我们改进了Marmarou落锤模型，用于成年斑马鱼，以研究钝力性创伤性脑损伤（TBI）后多种病理变化以及继发性神经元再生的潜在机制。该钝力性TBI模型具有可扩展性，可诱导轻度、中度或重度TBI，并重现了人类TBI中观察到的损伤异质性。
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摘要
摘要
钝性创伤性脑损伤（TBI）是最常见的头部外伤形式，其严重程度不一，并导致复杂且异质性的继发性损伤效应。尽管在人类中尚无机制能够替代或再生TBI后丢失的神经元，斑马鱼却具备在整个身体包括大脑中再生神经元的能力。为了研究斑马鱼在遭受钝性TBI后表现出的病理特征，并探索其后续神经再生反应的潜在机制，我们对常用于啮齿类动物的Marmarou落锤装置进行了改良，使其适用于成年斑马鱼。我们这一简单的钝性TBI模型具有可调节性，可诱导轻度、中度或重度TBI，并重现了人类TBI后多种表型特征，如接触性与创伤后癫痫发作、脑水肿、硬膜下及脑内血肿以及认知功能障碍，这些表型均随损伤严重程度而变化。TBI的继发性病变在损伤后数分钟内开始出现，但在伤后7天内逐渐消退并恢复至接近未损伤对照组水平。再生过程最早在损伤后48小时（hpi）启动，细胞增殖高峰出现在60 hpi。因此，我们的斑马鱼钝性TBI模型可产生与人类TBI相似的典型原发性和继发性损伤病理，为研究疾病的发生发展过程以及斑马鱼特有的神经元再生机制提供了有效平台。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是全球性的健康危机，也是导致死亡和残疾的主要原因。在美国，每年约有290万人经历一次TBI，2006年至2014年间，由TBI或TBI后遗症导致的死亡率上升了50%以上1。然而，由于损伤机制（MOI）的不同，TBI在病因、病理和临床表现上存在显著差异，而损伤机制也影响着治疗策略和预后判断2。尽管TBI可由多种损伤机制引起，但主要分为穿透性损伤和钝性损伤两类。穿透性损伤占TBI的较小比例，通常造成严重的局灶性损伤，局限于受刺入及周围脑区3。相比之下，钝性TBI在普通人群中更为常见，严重程度涵盖轻度、中度和重度，造成弥散性、异质性和全局性的脑损伤，影响多个脑区1,4,5。
斑马鱼（Danio rerio）已被用于研究涵盖中枢神经系统（CNS）的多种神经损伤6,7,8,9
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方案
斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本手稿中描述的方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 创伤性脑损伤模型
- 向1 L系统水（1 L去离子反渗透水中加入60 mg Instant Ocean）中加入1 mL 2-苯氧基乙醇。
- 准备一个充氧恢复水箱，内含2 L室温的系统水。
- 选择所需质量的钢珠轴承以及所需长度和直径的钢/塑料管，测定能量和冲击力。
注意：导管的内径应确保钢珠能够通过，且不改变其运动路径或速度。- 测定撞击时的动能：
其中， KE = 动能， m = 质量（单位：kg）， g = 重力， h = 从下落点到鱼的垂直高度（单位：m）
注意：此值提供以 J 为单位的动能。将该数值乘以 1,000 可换算为 mJ。 KE 基于一个加速运动的物体，即当滚珠轴承从静止位置下落时所发生的运动。 - ....
- 测定撞击时的动能：
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结果
制备损伤诱导装置可为成年斑马鱼提供一种快速且简便的可调节钝力性创伤性脑损伤（TBI）造模方法。该损伤模型的分级严重程度提供了若干易于识别的损伤成功指标，其中血管损伤是最容易观察且最显著的病理特征之一（图3）。所使用的斑马鱼品系可能影响该指标的识别难易程度。使用野生型AB鱼（WTAB，图3A–D）时，由于体表色素沉着，轻度TBI（miTBI）或中度TBI（moTBI）与未损伤对照鱼之间的血管损伤较难区分（图3A–C）。损伤后，miTBI鱼仅表现出轻微的体表擦伤（图3B），而moTBI鱼则出现有限的脑出血（图3C）。尽管重度TBI（sTBI）仍具一定挑战性，但其损伤程度通常较为明显（
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讨论
对神经创伤及相关继发性病变的研究长期以来主要集中于传统的非再生性啮齿类动物模型20。直到最近，才有一些研究将多种中枢神经系统损伤形式应用于具有再生能力的模型9,11,13,14,21。尽管这些研究提供了有价值的见解，但其局限性在于所采用的损伤方式在人类群体中并不常见（如穿透性创伤、化学消融、爆炸伤），和/或损伤程度难以量化，因此无法充分反映人类群体中与严重程度相关的病理异质性22,23,24,25。本文提出一种损伤.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Hyde实验室成员的深入讨论，感谢圣母大学Freimann生命科学中心技术人员在斑马鱼饲养与管理方面的支持，以及圣母大学光学显微镜核心设施/NDIIF提供仪器使用及相关服务。本研究得到了圣母大学斑马鱼研究中心、圣母大学干细胞与再生医学中心的支持，并获得美国国立卫生研究院国家眼科研究所R01-EY018417（DRH）、美国国家科学基金会研究生研究基金项目（JTH）、圣母大学LTC Neil Hyland奖学金（JTH）、自由卫士奖学金（JTH）和Pat Tillman奖学金（JTH）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-苯氧基乙醇 | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 号霰弹 | Remington | RMS23770 | 用于中度创伤性脑损伤（sTBI）的 3.3g 重物 |
| #3 号霰弹 | Remington | RMS23776 | 用于轻度/中度创伤性脑损伤（miTBI/moTBI）的 1.5g 重物 |
| #5 Dumont 镊子 | WPI | 14098 | |
| 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷 | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5 ml 玻璃小瓶 | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU 细胞增殖检测试剂盒 | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12 孔板 | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean 人工海水 | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super Frost 带正电荷载玻片 | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen 液体阻断笔 | Ted Pella | 22309 | |
| 组织冷冻介质 | VWR | 15148-031 |
参考文献
- Centers for Disease Control and Prevention. Surveillance Report of Traumatic Brain Injury-related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths-United States, 2014. Centers for Disease Control and Prevention, U.S. Department of Health and Human Services. , (2019).
- Galgano, M., et al.
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