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转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

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DOI：

10.3791/62725

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2021年11月20日

 ,  ,  , 
1College of Pharmacy, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。

摘要

蛋白质生物学和小鼠遗传学的最新进展使得测量脑细胞内钙离子波动成为可能 体内 并与局部血流动力学进行关联分析。本实验方案采用经过慢性颅窗制备的转基因小鼠，其在α-平滑肌肌动蛋白启动子驱动下表达基因编码的钙离子指示剂RCaMP1.07，以特异性标记血管壁细胞，如血管平滑肌细胞和包被型周细胞。文中详细阐述了如何制备尾静脉导管用于静脉注射荧光染料以追踪血流，以及如何利用双光子显微镜测量脑内周细胞钙信号和局部血管血流动力学参数（如血管直径、红细胞流速等）。 体内 通过颅窗在氯胺酮/赛拉嗪麻醉的小鼠中进行成像。最后，提供了利用Barrett等人2018年开发的图像处理算法分析钙波动和血流影像的详细步骤，并重点说明了这些方法如何适配于其他细胞成像数据。

引言

中枢神经系统血管系统由穿支小动脉、毛细血管和上行小静脉组成。在此网络中，血管平滑肌细胞等壁细胞包裹着小动脉，而周细胞则沿最初的小动脉分支和毛细血管延伸出细胞突起1。周细胞在脑内似乎具有多种功能，包括维持血脑屏障1,2、迁移与运动能力3、潜在的干细胞特性，以及调节脑血流量4,5,6。许多周细胞的功能作用与细胞内钙离子浓度的波动相关，后者可能调控这些细胞的舒张或收缩4,5,6。

近期多项研究已为鉴定不同类型的脑周细胞制定了标准7,8. 穿支动脉前4级分支内的壁细胞是 包被性周细胞 基于其表达的收缩蛋白α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）以及具有突起的卵圆形胞体，且其突起包绕血管7,8,9为了可视化包被型周细胞中的钙离子波动，本实验方案采用了一种新型转基因小鼠品系 Acta2-RCaMP1.07，也称为 Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J。10这些小鼠在表达αSMA的细胞（血管平滑肌细胞和包被型周细胞）中表达红色基因编码的钙离子指示剂RCaMP1.07。繁育群体通过非携带者动物与半合子个体交配维持。RCaMP1.07是一种带有钙调蛋白结合域的红色荧光蛋白，当其与细胞内钙离子结合时荧光增强10,11本方案概述了通过双光子显微镜联合进行包被型周细胞钙成像与血流测量的步骤，包括荧光染料尾静脉注射、麻醉小鼠状态下的显微镜图像采集，以及利用编程平台进行数据分析的方法图1这些技术可用于研究壁细胞的生理学问题，也可经调整后用于研究脑内或其他器官系统中任何细胞类型的钙瞬变。

一只10月龄的雌性Acta2-RCaMP1.07小鼠用于本文所述实验。该小鼠在两个月前接受了慢性颅窗和头部固定装置植入手术。手术方案的详细信息见于先前的研究。12,13 类似的操作已在其他先前发表的方案中实施14,15血管系统通过静脉注射绿色荧光素标记的葡聚糖（70,000 MW，阴离子溶液，2.5% w/v）进行标记。该染料成本较低且可从商业渠道 readily 获得，但其发射光谱较宽，可能与RCaMP的发射光谱重叠，并在显微镜成像过程中产生串色干扰。 采集。为避免此问题，下文第4节概述了光谱解混的步骤，但也可使用发射光谱更窄的其他绿色染料，例如基于EGFP的染料。

方案

以下涉及实验动物的所有操作程序均已获得由加拿大动物护理委员会监管的曼尼托巴大学动物护理委员会批准。

1. 实验步骤的设置与准备

注意：尾静脉导管注射需要以下物品：胰岛素注射器、一段15 cm长的PE10导管、30 G针头、纱布、生理盐水、镊子、绿色荧光素葡聚糖染料、钳子和剪刀。此外，还需准备一针酮胺/甲苯噻嗪麻醉剂，在成像开始前注射使用。

重要提示：步骤1和步骤2中的所有材料和设备在使用前必须通过高压灭菌或用70%乙醇冲洗进行灭菌。如果镊子无法妥善灭菌，建议使用一对大型持针器。导管组装必须使用镊子和钳子操作，以避免意外的针刺伤。

  1. 剪取约 15–20 cm 的聚乙烯导管 PE10（内径 28 mm；外径 61 mm）。
  2. 用 0.9% 生理盐水填充一支 27 G 胰岛素注射器，并将针头插入聚乙烯导管末端。推动盐水使其流经导管，确保无泄漏。
  3. 使用镊子将一支 30 G 针头（0.3 mm × 25 mm）反复弯折，直至其从针座处断裂。针头必须洁净且无弯曲。
  4. 用镊子夹住针头，小心将其插入连接生理盐水注射器的 PE10 导管末端，并排除气泡。此装置即为注射用导管。
  5. 注射前，将 30 µL 的 2.5%（w/v）荧光素葡聚糖溶液通过 13–25 µm 滤器过滤。
  6. 用另一支胰岛素注射器吸取 30 µL 葡聚糖溶液，并确保注射器内无气泡。

2. 尾静脉注射

  1. 使用异氟烷（4% 诱导，1.5% 维持）或氯胺酮/赛拉嗪（60 mg/kg；10 mg/kg；腹腔注射）对小鼠进行麻醉，并涂抹眼用润滑凝胶。建议在成像期间使用氯胺酮/赛拉嗪以获得更稳定的血流测量效果；对于较长时间的成像，剂量可增加至氯胺酮 90 mg/kg、赛拉嗪 10 mg/kg。
  2. 当小鼠达到外科麻醉深度时，将装有温水的手套置于尾部，以扩张侧静脉。
  3. 30 秒后取下手套，并用乙醇清洁尾部。
  4. 将尾部夹在拇指与中指之间，用食指对尾部施加压力以扩张静脉。另一只手用镊子夹持导管针头，使针头斜面向上朝向天花板。
  5. 用 70% 乙醇清洁尾部后，平稳地以 0° 角将针头插入静脉，并通过导管轻轻注入生理盐水，以确认针头位置正确。
    注意：若推注活塞无明显阻力且尾部未出现肿胀，则表明针头已在静脉内。若阻力明显或出现肿胀，应拔出针头。可在尾部两侧各重复步骤 2.2–2.5 最多 3 次，每第二次尝试后更换导管末端的 30G 针头，直至成功置针。
  6. 针头进入静脉后，将导管末端的生理盐水注射器更换为含荧光素葡聚糖的注射器（步骤 1.6）。缓慢将葡聚糖注入导管管路，确保无气泡进入。若发现气泡，应剪除含气泡的管段，去除气泡后重新连接注射器。
  7. 当全部葡聚糖（30 µL 分样）注入后，取下注射器，换回生理盐水注射器。继续推注，将管路中残留的葡聚糖全部注入小鼠体内，直至管内无染料残留。
  8. 从尾部拔出针头，并用纱布按压 10–30 秒，直至出血停止。
    关键提示：若经过 6 次尝试仍未能成功完成尾静脉注射，则应另择时间进行成像。此外，注入小鼠体内的总体积（生理盐水与葡聚糖）不得超过 100 µL。

3. 双光子显微镜

  1. 聚焦于颅窗
    注意：在数据采集过程中使用氯胺酮/赛拉嗪麻醉，因其对血管的影响（血管扩张）小于异氟烷。如果在上述步骤中使用异氟烷，应在成像前通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪（推荐剂量见上文）。
    1. 通过头固定杆用螺丝将小鼠固定在显微镜下的加热平台上。
    2. 为小鼠的眼睛涂抹眼用润滑剂。
    3. 用湿润的牙科棉签清洁颅窗，确保无任何可能干扰成像过程的颗粒残留。
    4. 在窗口处涂抹超声耦合剂。
    5. 通过双光子显微镜物镜聚焦，直至在窗口下观察到软脑膜血管。
    6. 检查小鼠的呼吸，并确保加热垫提供足够的温度支持。
  2. 图像采集
    注意：本实验所用的双光子显微镜配备可调谐的钛宝石激光器用于荧光激发，并通过Pockel盒控制到达样品的激光强度。发射光经565长通二向色镜分光后，分别进入两个GaAsP光电倍增管（PMT），其中红色通道使用595/50带通滤光片，绿色通道使用525/70带通滤光片进行检测。
    步骤 3.2 至 3.4 中所述的操作使用本方案中双光子显微镜的专用软件进行（参见 材料表这些步骤可适用于其他显微镜软件和设备。
    1. 关闭室内灯光，在显微镜软件中将波长设置为990 nm，以激发RCaMP和荧光素-葡聚糖 2-P激光 盒子
    2. 通过点击来设置激光功率 功率/增益 盒子激光器 切片并调整 Pockels 1 细胞电压为30%或在1000量程上的数值为300。在此设置下，到达样品的激光功率先前已确定约为30 mW。
    3. 通过单击来设置PMT检测器灵敏度 功率/增益 盒子PMTs 切片并调节数值至700-800。
      注意：这些数值可根据荧光样品的强度进行调整，且在打开房间灯光之前应将其设置为零。
    4. 前往 图像分辨率 部分并点击 512 x 512 更高的分辨率以获得更大的图像尺寸。
    5. 点击 2-P激光/打开 打开2-P激光快门。
    6. 前往 扫描部分 并点击 活体扫描 按钮
      注意：使用这些参数进行活体扫描并提高分辨率后，可观察到 RCaMP 阳性的血管壁细胞以及荧光标记的血浆。如果信号较弱，可逐步提高普克尔盒（pockel）值，直至图像清晰。
      关键：在浅层组织中，激光功率不应超过 50 mW，本示例中这相当于普克尔斯盒设置中的 600。
  3. 获取壁细胞和血管网络的深度层像
    注意：建议采集深度层叠图像，以准确定位血管网络中的周细胞。包绕型周细胞位于穿支小动脉起始后的第一至第四级分支处。7,8,9本方案中使用的显微镜软件将深度层扫描称为 "Z系列".
    1. 在X、Y和Z方向上移动显微镜物镜，根据RCaMP标记的平滑肌细胞定位脑表面的一条大动脉。
    2. 点击 Z系列 盒子
    3. 聚焦于靠近软脑膜血管的组织顶部，点击此处将其设为零点及Z轴序列堆栈的顶部 当前Z系列/起始位置 [µm] 点击顶部带有四条黑色条纹和一条红色条纹的方框。
    4. 将焦平面下移至组织中所需深度，并通过点击将其设为图像序列的底部 当前Z系列/停止位置 [µm] 点击底部带有四条黑色条纹和一条红色条纹的方框。
    5. 将每个图像平面的厚度（步长）设置为 1–2 µm，方法是在下方的框中输入所需数值 "步长" 按钮（步长 按钮定位于 Z系列/当前Z系列部分这将决定在图像栈中获取的图片数量。
    6. 将激光功率设置为随着显微镜在图像序列中逐层深入而呈指数级增加，方法是单击 激光/光电倍增管补偿 框并选择 相对（指数梯度）.
    7. 为文件命名，选择保存文件夹，然后单击 开始Z系列扫描.
    8. 采集完成后，在图像处理软件中打开Z系列图像。
    9. 将两个通道合并为彩色图像，并通过点击方框浏览图像序列，寻找周细胞和感兴趣的血管 图像 | 颜色 | 拆分通道；图像 | 颜色 | 合并通道.
    10. 选择 感兴趣区域 （ROI）以包含周细胞，并保存其位置信息，以便在未来的成像过程中重新定位这些区域。
  4. T系列钙成像电影采集（时间）
    1. 参考上述的深度堆栈和感兴趣区域（ROI），在活体扫描模式下调整显微镜物镜的X、Y和Z轴位置，直至找到目标周细胞。
    2. 为采集周细胞钙信号事件的视频，需提高采集帧率（>每秒10帧）通过前往 图像分辨率 切片，并点击 128x128 盒子
    3. 将成像时间设置为 60 s，方法是点击 T系列 框中输入持续时间。
    4. 除了 保存路径 盒中，单击 三个点的按钮 更新保存路径，使用唯一的文件名。
    5. 通过调整数值来光学放大血管，以补偿较低的分辨率，并更清晰地观察周细胞 光学变焦 [倍] 部分
    6. 通过点击获取T系列 开始T系列.
  5. 使用显微血管造影（线扫描）进行血流动力学测量
    1. 聚焦于目标血管 512 x 512像素分辨率在 活体扫描 模式。
    2. 要测量血管直径和红细胞流速，请点击 线扫描 启动显微镜的一维扫描。
    3. 设置扫描持续时间（30–60 秒），单位为毫秒。
    4. 画一条平分目标血管并沿血管平行移动的线。这将在左侧生成血管直径的明场图，在右侧生成红细胞通过血管的轨迹图。
      注意：只要位于同一成像平面内，同一条线可用于测量多个血管。
    5. 命名文件并点击 开始线扫描 以获取数据。

4. 图像分析

  1. 钙成像动态分析。
    注意：本方案概述了光谱解混（图2）以及两种分析包绕型周细胞钙信号事件的方法：一种是使用手动选定的感兴趣区域（ROI）（图3），另一种是基于活动自动选择ROI（图4）16,17。为了从每个ROI的归一化钙信号轨迹中检测并分类信号峰，需对数据进行高通滤波和带通滤波处理，这有助于平滑数据以估算信号幅度和宽度，同时识别不同形态的峰：单峰、多峰和平台型信号（图3B）。该分析的参数可优化以检测不同类型的动态细胞信号。以下步骤需要使用图像处理软件和带有图像处理包的编程软件，这些软件包含上述用于分析钙成像视频的代码。请参见材料表以获取本方案中所用程序和软件包的完整列表。这些软件包可导入不同类型显微镜的成像数据，并保留图像的元数据。
    注意：步骤4.1.1–4.1.7描述了如何在图像处理软件中手动选择ROI，以便后续用于手动钙信号分析方法（步骤4.1.16）。
    1. 通过将.xml文件拖拽至软件工具栏，在图像处理软件中加载钙成像T序列。点击OK按钮。
    2. 对图像栈进行平均投影（图像处理软件将其标记为"Z投影"）。可通过点击工具栏中的Image | Stacks | Z projection完成此操作。
    3. 按照步骤3.3.9的方法，将两个通道合并生成彩色图像。
    4. 点击Analyze | Tools | ROI Manager打开ROI管理器窗口，或直接在键盘上按下字母"T"。
    5. 在图像处理软件工具栏中点击多边形工具，选择并勾勒出可见的包绕型周细胞结构，如胞体和突起。
    6. 点击ROI管理器窗口中的添加按钮，将选定的ROI加入ROI管理器。
    7. 点击重命名按钮为每个感兴趣区域赋予唯一名称，并点击更多>> | 保存将其保存为一个zip文件夹，以便后续在编程软件中加载。
      注意：步骤4.1.8–4.1.14描述了如何将钙T序列导入编程平台，以及如何将显微镜PMT检测到的不同荧光团信号解混至不同通道（图2）。
    8. 打开编程软件，并确保图像处理软件包所在的文件夹已添加至路径中（参见材料表）。
    9. 在编程平台命令窗口中调用BioFormats函数，将钙T序列导入编程软件，该操作将自动打开文件选择窗口。
    10. 输入所需数字以定义各通道内容。在本示例数据中，通道1输入=6（cellular_signal），通道2输入=1（blood_plasma）。
    11. 在编程软件中调用plot函数，将数据以视频形式绘制，便于可视化。
    12. 为消除荧光素葡聚糖的绿色荧光在红色RCaMP通道中的串扰，可在编程平台命令窗口中调用unmix_chs函数，在图像处理包中对通道进行解混。
    13. 在通道1中选择一个仅包含该荧光团荧光的区域，例如本例中的RCaMP。
    14. 选择一个仅包含荧光团2荧光的区域，例如本例中血浆中的荧光素。
    15. 选择一个不包含任一荧光团荧光的背景区域。该操作将生成一个光谱贡献矩阵，并应用于每个通道中的每个像素。这显著提高了RCaMP信号的定位精度，从而增强对这些结构中钙信号事件的检测能力。
      注意：如上所述，图像处理软件包中有多种方法可用于分析钙成像数据。步骤4.1.16–4.1.23描述了使用手动选定ROI分析包绕型周细胞钙信号事件的方法。
    16. 在解混后的钙成像视频上调用CellScan函数，运行细胞信号分析。
    17. 代码将提示"您希望使用哪种ROI检测方法？"。输入数字2以将手动选定的ROI加载至编程平台。
    18. 从之前手动选定的周细胞ROI所保存的zip文件夹中加载这些感兴趣区域（步骤4.1.6）。
    19. 代码将提示"比例因子是多少？"。确定手动选定ROI相对于当前分析图像序列的比例因子，并输入该数值。在本示例中，比例因子为1，因为ROI无需缩放，其选自分辨率为128×128像素的图像，与原始钙成像视频分辨率一致。
    20. 在命令窗口中调用process和plot函数，生成各ROI及其归一化钙信号轨迹的彩色图（图3A）。
    21. 若代码未能检测到大多数个体轨迹中的钙信号事件，可在配置优化框中调用opt_config函数，调整内置参数，例如将高通滤波数据的阈值降低至基线期（T序列前30帧）标准差的三倍。
    22. 在优化框中点击处理按钮，应用新参数。
      注意：为检测和分类信号，归一化钙信号轨迹需进行高通和带通滤波，这有助于平滑数据以估算幅度和宽度，同时判断信号为单峰、多峰还是平台型（图3B）。
    23. 在命令窗口中调用output_data函数，将数据输出为包含ROI空间信息及识别出的信号峰的.csv文件。为便于后续统计分析，请为文件命名唯一名称。
      注意：步骤4.1.24–4.1.31描述了使用基于活动的ROI分析方法来分析包绕型周细胞钙信号事件。
    24. 重复步骤4.1.8–4.1.16，导入钙成像视频、解混通道，并在编程平台中调用CellScan函数。
    25. 代码将提示"您希望使用哪种ROI检测方法？"。输入数字6以选择基于三维（x、y和时间）荧光活动变化的自动ROI识别方法（"3D FLIKA算法"）。
    26. 在命令窗口中调用process和plot函数，绘制处理结果，以不同颜色显示识别出的ROI。每个ROI在时间和空间上均被区分，并以叠加掩膜形式呈现（图4）。
    27. 若算法未能检测到肉眼明显可见的ROI，可在优化框中调用opt_config函数，调整内置参数，例如增加时间维度上的高斯滤波（2秒）并降低ROI检测阈值至基线标准差的三倍。
    28. 在优化框中点击处理按钮，应用新参数。经过优化后，应能识别出更多ROI（图4B）。
    29. 在优化窗口中将默认模式更改为视频，以视频形式绘制ROI，清晰显示活动区域（以彩虹色轮廓标出），便于进一步可视化。
    30. 在命令窗口中调用output_data函数，将数据输出为csv文件。该文件可在统计软件中进一步分析。
      注意：分析参数可调整以适应任何类型的动态细胞信号（钙信号、FRET比值等）。上述所有步骤均可通过简单的编程代码实现自动化，以便批量处理多个具有相同设置的钙成像视频。
  2. 线扫描血流分析。
    1. 将第3.5节获取的线扫描kymograph数据文件导入编程软件。
    2. 代码将提示"通道1和通道2分别显示什么？"。根据提示定义各通道内容。在本示例中，通道1为空（输入0），通道2为blood_plasma（输入1）。
    3. 调用LineScanDiam函数运行线扫描的直径分析，该操作将弹出一个窗口，用于在kymograph中选择对应血管直径的区域（图5B，左）。
    4. 在kymograph荧光边界外绘制一个对应血管直径的矩形框。
    5. 调用process函数处理该数据类，以测量血管直径的半高全宽，并使用plot函数生成图表（图5C）。
    6. 在命令窗口中调用output_data函数，将数据输出为csv文件。该文件可在统计软件中进一步分析。
    7. 调用LineScanVel函数运行速度Radon变换分析，该操作将弹出一个窗口，用于在kymograph中选择对应红细胞速度的区域（图5B，右）。
    8. 在kymograph荧光边界内绘制一个对应血管流速的矩形框。
    9. 调用process函数处理该数据类，根据荧光条纹角度计算红细胞的速度、通量和线密度，并使用plot函数生成图表（图5D）。
    10. 在命令窗口中调用output_data函数，将数据输出为csv文件。该文件可在统计软件中进一步分析。
      注意：kymograph必须具有清晰的荧光信号和明确的黑色背景边界，以确保直径和速度分析的准确性（图5A，B）。必须精确绘制正交和平行线，否则将无法对kymograph进行可靠分析。与使用图像处理算法进行钙信号分析类似，直径和速度计算的参数也可进行优化。

结果

异硫氰酸荧光素-葡聚糖具有较宽的发射光谱，可能渗漏至红色通道，从而影响包绕型周细胞中 RCaMP 的检测（图 2A）。在软件程序中采集数据后进行光谱拆分，可减少异硫氰酸荧光素的渗漏（图 2B，下），从而增强后续分析步骤中的钙信号检测。

使用本实验方案中图像处理算法进行钙离子分析，可采用多种不同方法来识别感兴趣区域（ROIs）及细胞内钙离子波动（即钙信号）。手动选取细胞结构可实现对这些区域内钙离子波动的检测图3A），包括归一化钙信号轨迹经过低通和带通滤波后出现的不同类型的信号峰，如单峰和多峰图3B）。此外，通过采用Ellefsen等人于2014年开发的图像处理算法，将荧光强度随时间变化的活跃像素进行聚类，从而识别出感兴趣区域（ROIs）。16 和 Barrett 等人，201817 (图4）。通过调整时间、阈值和空间参数以涵盖预期信号的大小和形状，该方法可适用于任何动态细胞信号。降低信号识别的阈值可检测到更多的感兴趣区域（图4B).

明亮清晰的血流动力学扫描图可用于测量包绕型周细胞附近血管的管径和红细胞（RBC）流速（图5A，B）。管径通过荧光信号半高全宽计算得出（图5C）。RBC流速通过无标记RBC形成的条纹进行估算，将条纹角度输入Radon变换，以计算流速、通量（细胞/秒）和线密度（细胞/毫米；图5D）。当扫描图质量较差，如出现荧光饱和、信噪比低或成像视野移动（图6A）时，会导致数据不可靠，产生无法确定数据的误差点（红色叉号）（图6B，C）。所获取数据的质量对实验结果至关重要，遵循本方案中描述的步骤可确保获得良好的结果。

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图 1．方案概要。 本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。该方案分为四个步骤：1）实验准备：设备安装与导管制备；2）尾静脉注射；3）通过双光子显微镜进行数据采集；4）利用图像处理算法进行数据分析。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 2. 荧光染料的光谱解混。A) 来自T系列采集的RCaMP包绕周细胞与荧光素-葡聚糖标记的血管的代表性平均图像。比例尺 = 10 µm。B) 上图：在单独考虑各通道时，通道2的串扰在通道1中明显可见（左图）。下图：经过光谱解混后，串扰减少，RCaMP在周细胞结构中的信号更加显著。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3手工挑选的感兴趣区域及优化后的钙信号轨迹。 A) 在所用图像处理软件中选定的兴趣区域（彩虹色形状）可用于识别钙信号轨迹。B) 通过对归一化轨迹数据进行低通和带通滤波，识别信号峰值。我们将信号阈值定义为基线期（前30帧）标准差的3倍，超过该阈值的任何峰值均被视为有效信号（下部轨迹）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图 4．用于钙成像分析的自动化基于活动的感兴趣区域（ROI）。 相同数据分别以基线标准差的7倍（A）和3倍（B）作为阈值进行分析。降低识别活跃像素的阈值可检测到更多的感兴趣区域（B）以及周细胞内的信号峰（饼状图）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 5。显微血管动力学测量的线扫描图像（Kymograph）。 A）穿过血管的线扫描示例。B）血管直径（左）和血流速度（右）的清晰线扫描图像示例。右侧荧光带中的黑色条纹对应红细胞（RBCs）。C）显示明显血管节律性收缩波动的直径分析结果。D）速度分析结果，图中Y轴显示红细胞通量（cells/s）、线密度（cells/mm）、速度（mm/s）、条纹角度（度）、信噪比（任意单位，a.u.），X轴为时间（sec）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6。低质量血流动力学测量结果的示意图。 A) 低质量明场显微图像的示例，显示荧光饱和、信噪比差，或在图像采集过程中成像视野发生移动。B 和 C) 与图7类似的图表，展示因明场图像质量差而导致包含误差点（红点）的管径和流速数据。（图像 E，Y 轴=管径 (µm)，X 轴=时间 (sec)；图像 F，Y 轴=红细胞通量 (cells/s)、线密度 (cells/mm)、流速 (mm/s) 和条纹角度 (degree)、信噪比 (a.u.)，X 轴=时间 (sec)）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方法详细介绍了使用导管进行小鼠尾静脉注射、双光子显微镜深度层析成像、细胞钙信号动态成像、血流动力学kymograph图生成，以及利用我们开发的图像处理算法17（图1）对钙信号和血流动力学参数进行分析。in vivo 成像技术具有多项优势，可提升成像质量，同时减少实验过程中的时间消耗、资源使用和动物应激反应。首先，采用导管进行尾静脉注射可更精确地控制针头、注射器及注入循环系统的药剂量，同时避免染料误注入尾部组织，从而节省昂贵的试剂。其次，我们使用转基因小鼠，其束鞘型周细胞表达基因编码的钙传感器，并展示了如何通过深度z层析成像在脑血管网络中定位这些细胞，便于在长期的后续成像实验中对同一细胞进行识别与重定位。这一点在周细胞研究中至关重要，可确保细胞分类的准确性6,7。第三，我们提供了采集钙信号动态影像和血流动力学线扫描数据的参数设置，为动态细胞信号的测量提供了良好的起始条件。最后，我们介绍了我们开发的图像处理算法17——一个全面的图像处理工具箱，包含多种图像预处理方法（如光谱解混）、钙成像分析和血流动力学分析（如血管直径、血流速度等）模块。这些算法可自动生成图表，实现数据的快速直观可视化，同时降低用户分析结果所需的专业技能门槛。此外，通过少量代码即可实现自动化，对多个数据集进行相同参数的批量处理，从而有望提升数据可视化效率并减少研究人员的时间投入。

获得高质量钙成像数据的关键在于调整激光功率和PMT设置，以获取清晰的荧光信号，同时以足够高的帧率采集数据，从而完整捕捉整个钙信号事件。本方案中的数据采集速率为每秒10至11帧，足以捕捉包被型周细胞中较慢的钙振荡。数据分析过程中也有多个步骤可提升分析效果。首先，当荧光染料的发射光谱存在显著重叠时，光谱解混（spectral unmixing）非常有益（图2）。本方案使用了荧光素标记的葡聚糖（fluorescein-dextran），因其价格低廉、商业化程度高，且常用于血流动力学测量5。光谱解混有助于清理数据，增强钙信号的检测效果，但也可选用发射光谱更窄的其他荧光染料。其次，手动选择细胞结构作为感兴趣区域（ROIs）（图3）有助于对不同亚细胞区域（如胞体或突起分支）中的钙信号事件进行分类。基于活动性的感兴趣区域选择方法（图4）16可提供关于单个钙信号事件更丰富的时空信息，这在确定特定区域内钙事件的发生频率或事件向其他细胞区域的传播时尤为有用。使用编程软件分析成像数据可在批量处理数据时为研究人员节省大量时间，但需要投入一定初始时间调整参数以获得最佳结果。最重要的参数包括预期的活性区域大小（以 µm2 为单位）以及信号持续时间（必须定义最小和最大信号时间）。研究人员应首先查看一些T系列图像示例，以确定最适合其数据的参数设置。最后，显微镜上采集的低质量数据会严重阻碍钙信号和血流动力学的分析（图6）。因此，应在实验初期仔细优化显微镜的采集参数。考虑到上述因素，本方案可被调整用于其他组织或细胞类型中钙成像或其他动态细胞信号（例如荧光钠、钾、代谢物或电压波动）的分析。

本方案存在若干局限性。首先，数据是在麻醉状态下采集的，而麻醉会影响脑部活动，并可能对血流产生影响。类似的成像可在经过训练、能够耐受头部固定的清醒小鼠中进行，以获得更接近生理状态的结果。此外，需要牢记的是，我们是在活体（in vivo）条件下对三维的细胞和血管进行二维成像。因此，我们每次仅能捕捉到这些细胞内部分钙信号事件，或单个血管切面中的血流情况。

另一个需要注意的局限性是，双光子钙成像对运动伪影较为敏感，焦平面内的移动可能被误认为是钙信号波动。本实验方案在麻醉条件下进行，可限制动物的整体运动；然而，小鼠的呼吸频率、心率、可能发生的组织肿胀，以及包被型周细胞情况下血管的收缩或血管运动，仍可能引入运动伪影4,6,18,19。可通过多种策略减轻运动伪影的影响。本方案所使用的图像处理软件包包含一个可选的运动校正步骤，该步骤利用二维卷积引擎，根据T系列图像中可见的血管结构对图像进行对齐13,17。该算法可识别焦平面发生显著变化的帧，并将其排除在分析之外。此外，也可在图像处理软件包中采用统计学方法，例如在生成荧光轨迹时使用Z分数，以标准化由运动引起的钙信号波动20。应对双光子成像中运动伪影最可靠的方法是在同一细胞内共表达两种荧光指示剂，例如一种钙指示剂（如GCaMP）和一种钙不依赖性荧光报告蛋白（如mCherry）。荧光报告蛋白信号的波动可归因于运动，将其从钙指示剂信号中扣除，即可实现对运动伪影的校正。

本实验方案的目的是阐明如何采集最佳的钙成像和血流数据 体内 并介绍研究人员可采用的新方法和分析工具，以提升其实验结果。这些技术可用于研究不同周细胞群体在血流调控或不同脑部疾病状态中的作用。这些成像参数也可用于研究其他细胞类型和器官系统中的钙信号与血流变化，且类似原理适用于基于其他基因编码传感器（除钙以外）所实现的各类动态成像技术。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

J. Meza 获得 Mitacs 和 Research Manitoba 提供的博士后奖学金支持。本研究工作得到了加拿大卫生研究院、Research Manitoba、曼尼托巴医学服务基金会、曼尼托巴大学启动资金以及通过加拿大脑研究基金由 Brain Canada 资助的支持，其中加拿大卫生研究院的资金来自加拿大卫生部和 Azrieli 基金会的财政支持。本文所表达的观点不一定代表加拿大卫生部长或加拿大政府的观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Acta2-RCaMP1.07杰克逊实验室28345在视频方案中使用的动物模型为雌性小鼠  的  10个月又1天大。
施用器（常规型）比斯科X-80250P
MATLAB 的 BioFormats 软件包NANA在本方案中称为 "图像处理软件包".  可在以下网址获取：https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/
CHIPS MATLAB 工具箱NANA在本方案中称为 "图像处理算法"Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS：用于细胞与血流动力学双光子图像分析的可扩展工具箱. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. 可获取于: https://github.com/EIN-lab/CHIPS
透明超声凝胶，中等黏度HealthCare PlusUGC250
葡聚糖，荧光素，70,000 分子量，阴离子赛默飞世尔科技D1823
葡聚糖，Texas Red，70,000 MW，中性赛默飞世尔科技D1830
Eye Lube PlusOptixcareNA
FIJIImage JNA在本方案中称为 "图像处理软件".  可在：https://imagej.net/Fiji/Downloads 获取
GCaMP6sfl/fl杰克逊实验室
头部后固定平台苏黎世大学NA
氯胺酮（Narketan 100 mg/mL）Vetoquinol440893
MATLAB R2020bNA在本方案中称为 "编程平台 ". 可在以下网址获取：https://www.mathworks.com/downloads/
针头 0.3 mm × 25 mmBD PrecisionGlide305128
目标 XLUMPLFLN20XW奥林巴斯NAhttps://www.olympus-lifescience.com/zh/objectives/lumplfln-w/
PDGFRβ-CreERT2杰克逊实验室30201
聚乙烯管，PE10，内径28 mm（0.11”) O.D. 61 mm (.024”)BD Intramedic427401
普雷里维尤布鲁克荧光显微镜NAhttps://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
Ultima 体外多光子显微镜布鲁克荧光显微镜NAhttps://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html
水族箱底部加热器Reptitherm U.T.HE169064
赛拉嗪（Rompun 20 mg/mL）拜耳医药保健2169592

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转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内
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