人骨关节炎膝关节组织采集与RNA提取

摘要

通过全膝关节置换术从患者体内获取的原代组织为骨关节炎研究提供了具有最高临床可转化性的实验模型。本方案描述了如何识别、处理并从七种独特的膝关节组织中分离RNA，以支持人类骨关节炎的机制性研究。

摘要

骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，最常累及膝关节。由于目前尚无治愈手段，全膝关节置换术（TKA）是一种常见的外科干预措施。利用从接受TKA的患者中获取的原代人OA组织进行实验，可在体外（ex vivo）研究该疾病的发病机制。尽管过去认为OA主要影响软骨，但现在已知其可累及关节内的多种组织。本方案描述了患者筛选、样本处理、组织匀浆、RNA提取以及来自膝关节七种不同组织的RNA质量控制流程（基于RNA纯度、完整性及得率），以支持对膝关节疾病机制的研究。在获得知情同意后，从接受TKA治疗OA的患者中采集组织样本。组织在术后4小时内进行分离、清洗，并通过速冻保存用于RNA提取，或经甲醛固定用于组织学分析。采集的组织包括关节软骨、软骨下骨、半月板、髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜以及股内侧斜肌。针对每种组织类型分别测试了RNA提取方案。最关键的改进在于针对低细胞、高基质、坚硬组织（即软骨、骨和半月板）与相对高细胞、低基质、柔软组织（即脂肪垫、韧带、滑膜和肌肉）所采用的不同破碎方法。结果表明，粉碎法适用于坚硬组织，而匀浆法则适用于柔软组织。研究发现，某些受试者在多种组织中 consistently 表现出较高的RNA完整性数值（RIN），提示疾病严重程度等潜在因素可能影响RNA质量。从原代人OA组织中成功分离高质量RNA，为开展复杂的基因表达实验（包括测序）提供了具有生理相关性的模型，有助于获得更易于转化至临床应用的研究成果。

引言

膝关节是人体最大的滑膜关节，由胫骨与股骨之间的胫股关节以及髌骨与股骨之间的髌股关节构成¹。膝关节内的骨骼表面覆有关节软骨，并由多种结缔组织（包括半月板、脂肪、韧带和肌肉）提供支持，滑膜包裹整个关节，形成一个充满滑液的腔隙^1,2,3（图1）。健康的膝关节作为一个可活动的铰链关节，能够在冠状面内实现无摩擦运动^1,3。在病理状态下，关节活动可能受限并伴有疼痛。最常见的膝关节退行性疾病是骨关节炎（OA）⁴。已知多种危险因素可增加OA的发生风险，包括高龄、肥胖、女性性别、关节创伤和遗传因素等^5,6。目前美国约有1400万 symptomatic knee OA 患者，且由于人口老龄化和肥胖率上升，其患病率正在持续增加^7,8。OA最初被认为是软骨疾病，但现在....

方案

本研究方案已获得亨利福特医疗系统机构审查委员会（IRB #13995）的批准，并遵循其制定的机构指南。

1. 患者选择

1. 从已安排接受骨科医生全膝关节置换术（TKA）的患者中确定研究对象。
2. 根据研究方案规定的纳入标准选择患者。纳入标准示例包括年龄在18岁及以上，且确诊为膝关节骨关节炎。排除标准示例包括接受部分膝关节置换术，或确诊为类风湿性关节炎。
3. 在手术前联系患者，获取知情同意。

2. 样品处理（用于RNA）

注意：所有组织处理均需在II级生物安全柜中进行，并遵循无菌操作技术。处理人类样本时，务必穿戴适当的个人防护装备（丁腈手套、实验服、护目镜）。全膝关节置换术（TKA）过程中会产生多个骨碎片，可能提供大量骨/软骨组织用于解剖。由于疾病进展，部分骨组织上的关节软骨退变可能更为严重，此因素应在实验设计中予以考虑。仅需使用电灼切除的组织才会产生热损伤边缘，外科手术会尽可能采用手术刀获取大部分组织，以减少损伤。切除的组织必须始终用无菌PBS保持湿润。

1. 使用70%乙醇、RNase去污染剂、DEPC处理水以及再次使用70%乙醇对所有工作台面和设备进行消毒。用洁净无绒的擦拭纸巾擦去残留液体。镊子、骨剪和手术刀在使用前需经过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡至少10分钟。暂时不使用的器械....

结果

从接受膝关节骨关节炎（OA）全膝关节置换术（TKA）的患者中可采集到七种独特的人膝关节组织（图1）。在本方案中，每种组织均在手术切除后4小时内进行识别和处理（图2）。根据图3所示步骤，将每种组织的一部分用福尔马林固定以进行组织学评估（图4），其余部分则迅速冷冻以用于RNA提取。通过不同的破碎方法将硬组织与软组织分开（分别为研磨与匀浆），从每种组织类型中提取出高完整性与高纯度的RNA，代表性结果见表1（高质量组列）。值得注意的是，部分受试者在多种组织中获得的RNA质量较低（表1，低质量组列），提示尽管方法已优化，外部因素（如疾病严重程度）仍可能影响不同组织类型的RNA质量。

讨论

本方案已成功用于收集七种人源原代骨关节炎组织以提取RNA表1）以及组织学处理（图4）。在采集患者样本之前，必须建立经机构审查委员会（IRB）批准的方案，最好与外科医生或外科团队合作进行。应采用标准化的样本采集方案（例如，从一致部位切除） 原位 位置）对于最大限度提高实验的可重复性至关重要。组织样本应置于无菌容器中运送至实验室，并在手术后4小时内进行处理，以避免降解。在组织解剖和处理过程中，所有组织均需保持在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中以维持湿润，并用新鲜的无菌PBS冲洗，以去除可能的表面污染物（如体液和其他不需要的碎屑），随后进行速冻以用于RNA提取，或用福尔马林固定以用于组织学分析。组织学分析的一个重要应用是确认组织类型及疾病严重程度，因为这些特征可通过细胞数量、分布和形态等因素加以区分，而这些特征可通过苏木精和伊红（hematoxylin and eosin）等常规染色方法观察到图4).

人源原代骨关节炎组织.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	05 402	无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
10% 甲醛	Cardinal Health	C4320-101	不使用时存放于化学品柜中。
100% 氯仿（分子生物学级）	Fisher Scientific	ICN19400290	无菌、无核酸酶，专用于RNA实验，不使用时存放于化学品柜中。
100% 乙醇（分子生物学级）	Fisher Scientific	BP2818500	无菌，无核酸酶。专用于RNA实验，稀释时使用DEPC/无核酸酶水。
100% 异丙醇（分子生物学级）	Fisher Scientific	AC327272500	无菌、无核酸酶，专用于RNA实验，不使用时存放于化学品柜中。
100% 试剂级乙醇	Cardinal Health	C4305	用去离子水稀释至70%2用于清洁目的。
15 cm 无菌培养皿	赛默飞世尔科技	12-556-003	无菌，无核酸酶。
15 mL 聚丙烯（Falcon）管	Fisher Scientific	14 959 53A	无菌，无核酸酶。
2 mL 冻存管（外螺纹）	Fisher Scientific	10 500 26	无菌，无核酸酶。
5 mL 圆底管	康宁	352052	无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
50 mL 聚丙烯（Falcon）管	Fisher Scientific	12 565 271	无菌，无核酸酶。
生物分析仪	安捷伦	G2939BA	用于RNA完整性测定。
生物安全柜	通用实验设备
骨剪	Fisher Scientific	08 990	用70%乙醇灭菌。
化学通风橱	通用实验设备
一次性手术刀（No.10）	赛默飞世尔科技	3120032	无菌，无核酸酶。
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% 溶液（含 dH₂O）2O.
镊子	任何供应商		用70%乙醇灭菌。
Glycoblue 共沉淀剂	Fisher Scientific	AM9516	专用于RNA实验，保存于-20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
液氮	任何供应商
液氮杜瓦瓶	通用实验设备
研钵和研杵	任何供应商		专用于RNA实验，按方案进行灭菌。
NanoDrop 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-2000	用于RNA纯度和得率的测定。
无核酸酶/DEPC处理水	Fisher Scientific		无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
PBS（无菌）	Gibco	20 012 050	无菌，无核酸酶。
移液器（2 µL，20 µL，200 µ升，1000 µL) &和提示	任何供应商		无菌，无核酸酶。
血浆/血清高级miRNA试剂盒	Qiagen	217204
冷藏离心机 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	赛默飞世尔科技	50 197 8158	无菌，无核酸酶。
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
刮勺（半微量尺寸）	任何供应商		仅供RNA实验使用。
组织匀浆器	Pro Scientific	01-01200	专用于RNA实验，按方案进行灭菌。
TRIzol 试剂	Fisher Scientific	15 596 026	无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。