方法文章

一种完整心包缺血啮齿类动物模型

DOI：

10.3791/62720

⸱

2021年9月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Cardiac Surgery, Department of Cardiac Sciences, Libin Cardiovascular Institute, Cumming School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, University of Calgary

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了在保留心包及其内容物的前提下，诱导小鼠心肌梗死的步骤。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案表明，在缺血性啮齿类动物模型（通过冠状动脉结扎诱导心肌损伤）中，心包及其内容物在抗纤维化过程中发挥着关键作用。大多数临床前心肌梗死模型均需破坏心包的完整性，从而导致内环境稳态的细胞微环境丧失。然而，我们近期开发出一种诱导心肌梗死的方法，可最大程度减少对心包的损伤，并保留心脏固有的免疫细胞群体。在冠状动脉结扎后，心包腔保持完整的小鼠表现出更优的心脏功能恢复。该方法为研究心肌梗死后心包腔内的炎症反应提供了机会。进一步优化标记技术后，可将此模型结合使用，以阐明心包免疫细胞在调控心脏重塑（包括纤维化）相关炎症机制中的命运与功能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

迄今为止，心血管疾病（CVD）被公认为全球首要的死亡原因，给社会带来巨大的经济负担，并显著降低患者的生活质量1。冠状动脉疾病（CAD）是CVD的一种亚型，在心肌梗死（MI）的发生过程中起关键作用，而MI是导致死亡的主要因素之一。根据定义，MI是由于长时间的缺血和缺氧状态导致心肌组织发生不可逆损伤所致。心肌组织缺乏再生能力，因此损伤是永久性的，最终导致心肌被纤维化瘢痕组织取代；这种瘢痕组织初期可能具有保护作用，但最终会促进不良的心脏重构，并导致心力衰竭2。

尽管过去几十年冠心病（CAD）患者的管理已显著改善，但由缺血引起的慢性心力衰竭（CHF）仍影响着全球众多患者。为了预防和控制这一流行病，有必要更深入地理解其潜在机制，并开发新的治疗策略。此外，以往的研究凸显了全身性治疗的局限性，以及开发精准替代方案的必要性。由于在人类中研究心肌梗死（MI）分子继发性改变受到获取梗死组织能力的限制，能够重现人类心血管疾病（CVD）相关心肌梗死和慢性心力衰竭特征及发展过程的动物模型显得不可或缺。

由于理想的动物模型在结构和功能特征上应与人类疾病高度相似，因此疾病病因应指导其构建。在冠状动脉疾病（CAD）中，病因是冠状动脉的慢性动脉粥样硬化性狭窄或急性血栓性闭塞。目前已在多种实验动物中开发并应用了多种方法，以诱导冠状动脉狭窄或闭塞。这些策略大致可分为两类：（1）通过机械操作冠状动脉以诱导心肌梗死（MI）；（2）加速动脉粥样硬化进程，促使冠状动脉狭窄进而导致心肌梗死。第一类策略通常包括冠状动脉结扎或在动脉内放置支架；第二类方法则主要依赖于改变动物饮食，使其摄入高脂肪/高胆固醇食物。后一种方法的一些局限性包括无法控制冠状动脉闭塞发生的时间和具体部位。

相比之下，在动物模型中通过手术诱导心肌梗死（MI）或缺血具有多种优势，例如可以精确控制冠状动脉事件的发生位置、时间和程度，从而获得更可重复的实验结果。目前最常用的方法是结扎左前降支冠状动脉（LAD）。此类模型能够重现人类对急性缺血性损伤的反应，以及向充血性心力衰竭（CHF）发展的过程3。最初该技术在较大的动物中建立，但随着技术的进步，对大鼠和小鼠等小型动物进行LAD手术也变得越来越可行4。在建立此类模型的过程中，小鼠因其易于获得、饲养成本低以及便于进行基因操作等多种优势而被广泛使用。

目前采用左前降支（LAD）结扎的缺血性心脏病手术模型需要研究人员打开心包膜，以暂时或永久性地结扎该动脉5。此类策略会导致心包腔的破坏，而心包腔具有重要的机械支持和润滑功能，对维持正常心脏功能至关重要。打开心包膜的另一个缺点是会丢失动物自身心包液中的多种细胞成分和蛋白质成分6,7。针对这些问题，我们开发了一种在保持心包膜完整的情况下诱导心肌梗死（MI）的方法。除了最大限度地减少对该稳态环境的干扰外，该方法还可在诱发心肌梗死后实现对特定细胞的标记与示踪。此外，该方法更能真实模拟人类心肌缺血性损伤的情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验使用8至14周龄的雄性和雌性C57BL/6J小鼠。本方案已获得卡尔加里大学动物护理委员会的伦理批准，并遵循所有动物护理指南。

1. 小鼠准备与手术

  1. 通过玻璃珠灭菌器或高压灭菌器对手术器械进行灭菌。
  2. 称量小鼠术前体重，以确定镇痛药剂量。
  3. 将小鼠置于含4%异氟烷和800 mL/min氧气的诱导箱中。通过轻捏脚趾并观察动物是否无反射反应来确认麻醉深度。
  4. 皮下注射镇痛药（每公斤体重0.1 mg的丁丙诺啡）（参见材料表）。
  5. 手术期间将小鼠置于加热手术垫上，并通过鼻罩持续给予3%异氟烷以维持麻醉。在每只眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
  6. 剃除胸部和颈部手术区域的毛发。
  7. 固定小鼠四肢，并将其摆放在手术台上。
  8. 通过口腔和咽部将尖端光滑的23 G导管插入气管，完成气管插管。
    1. 插管后，使用商用呼吸机（参见材料表）进行通气，载气为100%氧气，异氟烷浓度为2%，呼吸频率设定为110次/分钟，潮气量为250 µL，呼气末正压（PEEP）为4 mmHg。
  9. 将小鼠向右侧倾斜约30%，以便暴露左侧胸部进行手术。
  10. 以70%乙醇和碘伏交替擦拭手术区域三次，呈环形消毒（参见材料表）。在手术区域周围铺设无菌手术巾。
  11. 在左侧胸部皮肤做2-3 cm的侧向切口，暴露胸大肌。从正中线向外侧做约1 cm切口，剪开胸大肌和胸小肌，以暴露第三与第四肋骨之间的肋间肌。
    注：应谨慎操作，避免胸大肌出血过多，必要时可电凝止血。
  12. 在左侧肋间肌上做约2 cm切口，使空气（通过被动气流）进入胸腔，促使心脏和肺组织远离手术切口。随后借助电凝设备（参见材料表）扩大切口，切开肋间组织并预防出血。
    注：电凝过程中应暂时停止呼吸机，以避免与高浓度氧气发生爆炸反应。操作时注意避免损伤心包膜。
  13. 使用牵开器牵开肋骨，充分暴露心脏。
  14. 在体视显微镜下观察心包及其下方的心脏。
    注：小鼠心包较薄，可直接观察到心脏的血管结构。
  15. 轻轻将镊子置于心包表面，以减少心包及下方心脏的移动。
  16. 通过追踪左心耳下方发出的血管，肉眼辨识左前降支（LAD）冠状动脉。
  17. 使用显微持针器，将合适的缝线（参见材料表）穿过心包并从LAD下方通过，使缝线从LAD和心包的另一侧穿出。打结以阻断冠状动脉血流，并用剪刀修剪多余缝线（图1A）。
    注：当冠状动脉血流被阻断后，左心室前壁应出现明显的苍白区域。此操作建立的是永久性结扎模型。然而，在此阶段也可采用不同缺血时间的短暂结扎方法。
  18. 在无菌区域内的切口下方，经皮插入24 G导管进入胸腔（进入胸腔后拔除导丝）。随后依次缝合肋骨、肌肉层和皮肤，使用合适的缝线（肌肉层使用圆针，皮肤使用普通角针）。
  19. 胸腔关闭后，使用3 mL注射器轻柔抽吸并配合胸部按压，通过24 G导管将胸腔内残余空气排出。排尽空气后拔出24 G导管。
  20. 将异氟烷浓度降低至1%。
  21. 关闭异氟烷，继续以氧气通气，使小鼠从麻醉中恢复。当动物出现自主呼吸迹象时，从口腔拔出23 G气管导管，并将小鼠放入恢复笼中，持续监测其恢复正常呼吸情况。
  22. 将小鼠置于笼中恢复，笼子的一部分放置在加热垫上，提供外部热源。
  23. 术后72小时内，每12小时皮下注射一次维持剂量的镇痛药（丁丙诺啡，每公斤体重0.1 mg）。
  24. 术后7天内每日监测小鼠健康状况，包括评估切口愈合情况和动物是否出现不适。
    ​注：由于该操作具有侵入性（开胸手术），可能需要使用抗生素。

2. 通过超声心动图（ECG）对心脏功能进行功能评估

  1. 使用1.5-2%异氟烷和800 mL/min氧气诱导并维持小鼠全身麻醉。
  2. 将小鼠仰卧位放置在加热平台，并将四肢连接至心电图导联。
  3. 剃除小鼠胸部毛发。
  4. 使用40 MHz线性换能器探头和接触凝胶获取超声心动图图像，并使用相应软件进行分析（参见材料表）。
  5. 关闭异氟烷，让小鼠在加热平台上恢复，然后将其放回笼中至清醒状态。
    ​注意：超声心动图评估为非侵入性，因此可在整个实验过程中纵向进行，以确定冠状动脉结扎前后的心功能变化。

3. 心脏组织采集用于纤维化染色

  1. 通过吸入100% CO2处死小鼠，并小心分离出心脏。
    注意：使用剪刀和镊子，剪断进入（腔静脉、肺静脉）和离开（肺动脉、主动脉）心脏的大血管，从而将心脏从胸腔内的循环系统中释放出来。
  2. 将心脏置于10%福尔马林中固定至少24小时。
  3. 使用直刃剃刀沿右心室、室间隔和左心室进行切割取样，确保切口穿过梗死区域的中心。随后将样品送至核心实验室进行石蜡包埋。
  4. 使用切片机将组织切成5 µm厚度的切片，并将其置于载玻片上以备染色。
  5. 使用市售二甲苯及梯度酒精洗涤（2次99%、1次95%、1次70%），再用去离子水清洗，然后进行水化处理。
  6. 在苦味酸溶液中加入0.1%天狼星红，室温下染色2小时。
  7. 用0.5%乙酸溶液洗涤切片3分钟，并用70%乙醇冲洗1分钟。
  8. 按照步骤3.4中所述洗涤顺序的逆序进行脱水处理，依次使用浓度递增的梯度乙醇，最后使用二甲苯。
  9. 使用封片剂（参见材料表）对组织切片进行封片，以便显微镜下观察。

4. 心脏和心包腔灌洗液的流式细胞术分析

  1. 通过吸入100% CO2处死小鼠，直至死亡生效。
  2. 将小鼠仰卧放置，并用胶带将其四肢固定在手术板上。
  3. 小心切开胸腔左侧（从实验者视角为右侧），先从膈肌切至中点附近，然后继续向外侧肋骨方向剪至胸骨。
    注意：避免划伤大血管，尤其是沿胸骨走向的血管。
  4. 使用止血钳撑开肋骨，暴露下方的心脏和心包膜。
    注意：心包膜非常脆弱，剪开时务必避免被剪刀钩住。
  5. 将PE-10导管（见材料表）插入左心房与左心室交界处附近的心包腔内，向心包腔注射100 µL无菌生理盐水。
    1. 让生理盐水在心脏后侧聚集并收集，过程中注意不要刺破或撕裂心包膜。重复此步骤两次，并在处理心脏的同时将灌洗液置于冰上保存。
  6. 剪断进出心脏的主要血管（主动脉、肺动脉、静脉和腔静脉），切除心脏。去除左右心耳，称量心室组织重量。
  7. 用剪刀将组织剪成约1 mm2的小块，放入10 mL消化缓冲液中，在37 °C条件下于旋转摇床上孵育1小时。消化缓冲液组成为：PBS中含450 U/mL I型胶原酶、125 U/mL XI型胶原酶、60 U/mL I型DNase和60 U/mL透明质酸酶。
  8. 将心脏组织匀浆液通过70 µm细胞筛（见材料表）过滤，于4 °C下以60 ×g离心5分钟，去除心肌实质细胞。
  9. 收集上清液，再通过40 µm细胞筛（见材料表）过滤以获得单细胞悬液，于4 °C下以400 ×g离心5分钟收集细胞沉淀。
  10. 按照先前描述的方法8，对心包和心脏细胞进行可结晶片段（Fc）受体阻断及细胞标志物染色。
  11. 将样品上机进行流式细胞仪检测。

5. 使用肋间入路胸膜腔注射法（ICAPS）标记心包巨噬细胞9

  1. 使用玻璃珠灭菌器或高压灭菌器对手术器械进行灭菌，并在操作前用70%乙醇喷洒消毒。
  2. 使用1.5–2%异氟烷和800 mL/min氧气诱导并维持小鼠全身麻醉。通过轻捏脚趾并观察动物是否无反射反应来确认麻醉深度。
  3. 皮下注射镇痛药（布托啡诺 0.1 mg/kg）。
  4. 手术期间将小鼠置于加热的手术垫上。
  5. 剃除右侧前外侧胸部区域的毛发。
  6. 用乙醇和碘伏清洁手术区域。
  7. 在皮肤上做一个3 cm长的切口，并用镊子暴露肋骨。
  8. 将5 µL荧光微珠（ commercially available fluorescent microspheres, 1 µm，参见材料表）和45 µL生理盐水装入带有斜面尖端的PE-10导管注射器中。
  9. 按照先前描述的方法9将导管插入肋间间隙，缓慢注射微珠溶液，并一次性撤出导管。
  10. 使用钉皮钉闭合皮肤。
    注意：使用皮钉代替缝线以尽量减少切口再次打开的风险。
  11. 关闭异氟烷，将小鼠放入恢复笼中，并在术后最初24小时内监测有无并发症。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这种改良的冠状动脉结扎模型已优化以实现可重复性和动物存活。然而，由于心脏受到显著损伤，该手术仍存在一定的预期术中和术后死亡率。雄性动物的标准死亡率通常高于雌性动物，分别为约25-35%和约10-15%。

通过改良的冠状动脉结扎法成功诱导心肌梗死（MI）后，应能观察到心脏功能参数和结构特征的变化。在功能方面，通过超声心动图评估，左心室（LV）射血分数等参数在心肌梗死后3-4周内将明显下降（图1A）。这些功能变化应伴随左心室游离壁发生显著的纤维化，可通过组织学染色（如天狼星红染色，PR）进行评估（图1B）。进行此项分析时，应采用穿过梗死区域的纵向横截面，以充分代表梗死区、梗死周边区以及心脏的远端区域。

在整个操作过程中保持心包膜完整，可为研究心包腔内的并发炎症反应提供机会，同时也可用于确定该腔室内免疫细胞如何参与持续的重塑过程。将荧光微球标记法与流式细胞术分析相结合，是一种高选择性追踪驻留型 Gata6...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在啮齿类动物闭合心包膜条件下诱导心肌梗死具有独特性，并可能具有重要的应用价值。该操作在很大程度上依赖于手术者对啮齿类动物模型及其心脏解剖结构的熟悉程度。手术成功还取决于三个关键步骤的操作细节：肋间肌切开与肋骨牵拉（步骤1.11–1.13）、心肌梗死的建立（步骤1.17）以及动物术后恢复（步骤1.22–1.24）。

进行开胸手术时必须仔细操作，以避免刺破或撕裂心包膜。本方案中最关键的步骤是结扎左前降支（LAD）以诱导心肌梗死。与所有左前降支结扎模型一样，结扎缝线在LAD上的位置至关重要：近端结扎可能导致致命性心肌梗死，而远端结扎可能无法引起具有功能意义的心肌梗死。将LAD定位在心脏大致中点的位置可避免上述问题。由于LAD结扎是在心脏跳动状态下进行的，因此可用镊子轻轻固定心脏以减少移动，从而在不损伤血管的情况下完成缝合。此操作过程中可能会发生心外膜小血管的撕裂。轻微出血通常会在2至3天内自行吸收，不会污染心包液。啮齿类动物的心包膜，尤其是小鼠的心包膜非常薄，若术者操作不慎极易撕裂。最后，操作人员必须在术后（即恢复期）密切观察动物状态。停止异氟烷麻醉和拔除气管插管的时机必须有条不紊地把握...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Steri-350 珠式灭菌器InotechNC9449759
10% 甲醛溶液Millipore SigmaHT501128-4L
40 µm 细胞筛VWRCA21008-949Falcon, 352340
70 µm 细胞筛VWRCA21008-952Falcon, 352350
ACK 裂解缓冲液Thermo FisherA1049201
BD Insyte-W 导管针 24 G × 3/4"CDMV Inc108778
贝塔碘（10% 聚维酮碘外用溶液）CDMV Inc104826
直头镊子Fine Science ToolsFST 11000-12
BNP 眼科软膏CDMV Inc17909
Castroviejo 持针器Fine Science ToolsFST 12061-01
Centrifuge 5810R 离心机Eppendorf22625101
胶原酶 IMillipore SigmaSCR103
胶原酶 XIMillipore SigmaC7657
Covidien 5-0 Polysorb 缝线 - CV-1 型圆锥形针Medtronic CanadaGL-890
Covidien 5-0 Polysorb 缝线 - PC-13 型切割针Medtronic CanadaSL-1659
弯头钝镊Fine Science ToolsFST 11009-13
Dako 封片剂AgilenCS70330-2
DNase IMillipore Sigma11284932001
乙醇，100%Millipore SigmaMFCD00003568
Ethicon 8-0 Ethilon 缝线 - BV-130-4 型圆锥形针Johnson & Johnson Inc.2815G
光纤光源Nikon2208502
精细镊子Fine Science ToolsFST 11150-10
Fluoresbrite® YG 羧基微球，1.00 µmPolysciences, Inc.15702
Geiger 热凝器系统World Precision Instruments501293型号 150-ST
透明质酸酶Millipore SigmaH4272
异氟烷蒸发器Harvard Apparatus75-0951
异氟烷 USP，250 mLCDMV Inc108737
磁性固定牵开系统Fine Science Tools18200-20
MX550D-40 MHz 探头Fujifilm-Visual Sonics
持针器Fine Science ToolsFST 12002-12
PE-10 导管Braintree Scientific, Inc.PE10 50 FT
剪刀Fine Science ToolsFST 14184-09
SMZ-1B 体视显微镜NikonSMZ1-PS
VentElite 小动物呼吸机Harvard Apparatus55-7040
Vetergesic（10 mL，0.3 mg/mL 布托啡诺）CDMV Inc124918管制药品
Vevo 2100 软件Fujifilm-Visual Sonics

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141, 139(2020).
  2. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3 (6), eCollection 2018 (2018).
  3. Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Research in Cardiology. 97 (3), 206-213 (2002).
  4. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. 52, 2581(2011).
  5. De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: comparing permanent ligation and ischaemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
  6. Borlaug, B. A., Reddy, Y. N. V. The role of the pericardium in heart failure: Implications for pathophysiology and treatment. JACC Heart Failure. 7 (7), 574-585 (2019).
  7. Pfaller, M. R., et al. The importance of the pericardium for cardiac biomechanics: from physiology to computational modeling. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 18 (2), 503-529 (2019).
  8. Deniset, J. F., et al. Gata6(+) Pericardial Cavity Macrophages Relocate to the Injured Heart and Prevent Cardiac Fibrosis. Immunity. 51 (1), 131-140 (2019).
  9. Weber, G. F. Immune targeting of the pleural space by intercostal approach. BMC Pulmonary Medicine. 15, 14(2015).
  10. Nakatani, T., Shinohara, H., Fukuo, Y., Morisawa, S., Matsuda, T. Pericardium of rodents: pores connect the pericardial and pleural cavities. The Anatomical Record. 220, 132-137 (1988).
  11. Tyberg, J. V., et al. The relationship between pericardial pressure and right atrial pressure: an intraoperative study. Circulation. 73, 428-432 (1986).
  12. Hamilton, D. R., Sas, R., Semlacher, R. A., Kieser Prieur, T. M., Tyberg, J. V. The relationship between left and right pericardial pressures in humans: an intraoperative study. The Canadian Journal of Cardiology. 27, 346-350 (2011).
  13. Park, D. S. J., et al. Human pericardial proteoglycan 4 (lubricin): Implications for postcardiotomy intrathoracic adhesion formation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 156 (4), 1598-1608 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章