缓冲液也必须经过无菌过滤。

1. 氨基硅烷涂层玻璃盖玻片的制备
   1. 将所需数量的玻璃盖玻片放置在一张实验室擦拭纸上。
      注意：额外准备3–4个盖玻片，以确保有足够的备用，因为它们容易破碎。不同材质的玻璃盖玻片在细胞接种和贴附方面表现出不同的兼容性。建议在开始实验前确定最适合实验的类型（参见材料表）。
   2. 使用酒精灯或本生灯，将每个盖玻片在火焰中来回通过（蛋白测定实验需30秒），以进行灭菌。将每个玻璃盖玻片放置在实验室擦拭纸上冷却。
   3. 待玻璃盖玻片冷却后，将其转移至铺有Parafilm的培养皿中，以防滑动。
      注意：如果盖玻片未充分冷却，残留热量会将Parafilm熔化并粘附在盖玻片上，导致其无法使用。
   4. 分别向12 mm和25 mm的盖玻片上覆盖约200 μL和800 μL的0.1 M NaOH，并静置5分钟。随后吸除0.1 M NaOH，让盖玻片再自然干燥5分钟，以形成均匀的薄膜。
   5. 盖玻片干燥后，分别向12 mm和25 mm的盖玻片上加入约80 μL和150 μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）。注意避免溶液溢出至Parafilm上。让溶....

结果

水凝胶制备及通过原子力显微镜与赫兹模型评估其刚度
在此，提供了一种通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例来制备不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶的详细实验方案。然而，由于缺乏细胞外基质（ECM）蛋白，聚丙烯酰胺水凝胶尚不能支持细胞黏附。因此，需使用磺基-SANPAH作为交联剂，使其共价结合至水凝胶，并与ECM蛋白中的伯胺基团发生反应，从而实现ECM蛋白通过共价连接固定于水凝胶表面 N-sulfo-SANPAH 经紫外线活化后生成的羟基琥珀酰亚胺酯。选用 I 型胶原蛋白作为细胞外基质蛋白，以有效促进 O9-1 细胞的黏附。为确保不同水凝胶的刚度值准确，采用原子力显微镜（AFM）进行刚度评估，该技术常用于测定弹性模量。

聚丙烯酰胺凝胶成功形成并牢固附着于玻璃盖玻片后，凝胶表面均匀，无明显撕裂，且与盖玻片保持良好粘附。通过原子力显微镜（AFM）采用压痕技术原理测定凝胶刚度，该方法使用刚性压头对样品施加特定作用力，以达到所需的压痕深度²⁶。基于赫兹模型（Hertz's model）这一弹性理论，结合.......

讨论

本研究的目的是 提供一种有效且高效的方法 体外 系统以更好地理解机械信号对神经嵴细胞（NCCs）的影响。除了遵循上述分步实验方案外，研究人员还需注意，O9-1 NCCs的细胞培养会受到用于制备水凝胶的玻璃盖玻片类型的影响。例如，有研究发现，在特定类型的玻璃盖玻片上接种的细胞（参见 材料表) 存活并增殖良好，而在其他类型玻璃盖玻片上接种的培养细胞则表现出更多的细胞死亡。此外，严格遵循O9-1 NCCs的正确细胞培养条件至关重要³⁸当水凝胶尽快使用或在无菌的37 °C培养箱中储存不超过两天时，细胞培养的质量最佳。

由于该实验方案中每个组分的敏感性，弹性模量在不同实验之间可能存在差异。除了方案中提到的关于10% APS（步骤1.3.2）的注意事项外，还有其他关键因素会影响这种变异性。另一个被怀疑导致原子力显微镜（AFM）测量结果出现较大差异的因素是水凝胶的厚度。先前一项研究探讨了厚度对杨氏模量的影响，厚度范围从15到1000 µm，结果发现厚度差异并未显著改变杨氏模量

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-012
2% 双丙烯酰胺	Sigma Aldrich	M1533
24 孔板	Greiner Bio-one	662165
25 mm #1 Corning 0211 玻璃盖玻片	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-025
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS）	Sigma Aldrich	A3648
4 孔细胞培养板	Thermo Scientific	179830
4% 多聚甲醛	Sigma Aldrich	J61899-AP
40% 丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A4058
50% 戊二醛	Sigma Aldrich	G7651
6 孔细胞培养板	Greiner Bio-one	657160
原子力显微镜悬臂梁（球形微珠）	Novascan
原子力显微镜软件	Catalyst NanoScope		型号：8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher	A12379
过硫酸铵（APS）	Sigma Aldrich	248614	粉末
抗 AP-2α 抗体	Santa Cruz	sc-12726
抗连环蛋白抗体	Abcam	ab129002
原子力显微镜（AFM）Bioscope Catalyst	Bruker Corporation
I 型胶原蛋白（100 mg）	Corning	354236
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）	Thermo Fisher	D1306
二氯甲基硅烷（DCMS）	Sigma Aldrich	440272
驴血清	Sigma Aldrich	D9663
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	10-017-CV
胎牛血清（FBS）	Corning	35-010-CV
荧光显微镜	Leica		型号 DMi8
Fluoromount-G 封片剂	SouthernBiotech	0100-35
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	粉末
马血清	Corning	35-030-CI
iScript 反转录超级混合液	Bio-Rad	1708841
青霉素-链霉素抗生素	Thermo Fisher	15140148
RNeasy 微量试剂盒	Qiagen	74004
无菌 1× PBS	Hyclone	SH30256.02
无菌去离子水	Hardy Diagnostics	U284
sulfo-SANPAH	Thermo Fisher	22589
SYBR Green	Applied Biosystems	4472908
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416