肝脏疾病可由多种原因引发，导致纤维化或肝硬化。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺，必须探索替代方案。我们的研究提出在动物模型的肝组织中植入胶原支架。
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摘要
摘要
肝脏疾病是全球范围内的首要致死原因。过量饮酒、高脂饮食以及丙型肝炎病毒感染可促进肝纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌的发生。在疾病晚期，临床推荐的治疗方案是肝移植，以改善并延长患者寿命。然而，仅有10%的移植手术能够成功，器官可获得性、术前及术后操作流程以及高昂的费用均与该结果直接相关。细胞外基质（ECM）支架已作为一种组织修复的替代方案出现。这些生物材料的主要优势在于其良好的生物相容性和移植物接受度。尽管已在肝切除模型中评估了恢复肝脏大小和正常功能的能力，但尚未评估使用支架或其他类型支撑结构来替代被切除肝组织体积的效果。
在大鼠肝脏中进行了部分肝切除术，并移植了来自牛髁突的胶原基质支架（CMS）。切除了左侧肝叶组织（约40%），并以相同比例外科植入CMS。术前和术后均评估了肝功能检测指标。术后第3、14和21天，处死动物并进行大体及组织学评估。在第3天和第14天，观察到CMS周围存在脂肪组织，无临床排斥或感染迹象；至第21天可见新生血管形成及CMS被重新吸收。苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色显示炎症反应极轻微，并可见邻近细胞向CMS迁移。结果表明，CMS在肝组织中表现良好，可能成为研究慢性肝病组织再生与修复的有用替代方法。
引言
肝脏是维持体内稳态和蛋白质合成最重要的器官之一1。然而，肝病是全球范围内导致死亡的主要原因。在肝损伤的晚期阶段，包括肝硬化和肝细胞癌，临床推荐的治疗方法是肝移植。但由于供体稀缺且移植成功率较低，组织工程（TE）和再生医学（RM）领域已开发出新的技术2,3。
组织工程（TE）涉及利用干细胞、支架材料和生长因子4，以促进炎症性、纤维化及水肿器官和组织的修复1,5,6。支架中所用的生物材料可模拟天然细胞外基质（ECM），为细胞的定向重塑提供物理、化学和生物学信号7。胶原蛋白是从真皮、肌腱、肠道和心包组织中提取的最丰富的蛋白质之一8,9。此外，胶原蛋白可作为生物聚合物，通过生物打印或静电纺丝技术制备二维和三维支架10,11。本研究团队是首个报道使用骨源性胶原蛋白用于肝组织再生的研究。另一项研究报道了使用从牛皮中提取的牛胶原蛋白合成的支架，其孔隙均匀且紧密排列，但彼此之间无连通性12。
脱细胞化可保留天然的细胞外基质（ECM），从而允许后续引入具有干细胞潜能的细胞13,14。然而，该技术在小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、牛和马的肝脏、心脏、肾脏、小肠及膀胱中仍处于实验阶段3,14。目前，在任何动物肝切除模型中，被切除的肝组织体积均未得到替代。然而，使用额外的支撑结构或网络（生物材料）以促进细胞增殖和血管生成，可能对肝脏实质功能的快速恢复至关重要。因此，支架材料可作为再生或修复慢性肝病组织的替代策略，进而克服供体短缺以及肝移植临床并发症所带来的局限性。
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方案
本研究经墨西哥国立自治大学（UNAM）医学院伦理委员会（DI/115/2015）和墨西哥总医院伦理委员会（CI/314/15）批准。该机构符合有关实验动物生产、饲养和使用的全部技术规范，并依据国家法规（NOM-062-ZOO-1999）获得合法认证。本研究使用的雄性Wistar大鼠体重为150–250 g（6–8周龄），均来自墨西哥国立自治大学（UNAM）医学院实验动物中心。
1. 从牛股骨中获取胶原基质支架
- 从经墨西哥卫生和农业部门认证的屠宰场获取牛股骨髁。
- 使用外科器械仔细分离髁上的脂肪、肌肉和软骨。使用切割锯将髁组织切成 3 cm × 3 cm 的片段，并用毛巾清除脂肪和血液。用清水冲洗髁片段。
- 将片段置于 1 L 阴离子洗涤剂（10 g/L）中煮沸（92 °C）30 分钟。用清水洗涤髁片段两次，以彻底去除残留的阴离子洗涤剂。
- 使用滤纸（0.5 mm）干燥髁片段 3 小时。
- 从步骤 1.1 中所述的片段制备尺寸为三角形（1 cm × 1 cm × 1 cm）、厚度为 0.5 cm 的脱细胞骨基质（CMS）（图 1A）。
- 将片段置于 100 mL 的 0.5 M 盐酸（HCl）中，持续振荡脱矿 10 分钟。移除 HCl。
注意：使用氢氧化钠（10 M）中和残余 HCl。 - 每次用 100 mL 蒸馏水冲洗片段，持续振荡 15 分钟，共冲洗三次。使用滤纸（0.5 mm）干燥 CMS 1 小时。
- 使用体视显微镜15分析 CMS 的结构特性（孔径大小、孔隙形成及孔隙连通性）（图 1B）。
- 使用扫描电子显微镜16分析 CMS 小梁的粗糙表面（图 1C）。
- 使用解剖器械进行揉捏和拉伸，评估 CMS 的力学性能变化（可塑性和柔韧性）（图 1D）。
- 将 CMS 装入灭菌袋中，采用过氧化氢等离子体灭菌 38 分钟。将灭菌后的 CMS 保存在原包装中，置于干燥环境，温度保持在 20–25 °C，直至使用。
- 将片段置于 100 mL 的 0.5 M 盐酸（HCl）中，持续振荡脱矿 10 分钟。移除 HCl。
2. 手术区域的准备以及动物模型的处理与准备
- 用2%氯己定溶液对术区、工作台、显微外科手术显微镜及座椅进行消毒。所有手术器械、手术海绵、棉拭子和一次性手术单均通过热力灭菌（121 °C/30 min/100 kPa）进行灭菌。
- 将大鼠（n=5）分为三组，每组五只：1. 假手术组，2. 肝切除组，3. 肝切除联合慢性束缚应激（CMS）组，并于第3天、第14天和第21天对各组进行观察。
- 在后肢肌肉注射氯胺酮（35 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）。
注意：镇静期通常持续 30-40 分钟。 - 使用手术皂和双刃刀片剃除腹部皮肤（5 cm × 2 cm），并用局部10%聚维碘酮溶液进行三次皮肤消毒 轮次17.
- 将动物置于俯卧位的温热板上，颈部过度伸展以保持气道通畅（图2).
- 通过呼吸模式及四肢退缩反射的消失来评估麻醉深度。
- 在剃净毛发的皮肤周围铺一次性手术巾，以剑突为参考点，在白线处用手术刀做一2.5 cm切口。注意避开腹壁血管，以防出血。
- 放置腹部牵开器，观察腹腔。使用解剖镊夹取左肝叶并置于金属板上（图3A).
注意：假手术组仅分离左肝叶，随后将肝脏放回腹腔。使用3-0尼龙缝线缝合腹壁和皮肤。 - 在有或无 CMS 的实验组中，使用手术刀片和无菌手术刀片（#15）进行两次切割，完成约 40% 的肝切除术。使用三角形金属模板（1 cm × 1 cm × 1 cm）执行肝切除术图3B).
- 为防止肝脏出血，用纱布在肝脏边缘施加手术压迫，持续5分钟。
- 在手术前，将 CMS 浸入无菌生理盐水中水化 20 分钟。将 CMS 植入肝切除部位，并在肝组织与 CMS 之间使用四针缝线固定，以防止生物材料移位。使用 7-0 不可吸收聚丙烯缝线（图3C).
注意：无需通过二次手术移除缝线；缝线可作为参考标记，用于识别 CMS 植入部位。 - 将肝脏放回腹腔，使用3-0尼龙缝线缝合腹壁和皮肤。用浸有外科碘的海绵对手术切口进行两轮清洁。观察并监测动物的生命体征。
- 在后肢肌肉注射氯胺酮（35 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）。
3. 术后护理
- 在后肢肌肉注射美格鲁米宁氟尼辛（2.5 mg/kg）。镇痛药物的使用需经机构动物护理与使用委员会批准。
- 麻醉恢复期间，将动物置于带有实验动物垫料的单独聚碳酸酯盒中，放置于温度可控（23 °C）、无噪音的环境中。
- 观察动物恢复情况，并监测其2小时内饮水和进食情况。术后监测应遵循机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。
4. 血清中肝功能的评估
- 在手术前（基线值）以及第3、14和21天，从麻醉后的 动物侧尾静脉采集血液样本（500 µL）。
- 将血液样本在室温（23 °C）下以850 × g 离心10分钟；分离血清并储存在-80°C，直至使用。
- 进行一组肝功能检测：血清白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TB）和直接胆红素（DB）（表1）。
5. 安乐死与组织处理
- 按照上述方案，在每次评估时（第3、14和21天）对动物进行麻醉 。
- 采用机构动物护理与使用委员会批准的方法实施安乐死。
- 使用手术刀在白线处做一5-6 cm的切口，以观察腹腔器官，并对假手术组和实验组有无CMS的肝切除区域进行拍照。
- 从所有研究组动物中采集肝组织样本（2 cm × 2 cm；0.40–0.45 g），置于4%甲醛溶液中固定24小时，用于后续组织学评估。
6. 组织学分析
- 将肝组织置于4%甲醛中固定，并使用一系列浓度的酒精（60%、70%、80%、90%、100%）进行脱水处理；随后将组织置于二甲苯中（1小时），并包埋于石蜡中16。
- 使用切片机将石蜡包埋块切成4 µm厚的切片，用于制备八张载玻片。
- 进行苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色16。
- 在光学显微镜下观察染色切片，选择含有和不含有中央静脉周围肝窦阻塞综合征（CMS）的代表性肝组织区域。以4倍、10倍和40倍放大倍数获取显微图像，并使用适当的软件对图像进行处理18 （参见材料表）。
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结果
骨脱矿会改变髓腔支架（CMS）的力学性能，但不会改变其孔隙的原始形态或相互连通的结构。 CMS 可以具有任意形状，因此可根据所选器官或组织的大小和形状进行调整19。在本实验方案中，我们使用了三角形的 CMS（图 1A-D）。采用大鼠模型评估 CMS 异种移植体在肝脏中的再生能力。尽管肝脏是一种脆软的器官，但本方案中实施的手术操作确保了 CMS 能够稳定固定（图 2 和 图 3A-C）。切除左叶 40% 的肝组织可使部分器官用于评估，同时保持其余肝脏组织完整，从而能够比较植入物与天然实质组织的变化。此外，我们采集了血液样本，以评估 CMS 植入前后肝脏功能的变化。
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讨论
对于肝纤维化或肝硬化患者，器官移植是主要的治疗手段。然而，仅有少数患者能够从该手术中获益，因此有必要为等待移植的患者提供其他治疗替代方案。组织工程是一种具有前景的策略，其利用具有再生潜能的支架和细胞2,4,13。在该操作过程中，切除部分肝脏是一个关键步骤，因为肝脏作为高度血管化的器官，极易发生大量出血。因此，必须对术区进行止血处理，以防止此类并发症的发生。此外，为确保组织与生物材料之间的相互作用，需将肝组织与CMS（细胞基质支架）进行固定连接，这一过程通常借助缝合线来实现。然而，操作时必须格外谨慎，以避免撕裂肝组织并引发术后出血。
尽管本文提出的生物材料来源于牛（异种源），但尚无关于该生物材料在大鼠体内反应的数据，这使得选择性肝切除成为可能。相比之下，2/3肝切除模型已被证明会因切除大量肝组织而导致动物死亡14。此外，由于在肝切除和CMS操作中难以标...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。Benjamín León-Mancilla 是墨西哥国立自治大学（Universidad Nacional Autónoma de México，UNAM）生物医学科学博士项目的一名博士生，并获得了 DGAPA-UNAM 奖学金。
致谢
作者感谢实验医学科实验动物设施的工作人员、护士Carolina Baños G.在技术和手术方面的支持、Marco E. Gudiño Z.在显微摄影方面的协助，以及Erick Apo在肝脏组织学方面的帮助。本研究由国家科学技术委员会（CONACyT）资助，项目编号SALUD-2016-272579，以及PAPIIT-UNAM TA200515项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阴离子去垢剂 | Alconox | Z273228 | |
| 活检包埋盒 | Leica | 3802453 | |
| 相机 DMX | 尼康 | DXM1200F | |
| 离心 | Eppendorf | 5424 | |
| 葡萄糖酸氯己定 4% | BD | 372412 | |
| 25 mm × 40 mm 盖玻片 | 康宁 | 2980-224 | |
| 伊红 | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| 乙醇，纯品 | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| 氟尼辛葡甲胺 | 默克密理博（Merck Millipore） | Q-0273-035 | |
| 75 mm × 25 mm 玻片 | 康宁 | 101081022 | |
| 苏木精 | 默克 | H9627 | CAS 571-28-2 |
| 盐酸 37% | 默克 | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| 氯胺酮 | 比萨农业 | Q-7833-028 | |
| 光学显微镜 | 尼康 | Microphoto-FXA | |
| 显微外科立体显微镜 | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer 黄色盖帽管 | 贝克顿·迪金森 | 365967 | |
| 切片机 | Leica | RM2125 | |
| 模式动物：Wistar大鼠 | 国立自治大学ónoma de México | ||
| 尼龙3-0（Dermalon） | Covidien | 1750-41 | |
| 聚丙烯 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| 10% 聚维酮碘皮肤溶液 | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| 扫描电子显微镜 | Zeiss | DSM-950 | |
| 氢氧化钠，颗粒 | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| 软件 ACT-1 | 尼康 | 版本 2.70 | |
| 体视显微镜 | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | 强生公司 | 99970 | |
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | |
| 1 mL 带针注射器（27G × 13 mm） | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| 组织处理仪（Histokinette） | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5（组织包埋仪） | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| 三色染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 分析仪 | 贝克曼库尔特 | BC 200-10 | |
| 赛拉嗪 | 比萨农业畜牧业 | Q-7833-099 | |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
参考文献
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