涡虫卵巢解剖用于超微结构分析和抗体染色

摘要

本方案介绍了在淡水涡虫地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）中分离卵巢的步骤。分离得到的卵巢可用于抗体免疫染色以及透射电子显微镜下的超微结构分析，以研究卵母细胞和体细胞的细胞生物学，其成像深度和质量是以往难以达到的。

摘要

生殖细胞的可及性使得研究生殖细胞发育、减数分裂和重组成为可能。淡水涡虫Schmidtea mediterranea的有性生物型是研究生殖细胞表观遗传特化的有力无脊椎动物模型。与数量众多的精巢和雄性生殖细胞不同，涡虫的卵母细胞相对难以定位和观察，因为仅有两个卵巢，每个卵巢包含5-20个卵母细胞。此外，卵巢在涡虫体内位置较深，且缺乏保护性的上皮组织，这使得直接解剖涡虫卵巢具有挑战性。

本方案采用短暂的固定步骤，以促进涡虫卵巢的定位和解剖，从而克服上述困难，便于后续分析。所分离的卵巢适用于透射电子显微镜（TEM）进行超微结构观察以及抗体免疫染色。本方案中所述的解剖技术还可用于基因功能干扰实验，可在不同的RNA干扰（RNAi）条件下观察卵巢。通过本方案直接获取卵巢中完整的生殖细胞，将显著提高成像的深度与质量，并实现对卵母细胞生物学的细胞水平及亚细胞水平的深入研究。

引言

通过透射电子显微镜（TEM），已在多种组织中对涡虫的解剖结构进行了研究^1,2,3,4,5,6。然而，对于卵巢或卵母细胞的关注却很少。卵母细胞相关文献的匮乏部分是由于难以获取这些细胞，导致涡虫卵母细胞的生物学特性在很大程度上尚未被探索。分子工具已借助光学显微镜或荧光显微镜揭示了涡虫卵巢发育的多种调控机制 ^{7,8,9,10,11,12,13,14,1....}

方案

1. 准备

1. 准备涡虫：每周用有机肝泥喂养两次有性生殖型涡虫，以促使其达到性成熟。
   注意：通常，此类蠕虫体长超过1厘米，其生殖孔位于咽部开口的后方。
2. 配制溶液。
   1. 配制以下试剂：16% 多聚甲醛（PFA）；50% 戊二醛（GA）水溶液；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）；1×磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na₂HPO4 和 2 mM KH2PO4。
   2. 用 PBS 将 50% GA 和 16% PFA 稀释，配制成终浓度为 2.5% GA 和 2% PFA 的混合液。用 PBS 将 16% PFA 稀释至终浓度为 4% PFA。
   3. 将5 g NAC溶解于100 mL PBS中，配制成5%工作液。

2. 收集卵巢

1. 在室温下，用5% NAC处理性成熟的蠕虫，持续5分钟。
   注意：较大的蠕虫可能会卷曲。可使用毛刷或移液器吸头将其压平。5% NAC的用量应尽量少，足以覆盖培养皿表面即可。
2. 将NAC替换为10 mL新配制的4%多聚甲醛，在室温下固定蠕虫1小时，并间歇性轻轻摇动。在加入4% PFA后10分钟开始解剖操作，并在4% PFA中继续完成解剖过程。
3. 观察上皮色素沉着，以定位腹神经索....

结果

本文所述方法由 Guo 等人²¹报道。成功解剖的关键在于准确识别卵巢的色素沉积和位置标志。该方法的策略是从较宽泛的位置逐步定位到特定区域。首先，依赖背侧和腹侧的色素分布模式来实现这一目标（图 1A、B）。卵巢位于腹侧色素区域，在经 5% NAC 处理和 4% PFA 固定后，该区域将变为白色。若所使用的线虫未能提供清晰的色素对比，建议更换其他线虫样本。

接下来，逐步修剪去除无关组织（图1C-E）。一旦暴露卵巢（图1E），即可进一步修剪周围组织。所获得的卵巢包含多种体细胞类型，并保持卵巢结构的完整性，可用于超微结构分析（图2，左图）和免疫荧光染色（

讨论

这些基于固定的扁形虫卵巢解剖方法将有助于理解卵母细胞减数分裂以及卵巢的发育与再生过程。卵母细胞及其体性支持细胞的大小范围为20 µm至50 µm。基于解剖的方法能够获取完整单个卵巢细胞，这是切片或整体染色方法所无法实现的。本方案将有助于在细胞和亚细胞水平上研究完整的扁形虫卵巢解剖结构及卵母细胞生物学。

这些操作需要固定处理，因此将其应用限制在基于PFA的实验中。其他非PFA固定方法（例如，甲醇）也可能适用于卵巢解剖。如果在基因扰动实验中，目标线虫未能发育出适当大小的卵巢，则传统全虫方法可能更受青睐。

该实验方案中最关键的步骤是准确定位卵巢并进行精细解剖。具有发育良好卵巢的性成熟涡虫，其卵巢正下方的腹侧上皮通常色素较浅。该区域大小可在0.2至1 mm之间。成功定位卵巢的比例也取决于涡虫的培养条件。对于持续活跃维持、新近再生或成熟的品系，成功率较高（约100%）。而对于个体大小或健康状况不一的品系，成功率可能较低（10%-50%）。在设计RNAi实验前，必须评估实验种群中具有成熟卵巢的涡虫所占比例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	EM 级
2% 水溶液四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19152
50% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16320	EM 级
Digital Micrograph	Gatan Inc.		版本 2.33.97.1，用于透射电子显微镜数据采集
Epon 树脂	Electron Microscopy Sciences	14120	Embed 812 试剂盒，液态环氧树脂
乙醇	Ted Pella	19207	变性
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
马血清	Sigma	H1138
醋酸铅	Electron Microscopy Sciences	6080564
MilliQ 水			经反渗透处理的水
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma	A7250
Parafilm	sigma	P7793
Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36965
环氧丙烷	Electron Microscopy Sciences	75569	EM 级
蛋白酶 K	Thermo Fisher Scientific	25530049
甲苯胺蓝 O	Electron Microscopy Sciences	92319
透射电子显微镜	FEI		Tecnai G2 Spirit BioTWIN
醋酸铀酰	Electron Microscopy Sciences	541093