一种完整心包缺血啮齿类动物模型

摘要

本方案概述了在保留心包及其内容物的前提下，诱导小鼠心肌梗死的步骤。

摘要

本方案表明，在缺血性啮齿类动物模型（通过冠状动脉结扎诱导心肌损伤）中，心包及其内容物在抗纤维化过程中发挥着关键作用。大多数临床前心肌梗死模型均需破坏心包的完整性，从而导致内环境稳态的细胞微环境丧失。然而，我们近期开发出一种诱导心肌梗死的方法，可最大程度减少对心包的损伤，并保留心脏固有的免疫细胞群体。在冠状动脉结扎后，心包腔保持完整的小鼠表现出更优的心脏功能恢复。该方法为研究心肌梗死后心包腔内的炎症反应提供了机会。进一步优化标记技术后，可将此模型结合使用，以阐明心包免疫细胞在调控心脏重塑（包括纤维化）相关炎症机制中的命运与功能。

引言

迄今为止，心血管疾病（CVD）被公认为全球首要的死亡原因，给社会带来巨大的经济负担，并显著降低患者的生活质量¹。冠状动脉疾病（CAD）是CVD的一种亚型，在心肌梗死（MI）的发生过程中起关键作用，而MI是导致死亡的主要因素之一。根据定义，MI是由于长时间的缺血和缺氧状态导致心肌组织发生不可逆损伤所致。心肌组织缺乏再生能力，因此损伤是永久性的，最终导致心肌被纤维化瘢痕组织取代；这种瘢痕组织初期可能具有保护作用，但最终会促进不良的心脏重构，并导致心力衰竭²。

尽管过去几十年冠心病（CAD）患者的管理已显著改善，但由缺血引起的慢性心力衰竭（CHF）仍影响着全球众多患者。为了预防和控制这一流行病，有必要更深入地理解其潜在机制，并开发新的治疗策略。此外，以往的研究凸显了全身性治疗的局限性，以及开发精准替代方案的必要性。由于在人类中研究心肌梗死（MI）分子继发性改变受到获取梗死组织能力的限制，能够重现人类心血管疾病（CVD）相关心肌梗死和慢性心力衰竭特征及发展过程的动物模型显得不可或缺。

由于理想的动物模型在结构和功能特征上应与人类疾病高度相似，因此疾病病因应指导其构建。在冠状动脉疾病（CAD）中，病因是冠状动脉的慢性动脉粥样硬化性狭窄或急性血栓性闭塞。目前已在多种实验动物中开发并应用了多种方法，以诱导冠状动脉狭窄或闭塞。这些策略大致可分....

方案

实验使用8至14周龄的雄性和雌性C57BL/6J小鼠。本方案已获得卡尔加里大学动物护理委员会的伦理批准，并遵循所有动物护理指南。

1. 小鼠准备与手术

1. 通过玻璃珠灭菌器或高压灭菌器对手术器械进行灭菌。
2. 称量小鼠术前体重，以确定镇痛药剂量。
3. 将小鼠置于含4%异氟烷和800 mL/min氧气的诱导箱中。通过轻捏脚趾并观察动物是否无反射反应来确认麻醉深度。
4. 皮下注射镇痛药（每公斤体重0.1 mg的丁丙诺啡）（参见材料表）。
5. 手术期间将小鼠置于加热手术垫上，并通过鼻罩持续给予3%异氟烷以维持麻醉。在每只眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
6. 剃除胸部和颈部手术区域的毛发。
7. 固定小鼠四肢，并将其摆放在手术台上。
8. 通过口腔和咽部将尖端光滑的23 G导管插入气管，完成气管插管。
   1. 插管后，使用商用呼吸机（参见材料表）进行通气，载气为100%氧气，异氟烷浓度为2%，呼吸频率设定为110次/分钟，潮气量为250 µL，呼气末正压（PEEP）为4 mmHg。
9. 将小鼠向右侧倾斜约30%，以便暴露左侧胸部进行手术。
10. 以70%乙醇和碘伏交替擦拭手术区域三次，呈环形消毒（参见....

结果

这种改良的冠状动脉结扎模型已优化以提高可重复性和动物存活率。然而，由于该手术对心脏造成的损伤较为严重，部分术中和术后死亡率是预期之内的。通常，雄性动物的标准死亡率（约25-35%）高于雌性动物（约10-15%）。

通过改良冠状动脉结扎法成功诱导心肌梗死（MI）后，应能观察到心脏功能参数和结构特征的变化。在功能方面，通过超声心动图评估，左心室（LV）射血分数等参数在心肌梗死后3-4周内将明显下降（图1A）。这些功能变化应伴随左心室游离壁显著的纤维化，可通过组织学染色（如天狼星红染色，PR）加以确认（图1B）。在进行此项分析时，应采用穿过梗死区域的纵向横截面切片，以充分代表梗死区、梗死周边区及远端心肌区域。

在整个操作过程中保持心包膜完整，可为研究心包腔内的并发炎症反应提供机会，同时也可用于确定该腔室内免疫细胞如何参与持续进行的重塑过程。将荧光微球标记法与流式细胞术分析相结合，是一种高选择性追踪定居型 Gata6.......

讨论

在啮齿类动物闭合心包膜条件下诱导心肌梗死具有独特性，并可能具有重要的应用价值。该操作在很大程度上依赖于手术者对啮齿类动物模型及其心脏解剖结构的熟悉程度。手术成功还取决于三个关键步骤的操作细节：肋间肌切开与肋骨牵拉（步骤1.11–1.13）、心肌梗死的建立（步骤1.17）以及动物术后恢复（步骤1.22–1.24）。

进行开胸手术时必须仔细操作，以避免刺破或撕裂心包膜。本方案中最关键的步骤是结扎左前降支（LAD）以诱导心肌梗死。与所有左前降支结扎模型一样，结扎缝线在LAD上的位置至关重要：近端结扎可能导致致命性心肌梗死，而远端结扎可能无法引起具有功能意义的心肌梗死。将LAD定位在心脏大致中点的位置可避免上述问题。由于LAD结扎是在心脏跳动状态下进行的，因此可用镊子轻轻固定心脏以减少移动，从而在不损伤血管的情况下完成缝合。此操作过程中可能会发生心外膜小血管的撕裂。轻微出血通常会在2至3天内自行吸收，不会污染心包液。啮齿类动物的心包膜，尤其是小鼠的心包膜非常薄，若术者操作不慎极易撕裂。最后，操作人员必须在术后（即恢复期）密切观察动物状态。停止异氟烷麻醉和拔除气管插管的时机必须有条不紊地把握.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Steri-350 珠式灭菌器	Inotech	NC9449759
10% 甲醛溶液	Millipore Sigma	HT501128-4L
40 µm 细胞筛	VWR	CA21008-949	Falcon, 352340
70 µm 细胞筛	VWR	CA21008-952	Falcon, 352350
ACK 裂解缓冲液	Thermo Fisher	A1049201
BD Insyte-W 导管针 24 G × 3/4"	CDMV Inc	108778
贝塔碘（10% 聚维酮碘外用溶液）	CDMV Inc	104826
直头镊子	Fine Science Tools	FST 11000-12
BNP 眼科软膏	CDMV Inc	17909
Castroviejo 持针器	Fine Science Tools	FST 12061-01
Centrifuge 5810R 离心机	Eppendorf	22625101
胶原酶 I	Millipore Sigma	SCR103
胶原酶 XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb 缝线 - CV-1 型圆锥形针	Medtronic Canada	GL-890
Covidien 5-0 Polysorb 缝线 - PC-13 型切割针	Medtronic Canada	SL-1659
弯头钝镊	Fine Science Tools	FST 11009-13
Dako 封片剂	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
乙醇，100%	Millipore Sigma	MFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon 缝线 - BV-130-4 型圆锥形针	Johnson & Johnson Inc.	2815G
光纤光源	Nikon	2208502
精细镊子	Fine Science Tools	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG 羧基微球，1.00 µm	Polysciences, Inc.	15702
Geiger 热凝器系统	World Precision Instruments	501293	型号 150-ST
透明质酸酶	Millipore Sigma	H4272
异氟烷蒸发器	Harvard Apparatus	75-0951
异氟烷 USP，250 mL	CDMV Inc	108737
磁性固定牵开系统	Fine Science Tools	18200-20
MX550D-40 MHz 探头	Fujifilm-Visual Sonics
持针器	Fine Science Tools	FST 12002-12
PE-10 导管	Braintree Scientific, Inc.	PE10 50 FT
剪刀	Fine Science Tools	FST 14184-09
SMZ-1B 体视显微镜	Nikon	SMZ1-PS
VentElite 小动物呼吸机	Harvard Apparatus	55-7040
Vetergesic（10 mL，0.3 mg/mL 布托啡诺）	CDMV Inc	124918	管制药品
Vevo 2100 软件	Fujifilm-Visual Sonics