本方案介绍了在淡水涡虫地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）中分离卵巢的步骤。分离得到的卵巢可用于抗体免疫染色以及透射电子显微镜下的超微结构分析，以研究卵母细胞和体细胞的细胞生物学，其成像深度和质量是以往难以达到的。
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摘要
摘要
生殖细胞的可及性使得研究生殖细胞发育、减数分裂和重组成为可能。淡水涡虫Schmidtea mediterranea的有性生物型是研究生殖细胞表观遗传特化的有力无脊椎动物模型。与数量众多的精巢和雄性生殖细胞不同，涡虫的卵母细胞相对难以定位和观察，因为仅有两个卵巢，每个卵巢包含5-20个卵母细胞。此外，卵巢在涡虫体内位置较深，且缺乏保护性的上皮组织，这使得直接解剖涡虫卵巢具有挑战性。
本方案采用短暂的固定步骤，以促进涡虫卵巢的定位和解剖，从而克服上述困难，便于后续分析。所分离的卵巢适用于透射电子显微镜（TEM）进行超微结构观察以及抗体免疫染色。本方案中所述的解剖技术还可用于基因功能干扰实验，可在不同的RNA干扰（RNAi）条件下观察卵巢。通过本方案直接获取卵巢中完整的生殖细胞，将显著提高成像的深度与质量，并实现对卵母细胞生物学的细胞水平及亚细胞水平的深入研究。
引言
通过透射电子显微镜（TEM），已在多种组织中对涡虫的解剖结构进行了研究1,2,3,4,5,6。然而，对于卵巢或卵母细胞的关注却很少。卵母细胞相关文献的匮乏部分是由于难以获取这些细胞，导致涡虫卵母细胞的生物学特性在很大程度上尚未被探索。分子工具已借助光学显微镜或荧光显微镜揭示了涡虫卵巢发育的多种调控机制 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。所有这些实验均在完整虫体或整条虫体的组织学切片上进行。针对完整虫体的抗体染色和原位杂交实验流程涉及大量的漂白、洗涤和组织透明化步骤，耗时较长，通常需要数天时间。
本方法的总体目标是提供对完整分离的涡虫卵巢和卵母细胞的可及性，从而无需进行漂白或组织学切片，并缩短抗体染色和原位杂交过程中洗涤与组织透明化所需的时间。in situ hybridization。分离的卵巢还可改善探针或抗体的渗透性，提高光学显微镜和电子显微镜的成像深度与图像质量。获得分离的卵巢和卵母细胞后，即可在完整卵母细胞的基础上开展细胞和亚细胞水平的细胞生物学研究。最近一项针对分离涡虫卵巢的研究首次利用透射电子显微镜（TEM）和共聚焦显微镜对涡虫卵母细胞的减数分裂过程进行了表征21。该研究全面描述了减数分裂期间一种新现象——核膜泡化。
本文介绍了涡虫卵巢解剖的详细步骤。固定步骤足以保持卵巢细胞结构的完整性，便于后续解剖及下游操作（例如透射电镜和光学显微镜分析）。鉴于多种扁形动物在身体结构和组织架构上的相似性，本方案对于研究其他多种扁形动物物种（例如三角涡虫属或多肠涡虫属）的卵母细胞及其细胞核也具有广泛的参考价值。然而，由于Macrostomum lignano体型较小且身体几乎透明，可直接观察其卵巢和卵母细胞，因此本方案对其可能并不适用22,23,24。在某些物种中（例如Dugesia ryukyuensis9,25），含有卵巢的体区在光学上更易区分（例如色素较深或较浅），相比之下S. mediterranea则较不明显。对这些物种的研究可较少依赖本文提供的S. mediterranea卵巢定位指导，但仍可借鉴其中的固定与解剖条件。
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方案
1. 准备
- 准备涡虫：每周用有机肝泥喂养两次有性生殖型涡虫，以促使其达到性成熟。
注意：通常，此类蠕虫体长超过1厘米，其生殖孔位于咽部开口的后方。 - 配制溶液。
- 配制以下试剂：16% 多聚甲醛（PFA）；50% 戊二醛（GA）水溶液；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）；1×磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4 和 2 mM KH2PO4。
- 用 PBS 将 50% GA 和 16% PFA 稀释，配制成终浓度为 2.5% GA 和 2% PFA 的混合液。用 PBS 将 16% PFA 稀释至终浓度为 4% PFA。
- 将5 g NAC溶解于100 mL PBS中，配制成5%工作液。
2. 收集卵巢
- 在室温下，用5% NAC处理性成熟的蠕虫，持续5分钟。
注意：较大的蠕虫可能会卷曲。可使用毛刷或移液器吸头将其压平。5% NAC的用量应尽量少，足以覆盖培养皿表面即可。 - 将NAC替换为10 mL新配制的4%多聚甲醛，在室温下固定蠕虫1小时，并间歇性轻轻摇动。在加入4% PFA后10分钟开始解剖操作，并在4% PFA中继续完成解剖过程。
- 观察上皮色素沉着，以定位腹神经索，其表现为从头部脑神经节向尾部延伸的两条色素较浅的条带。
- 定位卵巢。
注意：卵巢位于腹神经索内侧紧邻处（图1A）。依据上皮色素沉着判断卵巢在前后方向上的位置。理想情况下，卵巢区域腹侧上皮的色素较周围区域更浅。在某些蠕虫中，腹侧上皮的色素沉着不足以提供明确判断依据，此类样本可予以弃用，因其可能卵巢发育不良。 - 在通过色素沉着初步确定卵巢位置后，进一步验证其准确性。
注意：首先，卵巢位于头部脑神经节的后方；其次，深色的精巢位于卵巢上方背侧的外侧位置。卵巢位于最前端精巢的前方（图1B）。有时，精巢小叶可能与卵巢处于同一水平或略靠前的位置。 - 使用两把手术刀，在两个卵巢的前后两侧进行切割（图1C），彻底移除前后端的虫体片段。用一把刀固定虫体，另一把刀进行切割操作，并及时清理用于切割的刀具。
- 沿卵巢片段的中线切开，以分离两个卵巢。将组织片段翻转，使腹面朝下。
- 使用两对尖头镊子（型号5-SA）剥离背侧组织，暴露肠道（图1D）。
注意：穹顶状的卵巢位于肠分支下方。 - 用镊子尖端或软毛刷轻轻移除覆盖在腹侧组织上方的肠分支，以暴露卵巢（图1E）。
- 清除周围组织，完整取出卵巢（图1F,G）。
- 将取出的卵巢转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL PBS洗涤。
3. 透射电镜固定
- 用 PBS 轻轻振荡洗涤卵巢 10 分钟。保持离心管直立，让卵巢依靠重力沉降至管底。重复洗涤一次。
注意：如果卵巢未沉降，可使用小型台式离心机以不超过 2000 × g 的速度轻轻离心 15 秒。 - 将 PBS 替换为 2% 多聚甲醛/2.5% 戊二醛/PBS 固定液。
- 在室温下，以 40 rpm 的振荡速度固定样品 1 小时。
- 将样品置于固定液中，于 4 °C 过夜，以 40 rpm 振荡保存。
4. 透射电镜样品处理
- 用 PBS 清洗卵巢，每次 10 分钟，共清洗 3 次。
- 用双蒸水（ddH₂O）清洗卵巢2O）每次10分钟，重复3次。
- 用2%的水溶液锇酸固定卵巢4 室温孵育1-2小时，或4 °C过夜。
注意：此步骤中样品容器需用封口膜密封。准备2% OsO₄4 使用经反渗透处理的水（参见 材料表). - 用 ddH₂O 冲洗样品2O 3 次，每次 10 分钟。
- 在4 °C下用2%醋酸铀酰水溶液对卵巢进行过夜预染色。
注意：UA 溶液在使用前需过滤；避免光照 整块 染色。配制 2% OsO4 使用经反渗透处理的水（参见 材料表). - 用ddH₂O冲洗样品2O 4 次，每次轻柔振荡 10 分钟。
- 将卵巢依次置于梯度乙醇中脱水（30%、50%、70%、95% 和 100% 两次，每次 10 分钟），然后在丙烯酸氧化物中孵育两次（每次 10 分钟）进行平衡。
- 用于树脂渗透时，将样品在4 °C下于50%环氧丙烷/50%液态环氧树脂混合液中孵育过夜。随后在温和振荡条件下，用100%环氧树脂分3次更换（每次1小时）对样品进行渗透处理。
- 将卵巢包埋于100%环氧树脂中，并在60 °C下聚合48 h。
5. 超薄切片
- 用光学显微镜进行包埋块修整和样品检查
- 用剃刀将样品包埋块修切成金字塔形状。
- 使用玻璃刀或金刚石刀切出厚度为 1–2 μm 的切片。
- 将切片用一滴水转移至载玻片上，然后将载玻片置于加热板上加热，直至水分蒸发过程中切片展平并粘附于载玻片表面。
- 在切片上滴加一滴 1% 甲苯胺蓝 O 染液，并在加热板上加热约 10 秒。用流水冲洗载玻片，然后使其干燥。在普通光学显微镜下检查切片。
- 超薄切片的切割、收集及后续染色。
- 使用金刚石刀切出厚度为 50–70 nm 的超薄切片。将切片从刀上水槽转移至铜网或单槽铜网上。
- 用 2% 醋酸铀（UA）染色 8 分钟。用流动的去离子水（ddH2O）冲洗铜网 30 秒。
- 用 1% 铅染液染色 6 分钟。用流动的去离子水（ddH2O）冲洗切片 1 分钟，然后自然晾干。
6. 数据收集与分析
- 使用适当的软件收集透射电子显微镜（TEM）数据，例如 Digital Micrograph（详见材料表中的说明）。
- 在80 kV条件下操作电镜。当真空准备就绪后，将样品载网插入电镜中。
- 在菜单中点击Light以开启电子束。调节左侧控制面板上的Intensity旋钮，直至Auto Exposure时间约为1秒。点击Start Acquire以获取最终图像。
- 使用开源的图像处理、建模与显示（IMOD）软件包构建三维电子显微镜（EM）模型。
7. 抗体染色
- 将解剖得到的卵巢（步骤 2.16）置于 1.5 mL 微离心管中，用 1 mL 含 0.5% Triton X-100 的 1× PBS（PBST）清洗。将管子放在摇床上，以 40 rpm 振荡 10 分钟。将管子静置于管架中，使卵巢依靠重力自然沉降。吸除清洗液，加入新鲜 PBST，重复清洗两次。
- 在 PBST 中加入 2 µg/mL 蛋白酶K 和 0.1% 十二烷基硫酸钠，室温消化组织 10 分钟。
- 用 PBST 清洗消化后的卵巢，每次 10 分钟，共清洗三次。
- 用含 10% 马血清的 PBST 室温孵育卵巢 1 小时。
- 将一抗用封闭液（含 0.5% Triton X-100 的 PBS 加 10% 马血清）按 1:100 稀释。将卵巢与一抗在 4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
- 用 PBST 清洗卵巢，每次 10 分钟，共清洗三次。
- 将二抗按 1:300 用封闭液稀释。将卵巢与二抗在 4 °C 轻柔振荡孵育过夜。
- 用 PBST 清洗卵巢三次，确保第一次和第三次清洗各持续 10 分钟；在第二次清洗时，加入 Hoechst 33342 染液（按 1:300 稀释于 PBST 中），室温染色 30 分钟，用于标记卵巢细胞核。
- 将卵巢封片于载玻片上。
注：可使用抗荧光淬灭封片剂以延长荧光信号的持续时间。
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结果
本文所述方法由 Guo 等人21报道。成功解剖的关键在于准确识别卵巢的色素沉积和位置标志。该方法的策略是从较宽泛的位置逐步定位到特定区域。首先，依赖背侧和腹侧的色素分布模式来实现这一目标（图 1A、B）。卵巢位于腹侧色素区域，在经 5% NAC 处理和 4% PFA 固定后，该区域将变为白色。若所使用的线虫未能提供清晰的色素对比，建议更换其他线虫样本。
接下来，逐步修剪去除无关组织（图1C-E）。一旦暴露卵巢（图1E），即可进一步修剪周围组织。所获得的卵巢包含多种体细胞类型，并保持卵巢结构的完整性，可用于超微结构分析（图2，左图）和免疫荧光染色（
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讨论
这些基于固定的扁形虫卵巢解剖方法将有助于理解卵母细胞减数分裂以及卵巢的发育与再生过程。卵母细胞及其体性支持细胞的大小范围为20 µm至50 µm。基于解剖的方法能够获取完整单个卵巢细胞，这是切片或整体染色方法所无法实现的。本方案将有助于在细胞和亚细胞水平上研究完整的扁形虫卵巢解剖结构及卵母细胞生物学。
这些操作需要固定处理，因此将其应用限制在基于PFA的实验中。其他非PFA固定方法（例如，甲醇）也可能适用于卵巢解剖。如果在基因扰动实验中，目标线虫未能发育出适当大小的卵巢，则传统全虫方法可能更受青睐。
该实验方案中最关键的步骤是准确定位卵巢并进行精细解剖。具有发育良好卵巢的性成熟涡虫，其卵巢正下方的腹侧上皮通常色素较浅。该区域大小可在0.2至1 mm之间。成功定位卵巢的比例也取决于涡虫的培养条件。对于持续活跃维持、新近再生或成熟的品系，成功率较高（约100%）。而对于个体大小或健康状况不一的品系，成功率可能较低（10%-50%）。在设计RNAi实验前，必须评估实验种群中具有成熟卵巢的涡虫所占比例。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由霍华德·休斯医学研究所（LK 和 ASA）以及海伦·海·惠特尼基金会（LHG）资助。
本论文的原始数据可从斯托尔斯原始数据仓库获取，网址为 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | EM 级 |
| 2% 水溶液四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19152 | |
| 50% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 16320 | EM 级 |
| Digital Micrograph | Gatan Inc. | 版本 2.33.97.1，用于透射电子显微镜数据采集 | |
| Epon 树脂 | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Embed 812 试剂盒，液态环氧树脂 |
| 乙醇 | Ted Pella | 19207 | 变性 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| 马血清 | Sigma | H1138 | |
| 醋酸铅 | Electron Microscopy Sciences | 6080564 | |
| MilliQ 水 | 经反渗透处理的水 | ||
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A7250 | |
| Parafilm | sigma | P7793 | |
| Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36965 | |
| 环氧丙烷 | Electron Microscopy Sciences | 75569 | EM 级 |
| 蛋白酶 K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| 甲苯胺蓝 O | Electron Microscopy Sciences | 92319 | |
| 透射电子显微镜 | FEI | Tecnai G2 Spirit BioTWIN | |
| 醋酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 541093 |
参考文献
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