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人骨关节炎膝关节组织采集与RNA提取

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DOI：

10.3791/62718

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2021年7月22日

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

本文内容

摘要

通过全膝关节置换术从患者体内获取的原代组织为骨关节炎研究提供了具有最高临床可转化性的实验模型。本方案描述了如何识别、处理并从七种独特的膝关节组织中分离RNA，以支持人类骨关节炎的机制性研究。

摘要

骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，最常累及膝关节。由于目前尚无治愈手段，全膝关节置换术（TKA）是一种常见的外科干预措施。利用从接受TKA的患者中获取的原代人OA组织进行实验，可在体外（ex vivo）研究该疾病的发病机制。尽管过去认为OA主要影响软骨，但现在已知其可累及关节内的多种组织。本方案描述了患者筛选、样本处理、组织匀浆、RNA提取以及来自膝关节七种不同组织的RNA质量控制流程（基于RNA纯度、完整性及得率），以支持对膝关节疾病机制的研究。在获得知情同意后，从接受TKA治疗OA的患者中采集组织样本。组织在术后4小时内进行分离、清洗，并通过速冻保存用于RNA提取，或经甲醛固定用于组织学分析。采集的组织包括关节软骨、软骨下骨、半月板、髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜以及股内侧斜肌。针对每种组织类型分别测试了RNA提取方案。最关键的改进在于针对低细胞、高基质、坚硬组织（即软骨、骨和半月板）与相对高细胞、低基质、柔软组织（即脂肪垫、韧带、滑膜和肌肉）所采用的不同破碎方法。结果表明，粉碎法适用于坚硬组织，而匀浆法则适用于柔软组织。研究发现，某些受试者在多种组织中 consistently 表现出较高的RNA完整性数值（RIN），提示疾病严重程度等潜在因素可能影响RNA质量。从原代人OA组织中成功分离高质量RNA，为开展复杂的基因表达实验（包括测序）提供了具有生理相关性的模型，有助于获得更易于转化至临床应用的研究成果。

引言

膝关节是人体最大的滑膜关节，由胫骨与股骨之间的胫股关节以及髌骨与股骨之间的髌股关节构成1。膝关节内的骨骼表面覆有关节软骨，并由多种结缔组织（包括半月板、脂肪、韧带和肌肉）提供支持，滑膜包裹整个关节，形成一个充满滑液的腔隙1,2,3（图1）。健康的膝关节作为一个可活动的铰链关节，能够在冠状面内实现无摩擦运动1,3。在病理状态下，关节活动可能受限并伴有疼痛。最常见的膝关节退行性疾病是骨关节炎（OA）4。已知多种危险因素可增加OA的发生风险，包括高龄、肥胖、女性性别、关节创伤和遗传因素等5,6。目前美国约有1400万 symptomatic knee OA 患者，且由于人口老龄化和肥胖率上升，其患病率正在持续增加7,8。OA最初被认为是软骨疾病，但现在已被理解为累及整个关节的病变9。OA中常见的病理改变包括关节软骨磨损、骨赘形成、软骨下骨增厚以及滑膜炎症9,10。由于目前尚无治愈OA的方法，治疗主要集中在缓解症状（如疼痛）11,12，当OA进展至终末期时，通常需要进行关节置换手术13。

关节置换手术可以是部分或全膝关节置换，其中全膝关节成形术（TKA）包括置换整个胫股关节面以及髌股关节。截至2020年，美国每年约进行100万台TKA手术14。在TKA手术过程中，骨科医生会切除胫骨平台的上部和股骨髁的下部（图2A、2B），以便安装假体植入物。患者有时会对此产生误解：在TKA手术中，每根骨骼的末端仅被切除8-10 mm，随后用金属材料进行覆盖或表面重建。两块金属假体之间置入聚乙烯衬垫，形成承重面（即缓冲垫）。此外，为了实现适当的关节平衡，还需完全或部分切除关节中的多个软组织结构。这些组织包括内侧和外侧半月板（图2C）、髌下脂肪垫（图2D）、前交叉韧带（ACL；图2E）、滑膜（图2F）以及股内侧斜肌（VMO；图2G）15。尽管TKA在治疗骨关节炎（OA）方面总体上是成功的，但约有20%的患者在术后报告疼痛复发16。加之该手术费用高昂且具有一定的侵入性，这些局限性表明有必要进一步研究，以寻找可延缓OA进展的替代治疗方法。

为了探索骨关节炎（OA）中可能为治疗干预提供新途径的疾病机制，可采用包括细胞、组织外植体和动物模型在内的实验系统。细胞通常在单层培养中进行培养，来源于原代人或动物组织（例如，从软骨中分离的软骨细胞）或永生化细胞系（例如，ATDC517 和 CHON-00118）。尽管细胞可在受控的培养环境中用于操控实验变量，但它们无法模拟天然关节中的复杂条件，而这些条件已被证实会影响细胞表型19。为了更真实地再现OA背后复杂的化学、力学及细胞间通讯级联反应，另一种选择是使用原代人或动物组织样本，无论是新鲜使用还是在体外（ex vivo）作为外植体进行培养，以保留组织结构和细胞微环境20。为了在体内（in vivo）研究关节，也可利用小型（例如，小鼠21）和大型（例如，马22）动物OA模型（例如，通过手术诱导、基因改造或自然衰老建立）。然而，由于解剖结构、生理功能和代谢等方面的差异，这些模型向人类疾病的转化可能受到限制23。综合考虑各类实验系统的优缺点，原代人OA组织所具备的种属特异性和对细胞外微环境的保持能力，是最大化研究成果转化潜力的关键优势。

原代人类骨关节炎（OA）组织可在全膝关节置换术（TKA）后 readily 获得，TKA 的高频率使其成为研究的宝贵资源。潜在的实验应用包括基因表达分析和组织学分析。为了充分发挥原代人类 OA 组织在这些及其他研究方法中的潜力，需考虑以下关键因素。首先，患者样本的使用受到伦理规范的约束，相关方案必须获得机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）的批准24。其次，人类原代病变组织本身具有异质性，且年龄、性别等因素的影响，使得必须谨慎选择患者（即应用纳入标准）并对数据进行审慎解读。第三，关节中不同组织具有独特的生物学特性（例如软骨和半月板的细胞含量较低25），可能在实验过程中带来挑战（例如难以提取高质量和高产量的 RNA）。本报告针对上述问题，提出了一套包括患者筛选、样本处理、组织匀浆、RNA 提取以及质量控制（即 RNA 纯度和完整性的评估；图 3）在内的标准操作流程，以促进原代人类 OA 组织在科研领域的应用。

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方案

本研究方案已获得亨利福特医疗系统机构审查委员会（IRB #13995）的批准，并遵循其制定的机构指南。

1. 患者选择

  1. 从已安排接受骨科医生全膝关节置换术（TKA）的患者中确定研究对象。
  2. 根据研究方案规定的纳入标准选择患者。纳入标准示例包括年龄在18岁及以上，且确诊为膝关节骨关节炎。排除标准示例包括接受部分膝关节置换术，或确诊为类风湿性关节炎。
  3. 在手术前联系患者，获取知情同意。

2. 样品处理（用于RNA）

注意：所有组织处理均需在II级生物安全柜中进行，并遵循无菌操作技术。处理人类样本时，务必穿戴适当的个人防护装备（丁腈手套、实验服、护目镜）。全膝关节置换术（TKA）过程中会产生多个骨碎片，可能提供大量骨/软骨组织用于解剖。由于疾病进展，部分骨组织上的关节软骨退变可能更为严重，此因素应在实验设计中予以考虑。仅需使用电灼切除的组织才会产生热损伤边缘，外科手术会尽可能采用手术刀获取大部分组织，以减少损伤。切除的组织必须始终用无菌PBS保持湿润。

  1. 使用70%乙醇、RNase去污染剂、DEPC处理水以及再次使用70%乙醇对所有工作台面和设备进行消毒。用洁净无绒的擦拭纸巾擦去残留液体。镊子、骨剪和手术刀在使用前需经过高压灭菌或在70%乙醇中浸泡至少10分钟。暂时不使用的器械应保持浸没于70%乙醇中。
  2. 为每个组织预先标记至少三个冻存管，标注去标识化的样本名称和分装编号（例如：TKA-1 软骨 1）。
    1. 根据图2中所示及描述的大小、形状、颜色和质地差异，从标本中识别各种组织类型。识别关节软骨（图2A箭头所示）、骨组织（图2B箭头所示）、半月板（图2C）、髌下脂肪垫（图2D）、前交叉韧带（图2E）、滑膜（图2F）以及股内侧斜肌（图2G）。
  3. 分离关节软骨。
    1. 选择软骨退变程度最小的骨组织区域。
    2. 使用10号手术刀尽可能深地切穿软骨全层，以分离出完整厚度的软骨组织。
      注：10号手术刀仅能穿透软骨，不能切入骨组织。
    3. 利用完整厚度的软骨，分离出三个5 mm的立方体组织块。
  4. 分离软骨下骨。
    1. 使用先前取软骨时所用的同一骨组织区域。
    2. 使用10号手术刀刮除骨表面残留的软骨及其他附属组织。
    3. 用镊子夹持待切割的骨组织，使用骨剪切割出三个5 mm的立方体组织块。
  5. 分离半月板。
    1. 选择内侧或外侧半月板中相对无损伤的区域。
    2. 使用10号手术刀和镊子，分离出三个5 mm的立方体组织块。
  6. 分离髌下脂肪垫。
    1. 使用10号手术刀和镊子，将组织的黄色部分切割成三个大小相等且均一的组织块（每块约500 mg）。
  7. 分离前交叉韧带（ACL）。
    1. 使用10号手术刀和镊子，分离出三个5 mm的立方体组织块。
  8. 分离滑膜。
    1. 使用10号手术刀和镊子，尽可能刮除脂肪组织，分离出膜结构中粉红色的细胞部分。
    2. 分离出三个大小相等且均一的组织块（每块约200 mg）。
  9. 分离股内侧斜肌（VMO）。
    1. 使用10号手术刀和镊子，从标本中去除所有脂肪组织，仅保留红色的肌肉组织。
    2. 分离出三个5 mm的立方体组织块。
      注：组织初始大小限制了分装组织块的尺寸。
  10. 用无菌PBS冲洗各组织块，以去除任何残留物或碎屑。
  11. 如需进行组织学分析，请按照第3部分所述方法固定各组织块。
  12. 如需进行RNA提取，将每个组织的三个分装样本切割成更小的组织块（约1–2 mm 立方体）。
    1. 将小组织块转移至2 mL冻存管中，拧紧管盖，通过浸入液氮中30秒进行速冻，随后转移至-80 °C冰箱中长期保存（本方案中已验证可保存长达4个月）。对所有组织的所有分装样本重复此操作。
    2. 继续进行第4部分所述的组织匀浆步骤。

3. 样品处理（用于组织学）

警告：甲醛是一种危险化学品，仅可在化学通风橱中使用。

  1. 将预标记的 15 mL 圆锥形管中加入 10% 福尔马林溶液。
  2. 使用镊子将组织样本转移至盛有福尔马林的管中。
  3. 在室温下用福尔马林固定组织 1 周，若可能，期间持续振荡或搅动。
  4. 1 周后，将福尔马林倒入适当的化学废液容器中丢弃，用 PBS 冲洗组织，然后转移至含有 70% 乙醇的新 15 mL 圆锥形管中，于 4 °C 长期保存，直至包埋切片。
    注意：仅针对骨/软骨组织，按以下步骤进行脱钙。
  5. 1 周后，将福尔马林倒入适当的化学废液容器中丢弃，并用 PBS 冲洗组织。
  6. 将组织转移至含有 45 mL 10% EDTA 溶液（pH 7.4）的 50 mL 圆锥形管中。
  7. 若无法进行振荡或搅动，每日倒置管子 10–15 次。
  8. 每周丢弃并更换一次 EDTA 溶液。
    1. 每周两次，使用工具（如刮勺）或戴手套的手指测试组织质地，通过施加压力时是否发生形变来确认是否完成脱钙。不同样本脱钙所需时间各异，通常为 4–6 周。
  9. 脱钙完成后，用 PBS 冲洗组织，并转移至含有 70% 乙醇的新 15 mL 圆锥形管中，于 4 °C 长期保存，直至包埋切片。

4. 组织匀浆

警告：本实验方案使用了危险化学品苯酚。操作苯酚时必须在化学通风橱中进行。

注意：所有将要使用的设备和表面需用70%乙醇彻底清洁（浸泡至少10分钟），随后用RNase去污染剂处理（浸泡至少10分钟），再用DEPC处理水冲洗，用洁净无絮纸巾擦拭，最后重新喷洒或浸泡70%乙醇。

  1. 硬组织匀浆（关节软骨、软骨下骨、半月板）
    1. 匀浆前，使用液氮预冷研钵、研杵和刮勺。必须尽可能保持其低温，以防止样品解冻。
    2. 每次处理一个样品，其余样品在使用前应保持在 -80 °C。
    3. 使用预冷的刮勺将组织样品转移至研钵中；在组织上倒入额外的液氮，待其挥发。用研杵研磨组织。反复向组织样品中添加更多液氮，待其挥发后继续用研杵研磨，直至形成细粉。
    4. 将组织尽可能研磨成粉末后，转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中。
      1. 在转移组织前，将离心管浸入液氮中 30 秒进行预冷。
    5. 向每根离心管中加入 1 mL 酸-胍基-苯酚溶液，并置于冰上保存。
    6. 对每个硬组织样品重复步骤 4.1.3–4.1.5。
    7. 每次处理完一个组织后，用 70% 乙醇、RNase 去污染剂、DEPC 处理水以及额外一次 70% 乙醇浸泡清洗研钵、研杵和刮勺。用干净无绒的纸巾擦去残留液体。
    8. 将样品在冰上额外孵育 20 分钟。
  2. 软组织匀浆（髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜、股内侧肌）
    1. 通过运行 70% 乙醇、RNase 去污染剂、DEPC 处理水以及额外一次 70% 乙醇清洗液各 30 秒，对匀浆器进行消毒。用干净无绒的纸巾擦去残留液体。每个样品之间均需重复此步骤。
    2. 为每个样品预先标记 5 mL 圆底管。向每根管中加入 1 mL 酸-胍基-苯酚溶液。
      1. 每次处理一个样品，其余待处理的样品在使用前应保持在 -80 °C。
    3. 将组织转移至已预先标记并含有酸-胍基-苯酚溶液的 5 mL 管中。
    4. 以 30 秒脉冲方式进行组织匀浆，脉冲期间及脉冲间隔均需保持在冰上。重复操作直至组织在视觉上完全溶解，或最多进行五次 30 秒脉冲。
      注：某些纤维性组织（如肌肉）可能无法完全匀浆。
    5. 将溶解后的组织在冰上孵育，并开始处理下一个样品。
      1. 按照步骤 4.2.1 所述方法清洁匀浆器。确保探头齿间无组织残块残留；如有需要，使用无菌镊子清除。
    6. 所有样品匀浆完成后，在冰上用酸-胍基-苯酚溶液额外孵育 20 分钟。
    7. 将样品从圆底管转移至预先标记并预冷的 1.5 mL 微量离心管中。

5. 从组织中提取 RNA

警告：本实验方案使用苯酚、氯仿和异丙醇等危险化学品。所有操作均须在化学通风橱中进行。

注意：仪器和试剂仅限用于RNA实验，且必须为适用于分子生物学应用的适当化学纯度级别（即无菌、无核酸酶）。本方案接在4.1和4.2组织匀浆方案之后。使用70%乙醇彻底清洁所有将要使用的仪器和表面（浸泡至少10分钟），随后用RNase去污染剂处理（浸泡至少10分钟）。用DEPC处理水冲洗，再用洁净无绒纸巾擦去残留液体，然后重新喷洒或浸泡70%乙醇。

  1. 在 4 °C 条件下，以 10000 × g 离心 10 分钟 ，使沉淀物聚集于管底。
  2. 将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
    注意：对于脂肪组织，有时会在上层形成脂质层。使用移液枪头从管壁侧面穿刺该层，避免转移脂质层。
  3. 每 1 mL 酸-硫氰酸胍-苯酚溶液中加入 200 µL 氯仿，手动剧烈振荡试管 30 秒以充分混匀，随后在冰上孵育 2 分钟。
  4. 在 4 °C 条件下，以 10000 × g 离心 12 分钟。
    注意：离心后将形成三层：含有 RNA 的上层水相、中间白色 DNA 层（界面相）以及底部粉红色蛋白质层。
  5. 将约 500 µL 上层水相转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
    注意：避免扰动中间相和蛋白组分。将这些组分保存于 -80 °C，以备后续进行 DNA 或蛋白质提取。
  6. 向转移的水相中加入等体积的酸-硫氰酸胍-苯酚溶液，通过反复倒置试管 8–10 次混匀，然后在冰上孵育 20 分钟。
  7. 每 1 mL 酸-硫氰酸胍-苯酚溶液中加入 200 µL 氯仿，手动剧烈振荡 30 秒以混匀，随后在冰上孵育 2 分钟。
  8. 在 4 °C 条件下，以 10000 × g 离心 12 分钟。
  9. 小心转移 <500 µL 水相至新的微量离心管中，避免其他相污染样品。
    警告：剩余组分应按照适当的危险废物处理方法丢弃。
  10. 向每个样品中加入与水相等体积的 100% 异丙醇，通过倒置试管 8–10 次混匀，在冰上孵育 5 分钟。
    1. 向每个样品中加入 1 µL 糖原共沉淀剂，有助于离心后定位 RNA 沉淀。
  11. 在 4 °C 条件下，以 12000 × g 离心 25 分钟。
  12. 观察并定位管中的沉淀（若使用共沉淀剂，沉淀呈蓝色），小心倾去上清液。
  13. 向每个样品中加入 1 mL 冰冷的 75% 乙醇洗涤沉淀，涡旋振荡使沉淀从管底脱落。
    注意：使用分子生物学级纯乙醇和无核酸酶水配制 75% 乙醇。
  14. 在 4 °C 条件下，以 7000 × g 离心 5 分钟，小心倾去上清液。
  15. 重复步骤 5.13 和 5.14 两次。
  16. 短暂离心（<2000 × g，5 秒）使残留液体聚集至管底，使用 P20 移液器吸除管底残留乙醇。
    1. 避免移液枪头接触 RNA 沉淀，不同样品间需更换枪头。
  17. 打开管盖，在室温下空气干燥样品 10 分钟。
    注意：沉淀在干燥过程中可能变得半透明。确保所有残留乙醇完全挥发，以提高 RNA 纯度。
  18. 向每管中加入 25 µL 无核酸酶水，以溶解沉淀。
  19. 在室温下孵育 5 分钟。
  20. 轻柔地上下吹打混匀 RNA 溶液。
  21. 取 5 µL 样品分装至新管中用于质量控制分析（第 6 部分），其余 20 µL 储存于 -80 °C，用于基因表达检测。

6. 质量控制

  1. 根据制造商说明书，使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。
  2. 根据制造商说明书，使用电泳设备测定RNA的完整性。
    注意：将RNA稀释至芯片检测限范围内。

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结果

从接受膝关节骨关节炎（OA）全膝关节置换术（TKA）的患者中，可采集到七种独特的人膝关节组织（图1）。在本方案中，每种组织均在手术切除后4小时内完成识别与处理（图2）。根据图3所示步骤，各组织的一部分经福尔马林固定用于组织学评估（图4），其余部分则迅速冷冻以用于RNA提取。通过不同的破碎方式将硬组织与软组织分开（分别为研磨与匀浆），从每种组织类型中均成功提取出高完整性与高纯度的RNA，代表性结果见表1（高质量组列）。值得注意的是，部分受试者在多种组织中获得的RNA质量较低（表1，低质量组列），提示尽管方法已优化，外部因素（如疾病严重程度）仍可能影响不同组织类型的RNA质量。

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讨论

本方案已成功用于收集七种人源原代骨关节炎组织以提取RNA表1）以及组织学处理（图4）。在采集患者样本之前，必须建立经机构审查委员会（IRB）批准的方案，最好与外科医生或外科团队合作进行。应采用标准化的样本采集方案（例如，从一致部位切除） 原位 位置）对于最大限度提高实验的可重复性至关重要。组织样本应置于无菌容器中运送至实验室，并在手术后4小时内进行处理，以避免降解。在组织解剖和处理过程中，所有组织均需保持在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中以维持湿润，并用新鲜的无菌PBS冲洗，以去除可能的表面污染物（如体液和其他不需要的碎屑），随后进行速冻以用于RNA提取，或用福尔马林固定以用于组织学分析。组织学分析的一个重要应用是确认组织类型及疾病严重程度，因为这些特征可通过细胞数量、分布和形态等因素加以区分，而这些特征可通过苏木精和伊红（hematoxylin and eosin）等常规染色方法观察到图4).

人源原代骨关节炎组织...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢使本研究得以实现的受试者，并将本报告献给骨关节炎领域的新一代科研人员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Eppendorf05 402无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
10% 甲醛Cardinal HealthC4320-101不使用时存放于化学品柜中。
100% 氯仿（分子生物学级）Fisher ScientificICN19400290无菌、无核酸酶，专用于RNA实验，不使用时存放于化学品柜中。
100% 乙醇（分子生物学级）Fisher ScientificBP2818500无菌，无核酸酶。专用于RNA实验，稀释时使用DEPC/无核酸酶水。
100% 异丙醇（分子生物学级）Fisher ScientificAC327272500无菌、无核酸酶，专用于RNA实验，不使用时存放于化学品柜中。
100% 试剂级乙醇Cardinal HealthC4305用去离子水稀释至70%2用于清洁目的。
15 cm 无菌培养皿赛默飞世尔科技12-556-003无菌，无核酸酶。
15 mL 聚丙烯（Falcon）管Fisher Scientific14 959 53A无菌，无核酸酶。
2 mL 冻存管（外螺纹）Fisher Scientific10 500 26无菌，无核酸酶。
5 mL 圆底管康宁352052无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
50 mL 聚丙烯（Falcon）管Fisher Scientific12 565 271无菌，无核酸酶。
生物分析仪安捷伦G2939BA用于RNA完整性测定。
生物安全柜通用实验设备
骨剪Fisher Scientific08 990用70%乙醇灭菌。
化学通风橱通用实验设备
一次性手术刀（No.10）赛默飞世尔科技3120032无菌，无核酸酶。
EDTALife Technologies15-576-02810% 溶液（含 dH₂O）2O.
镊子任何供应商用70%乙醇灭菌。
Glycoblue 共沉淀剂Fisher ScientificAM9516专用于RNA实验，保存于-20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
液氮任何供应商
液氮杜瓦瓶通用实验设备
研钵和研杵任何供应商专用于RNA实验，按方案进行灭菌。
NanoDrop 分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000用于RNA纯度和得率的测定。
无核酸酶/DEPC处理水Fisher Scientific无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。
PBS（无菌）Gibco20 012 050无菌，无核酸酶。
移液器（2 µL，20 µL，200 µ升，1000 µL) &和提示任何供应商无菌，无核酸酶。
血浆/血清高级miRNA试剂盒Qiagen217204
冷藏离心机 5810REppendorf22625101
RNAlater赛默飞世尔科技50 197 8158无菌，无核酸酶。
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
刮勺（半微量尺寸）任何供应商仅供RNA实验使用。
组织匀浆器Pro Scientific01-01200专用于RNA实验，按方案进行灭菌。
TRIzol 试剂Fisher Scientific15 596 026无菌，无核酸酶，专用于RNA实验。

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