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方法文章

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

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DOI：

10.3791/62727

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2021年6月30日

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1Department of Pathobiology, University of Guelph

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 >1 × 1013 拷贝/mL 的病毒基因组，所获载体数量足以满足大型动物实验的需求。

摘要

腺相关病毒（AAV）载体是目前临床进展最快的基因治疗载体之一，已有三种AAV基因疗法获批用于人类。AAV新型应用的临床推进涉及从小型动物模型（如小鼠）向大型动物模型（包括犬、绵羊和非人灵长类动物）的过渡。向大型动物施用AAV的一个限制因素是需要大量高滴度的病毒。虽然悬浮细胞培养是一种可放大的AAV载体生产方法，但很少有研究实验室具备相应的设备（例如生物反应器）或掌握此类AAV生产技术。此外，与贴壁培养的HEK293细胞相比，悬浮培养的HEK293细胞产生的AAV滴度通常显著较低。本文介绍了一种利用细胞叠层培养法大量生产高滴度AAV的方法。同时提供了详细的AAV滴度测定方案以及验证载体纯度的方法。最后展示了在绵羊模型中AAV介导的外源基因表达的代表性结果。这一优化的贴壁细胞大规模AAV载体生产方案将有助于分子生物学实验室推进其新型AAV疗法在大型动物模型中的测试。

引言

利用腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗在过去三十年中取得了巨大进展1,2。在多种遗传性疾病中已显示出疗效改善，包括先天性失明、血友病以及肌肉骨骼系统和中枢神经系统疾病，这使AAV基因治疗成为临床研究的前沿领域3,4。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准了Glybera，这是一种表达脂蛋白脂肪酶（LPL）的AAV1载体，用于治疗LPL缺乏症，使其成为欧洲或美国首个获得上市许可的基因治疗产品5。此后，又有两种AAV基因疗法——Luxturna6和Zolgensma7——获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，预计未来5年内该市场将迅速扩展，到2025年可能有10至20种基因疗法获批上市8。现有的临床数据表明，AAV基因治疗是一种安全、耐受性良好且有效的治疗方式，使其成为最有前景的病毒载体之一；目前在ClinicalTrials.gov注册的涉及AAV的临床试验已超过244项。随着对AAV载体临床应用的兴趣日益增加，迫切需要建立稳健且可放大的生产方法，以推动AAV疗法在大型动物模型中的评估，这是转化研究流程中的关键步骤9。

对于AAV载体的生产，两个主要要素是AAV基因组和衣壳。野生型（wt）-AAV的基因组为单链DNA，长度约为4.7 kb10。wt-AAV基因组两端含有反向末端重复序列（ITRs），对包装过程至关重要，中间包含rep和cap基因11。在AAV载体生产中，rep和cap基因（对基因组复制、病毒衣壳组装以及基因组包封进病毒衣壳必不可少）会从病毒基因组中被移除，并以反式提供12。将这些基因从病毒基因组中删除，可为治疗性转基因及其所有必要的调控元件（包括启动子和polyA信号）腾出空间。ITRs保留在载体基因组中，以确保基因组的正确复制和病毒包封13,14。为了提高转基因表达的动力学特性，可将AAV载体基因组设计为自互补型，从而避免AAV基因组复制过程中单链DNA向双链DNA的转换，但其编码容量会降低至约2.4 kb15。

除了 AAV 基因组设计之外，衣壳血清型的选择决定了 AAV 载体在体内的组织和细胞嗜性in vivo2。除了组织嗜性外，不同的 AAV 血清型还表现出不同的基因表达动力学16。例如，Zincarelli 等人17 将不同的 AAV 血清型分类为低表达血清型（AAV2、3、4、5）、中等表达血清型（AAV1、6、8）和高表达血清型（AAV7 和 9）。他们还将 AAV 血清型分为慢起效表达型（AAV2、3、4、5）和快起效表达型（AAV1、6、7、8 和 9）。这些不同的嗜性及基因表达动力学差异源于衣壳蛋白中的氨基酸变异、衣壳蛋白的构象以及与宿主细胞受体/共受体的相互作用18。某些 AAV 衣壳还具有额外的有利特性，例如在血管内给药后能够穿越血脑屏障（AAV9），或在长寿命的肌肉细胞中持续存在以实现持久的外源基因表达（AAV6、6.2FF、8 和 9）19,20。

本文旨在详细介绍一种经济高效的方法，用于生产高纯度、高滴度、适用于临床前大型动物模型研究的重组腺相关病毒（AAV）载体。该方法通过将双质粒转染至生长于细胞叠层中的贴壁人胚肾（HEK）293细胞来实现AAV的生产。此外，本研究还描述了一种肝素硫酸亲和层析纯化方案，适用于含有肝素结合结构域的AAV血清型，包括AAV2、3、6、6.2FF、13和DJ21,22。

目前有多种包装系统可用于生产腺相关病毒（AAV）载体。其中，双质粒共转染系统具有一定的实际优势，该系统将Rep和Cap基因以及腺病毒辅助基因（E1A、E1B55K、E2A、E4orf6和VA RNA）整合于同一个质粒（pHelper）中，相较于常用的三质粒（三重）转染方法，可降低质粒生产的成本23,24。携带目的基因表达盒的AAV基因组质粒（pTransgene）必须由ITR序列作为侧翼，且其长度不得超过约4.7 kb。由于转染过程中可能存在的细胞毒性效应，目的基因本身可能影响载体的滴度和纯度。本文描述了载体纯度的评估方法。采用该方法生产的载体滴度可达每毫升1 × 1013 vg，已在小鼠、仓鼠和绵羊动物模型中进行了评估。

表1：所需溶液的组成。本方案中各种溶液所需组分的必要信息，包括百分比和体积。请点击此处下载该表格。

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方案

1. 在细胞堆栈中对 HEK293 细胞进行双质粒转染

  1. 在设定温度的珠浴中解冻一支 HEK293 细胞冻存管 37 °C.
    注意：将完全 DMEM 预热至 37 °C 在解冻细胞时，应确保细胞在接种时处于低温状态，以避免温度变化对细胞造成冲击。确保细胞代数较低，理想情况下低于20代，以保证最佳的生长状态和转染效率。确保细胞经鉴定无支原体污染。
  2. 将冻存管中的内容物逐滴转移至含有10 mL预热完全DMEM的15 mL锥形管中，于500 x g离心细胞 g 5 分钟。
  3. 吸弃培养基，然后将 HEK293 细胞重悬于 20 mL 预热的完全 DMEM 培养基中。将细胞接种至 15 cm 培养皿中，并于 37 °C，置于5% CO₂环境中2.
  4. 将一个15 cm培养皿中的细胞分种到三个细胞培养腔中。
    1. 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，并用3 mL PBS轻柔洗涤培养板，避免破坏单层细胞。随后吸除PBS，加入3 mL胰蛋白酶。
    2. 孵育 2 分钟，温度为 37 °C 直至细胞从培养板上脱落，然后向培养板中加入7 mL完全DMEM以中和胰蛋白酶。
    3. 将所有培养基和细胞收集到一个15 mL离心管中，于500 x g离心以沉淀细胞 g 5 分钟。
    4. 吸弃15 mL离心管中的上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL完全DMEM培养基中。取1 mL细胞悬液加入每个含有20 mL完全DMEM培养基的15 cm培养皿中；轻轻摇动培养皿使细胞均匀分布，随后置于 37 °C，置于5% CO₂环境中2.
  5. 当细胞融合度达到80%时，重复步骤1.4.1和1.4.2。将上清液收集至50 mL锥形管中，轻轻倒置管子以确保细胞均匀悬浮。
  6. 通过混合测定细胞密度 10 µL 细胞样品的 10 µL 台盼蓝染色后，将混合液加入细胞计数板，用于细胞计数仪分析。
  7. 将1 L预热的完全DMEM与所需细胞悬液混合，用于接种细胞培养室（表面积为6360 cm²）2) 与 1 × 104 细胞/厘米²2将细胞混合物倒入细胞培养室中，轻轻旋转以使细胞均匀分布在每个单层上（图1）并在指定条件下孵育 37 °C，置于5% CO₂环境中2.
  8. 除了细胞培养腔室外，另在15 cm培养皿中接种1 × 10⁶个细胞4 细胞/厘米²2 作为汇合度的参考。
  9. 孵育约65小时后，检查参照培养板的汇合度，理想情况下应达到约80%–90%汇合。
    注意：将完全培养基 DMEM 预热后用于添加至细胞培养腔室 37 °C.

细胞培养基转移、烧瓶倾倒示意图、生物技术实验室技术、液体操作。
图1：细胞接种和转染过程中细胞堆栈的操作步骤。进行细胞接种时，首先取下其中一个通气盖，将1 L预热的完全DMEM培养基（含所需数量的HEK293细胞）倒入细胞堆栈中（A）。通过拧紧两个通气盖，轻轻晃动使细胞和培养基均匀分布，并将所有培养基集中到细胞堆栈的一个角落，然后将通气盖置于该角落（B）；将细胞堆栈侧放（C），再将其旋转90°（D），使通气口朝上（E）。然后轻柔地将细胞堆栈放回正常的水平位置，确保堆栈内所有腔室均被培养基完全覆盖（F）。进行转染时，拧开两个通气盖，缓慢将旧培养基倒入无菌废液容器中，倾倒过程应保持平稳，避免扰动细胞单层（G）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 按3:1（w/w）的质量比配制聚乙烯亚胺（PEI）/DNA混合物。
    1. 在50 mL锥形管中，将475 µg pTrangene和1425 µg pHelper加入40 mL低血清培养基中，配制成pHelper与pTrangene质量比为3:1的DNA混合液。
      注意：PEI/DNA混合物的配比计算可参考表2。
    2. 将5.7 mL PEI（1 g/L）逐滴加入含低血清培养基的DNA混合液中，短暂涡旋混匀，室温孵育10分钟。
      注意：PEI/DNA混合物在室温孵育过程中会略微变浑浊。
  2. PEI/DNA混合物孵育8分钟后，移除细胞培养室中的培养基。
    ​注意：操作时应确保松开两个橙色盖帽，以保持培养基流动顺畅，避免细胞脱落。
  3. 将PEI/DNA混合物加入1 L预热的完全DMEM培养基中，缓慢倒入细胞培养室的加样口。使液体均匀分布至所有通道（图1），于37 °C、5% CO2条件下孵育72小时。

2 收获AAV并化学裂解转染的HEK293细胞

  1. 剧烈振荡细胞培养室，使细胞脱落，直至培养基因悬浮的细胞而变得浑浊，然后倒入四个 500 mL 离心管中。
  2. 在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 30 分钟，使细胞沉淀。将澄清的上清液倒入 1 L 聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚物（PETG）瓶中。
    注意：若无高速离心机，可在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 40 分钟。此转速下细胞沉淀可能不够紧密，在倾倒上清液时沉淀会滑动。
  3. 用 50 mL 裂解缓冲液重悬各 500 mL 离心管中的细胞沉淀，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
  4. 以 18,000 × g 离心 30 分钟，然后将上清液转移至同一个 1 L PETG 瓶中。弃去沉淀的细胞碎片。
    ​注意：应立即纯化澄清的上清液，可于 4 °C 保存最多 72 小时。如需长期保存，请置于 -80 °C。切勿在 -20 °C 保存。

使用肝素亲和层析纯化3种AAV载体

  1. 将粗裂解液从 -80 °C 取出，在 4 °C 下过夜解冻。解冻后，使用 0.22 µM 滤器过滤粗裂解液。
  2. 为钝化离心浓缩装置，每个肝素琼脂糖柱需向离心浓缩装置中加入 4 mL 滤器预处理缓冲液。在室温下钝化 2–8 小时。应在纯化步骤开始前立即进行钝化处理。
  3. 安装管路和泵（图 2）。
    1. 将管路放入蠕动泵中，泵入 20 mL 1 M NaOH。随后泵入 50 mL 分子生物学级水，再泵入 50 mL 基础 DMEM。
    2. 将 5 mL 肝素琼脂糖柱连接至管路，泵入 25 mL 基础 DMEM 以去除防腐剂。
  4. 以 1–2 滴/秒的流速将过滤后的粗裂解液以 0.2 µM 通过层析柱。

用于流体转移的实验室蠕动泵装置，是色谱实验的关键设备。
图 2：用于 AAV 纯化的蠕动泵装置。 将管路从粗裂解液引出，穿过蠕动泵，然后接入肝素基质层析柱。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：切勿引入气泡或让柱子流干，否则会破坏柱子并影响 AAV 的洗脱。如果柱子流干，请丢弃该柱子，并对剩余的粗裂解液使用新的柱子。

  1. 将所有粗裂解液上样至肝素柱，并使用以下溶液洗涤柱子。
    1. 使用不含 Mg 的 50 mL 1x Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤2+ 和 Ca2+.
    2. 用不含 Mg 的 HBSS 配制的 0.5 % N-月桂酰肌氨酸钠溶液 15 mL 洗涤2+ 和 Ca2+.
    3. 使用不含 Mg 的 50 mL HBSS 洗涤2+ 和 Ca2+.
    4. 使用 50 mL 含 Mg 的 HBSS 洗涤2+ 和 Ca2+
    5. 使用 50 mL 含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 200 mM NaCl/HBSS 溶液洗涤2+.
    6. 用含 Mg 的 300 mM NaCl/HBSS 缓冲液洗脱 5 次，每次 5 mL（共 25 mL）2+ 和 Ca2+ 并将洗脱液标记为 E1–E5（每次洗脱体积为 5 mL）。
  2. 使用离心浓缩器浓缩病毒
    1. 将含有预处理缓冲液的离心浓缩管在900 x g下离心 g 2 分钟。弃去滤液。
    2. 用 4 mL 含 Mg 的 HBSS 冲洗离心浓缩过滤器2+ 和 Ca2+ 并以 1000 x g 离心 g 2 分钟；弃去流穿液。
    3. 将洗脱液 E2 加入离心浓缩仪中，在 1000 x g 5 分钟后弃去流出液。
    4. 加入E2后，再加入E3至离心浓缩仪中，以1000 × g离心 g 5 分钟，直至浓缩的病毒体积约为 1 mL。
      注意：离心时避免将载体体积浓缩至滤膜水平以下。请勿在离心浓缩器中浓缩 E1、E4 或 E5，因为这些组分中载体含量极少或几乎不含载体，且含有污染物。
    5. 使用带滤芯的 p200 吸头从离心浓缩器中取出浓缩后的病毒，并转移至无菌的 1.5 mL 离心管中。
    6. 用离心浓缩器冲洗 200 µL 含 Mg 的 HBSS2+ 和 Ca2+ 用力吹打数次（约30秒），以去除滤膜上残留的AAV。充分吹打以使黏附在膜上的病毒脱落，并将液体转移至含有其余病毒的1.5 mL离心管中。充分混匀该离心管。
    7. 等分试样 5 µL 用于DNA提取，并将纯化的载体保存于-80 °C.
  3. 用25 mL 2 M NaCl洗涤层析柱。随后使用预热至指定温度的25 mL 0.1% Triton X-100进一步洗涤。 37 °C 洗涤柱子。接下来，使用 50 mL 无菌 dH₂O 洗涤柱子。2然后用25 mL的20%乙醇洗涤。
  4. 确保柱膜完全浸润于20%乙醇中，因为这是保存溶液。用提供的塞子密封柱子，并于 4 °C.
  5. 将管路储存于 1 M NaOH 中。
    注意：如果清洗得当，肝素琼脂糖柱最多可重复使用五次。

4 种 AAV 基因组 DNA 提取

  1. 在PCR管中配制用于DNase处理的反应体系，具体成分见表3。
组分体积
纯化的 AAV 载体5 μL
10x DNase 缓冲液2 μL
DNase1 μL
ddH2O12 μL
终体积20 μL

表3：DNase处理主混合液配方。 在AAV病毒载体DNA提取过程中进行DNase处理所需的推荐组分及体积。

  1. 涡旋PCR管以混匀，并短暂离心PCR管使内容物沉降至管底。
  2. 使用PCR仪，在37 °C孵育20分钟，随后在75 °C孵育15分钟，以热失活DNase。
  3. 加入5 µL蛋白酶K。
  4. 使用PCR仪，在50 °C孵育60分钟，然后在95 °C孵育30分钟，以热失活蛋白酶K。
  5. 使用DNA纯化试剂盒去除潜在污染物。
    注意：本步骤使用市售的血液与组织纯化试剂盒（材料表）。
    1. 向含有经DNase/蛋白酶K处理的载体的PCR管中加入200 µL AL缓冲液（血液与组织纯化试剂盒，材料表）。
    2. 涡旋PCR管，并在PCR仪中于56 °C孵育10分钟。
    3. 将PCR管中的液体转移至置于收集管中的无菌离心柱中。
    4. 向离心柱中加入200 µL 100%乙醇，并通过涡旋充分混匀。
    5. 在6,000 x g条件下离心1分钟，弃去穿流液。
    6. 向离心柱中加入500 µL AW1缓冲液（血液与组织纯化试剂盒，材料表）。
    7. 在6,000 x g条件下离心1分钟，弃去穿流液。
    8. 向离心柱中加入500 µL AW2缓冲液（血液与组织纯化试剂盒，材料表）。
    9. 在15,000 x g条件下离心3分钟，弃去穿流液。
    10. 将离心柱放入一个无菌的1.5 mL离心管中，并将200 µL AE缓冲液（血液与组织纯化试剂盒，材料表）直接加入离心柱膜上。
    11. 室温孵育1分钟。
    12. 在6,000 x g条件下离心1分钟，以洗脱DNA。
    13. 将DNA储存于-20 °C。

使用定量聚合酶链式反应和猴病毒40（SV40）探针滴定AAV载体基因组

注意：所有 qPCR 操作均须在 PCR 超净工作台中进行，并使用带滤芯的吸头，以避免外源 DNA 污染。如果 AAV 基因组未编码 SV40 polyA 序列，请使用针对 ITR 的探针，该探针在其他文献中有描述25。确保选作标准品的质粒 DNA 包含 SV40 polyA 序列。

  1. 标准品储备液的制备
    1. 将标准质粒DNA（含有SV40 polyA序列的pTransgene质粒）稀释至终浓度为10 µg/µL，并以6 µL分装后于-20 °C保存。
    2. 使用以下在线计算器26确定质粒DNA标准品中的拷贝数。
      注意：应使用由商业供应商提供的质粒DNA作为标准品，以确保其质量和浓度准确。建议制备大量标准品（例如10 mL），以便在更换新批次标准品时进行桥接研究。
  2. 在1.5 mL离心管中，为样品和标准品配制下表4中所述的试剂混合液。
    注意：应额外多配制一定量的主混合液。引物/探针序列见Table 5。
组分体积
通用qPCR预混液（2X）10 μL
分子级水4.5 μL
40x SV40 polyA 引物/探针0.5 μL
终体积15 μL

表4：用于AAV滴度测定的qPCR预混液。对从AAV病毒载体中提取的DNA进行qPCR检测时所需的推荐组分及体积。

组分序列
正向引物5’-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3’
反向引物5’-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3’
探针/56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABkFQ

表5：针对SV40 polyA DNA序列的引物序列。用于qPCR滴定的引物和探针序列，可结合含有SV40 polyA序列的AAV病毒载体的特定区域。

  1. 用移液器上下吹打混匀主混合液。
  2. 准备稀释板。
    1. 使用透明的96孔板进行标准品和样品的稀释，从第1列开始，每隔一列（即第1、3、5、7、9和11列）的每个孔中加入45 µL分子生物学级水。
    2. 向A1孔中加入5 µL标准品，并用移液器吹打混匀。
    3. 使用新的带滤芯移液器吸头，将A1孔中的溶液转移至B1孔，制成1/10稀释液。
    4. 沿该列继续进行10倍系列稀释，直至G1孔。
    5. H1孔不加任何溶液，作为空白对照。
    6. 加入第一个样品（S1），将其添加至A3孔，形成1/10稀释液。吹打混匀后，转移5 µL至B3孔，转移完成后丢弃吸头。
    7. 使用新的移液器吸头，混匀B3孔中的溶液，形成1/100稀释液。将5 µL该混合液转移至C3孔，转移后丢弃吸头。
    8. 使用新的移液器吸头，上下吹打C3孔中的溶液，制成1/1000稀释液。完成后丢弃吸头。
    9. 继续对样品进行稀释，但不在第2、4、6、8、10或12列中加入任何样品。
    10. 所有样品稀释完成后，混匀第1列各孔内容物，然后向第2列各对应孔转移20 µL。
    11. 对第3、5、7、9和11列重复上述操作，以获得每个标准品和样品稀释液的重复孔。参见图3了解板布局。
      ​注意：按照图3所示板布局操作时，G行和H行稀释的样品仅包含1/10和1/100两个稀释度。

ELISA 标准曲线、样本和阴性对照的微孔板稀释系列示意图。
图 3：qPCR AAV 滴度测定的孔板布局。 蓝色表示标准品系列稀释液的位置；绿色表示阴性对照的位置；紫色表示样本稀释液的位置。每个标准品、阴性对照或样本均设置重复孔。图中示例标注了标准品的浓度，以展示标准品的稀释系列，样本稀释液的位置也已标注至相应孔中。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 基于SV40 polyA检测的qPCR滴定
    1. 向白色半裙边96孔qPCR板的每孔中加入15 µL qPCR预混液。
    2. 将透明96孔板中每个样本的5 µL转移至白色半裙边96孔qPCR板中。
    3. 使用多通道移液器确保qPCR预混液与样本充分混匀。
    4. 用封板膜密封反应板，并在1500 x g 条件下离心30秒。
    5. 在基于板式的实时PCR扩增与检测仪器上运行qPCR反应，采用表6中建议的反应条件。
步骤循环次数时间温度说明
预变性1次5 分钟95 °CDNA变性。
扩增38次15 秒95 °CDNA扩增。若使用具有不同退火温度的其他引物，可调整设置。
60 秒60 °C
降温1次60 秒40 °C反应板降温。运行结束。

表6：基于水解探针的qPCR滴定热循环仪程序。 推荐用于提取纯化的AAV载体DNA进行探针法qPCR滴定的热循环仪程序。

注意：qPCR AAV 滴定工作表见表7。

  1. 数据分析以确定 AAV 基因组拷贝数。
    1. 将 qPCR 实验中获得的标准品和样品稀释液的浓度值填入电子表格数据单元格（表 7A）。
    2. 利用 表 7A 中的浓度值绘制标准曲线（表 7B）。
      注：标准曲线将以自然对数形式呈现（y = a ln(x) + b），并附带 R2 效率值。标准曲线的扩增效率应接近 100%，R2 应接近 1.0（≥0.99）。
    3. 通过填写此在线计算器27 来填写斜率效率。
      注：qPCR 扩增效率在 90%–110% 范围内可接受。若 qPCR 扩增效率超出此范围，需重新进行 qPCR 实验。
    4. 利用 表 7A 中的浓度值，计算每个样品各稀释度的平均值，并确定每个样品的标准差（表 7C）。
      注：应剔除偏离样品稀释液平均值超过一个标准差的稀释数据。
    5. 根据每个稀释度的平均浓度，乘以稀释倍数，再除以 5，得到每个样品的病毒基因组（vg）/µL 数量（表 7C）。
    6. 通过将每个样品浓度的平均值乘以 80,000，计算出每个样品的 vg/mL 数量（表 7C）。
    7. 对每个稀释度的 vg/mL 值取平均，得出每个样品最终的 vg/mL 值（表 7C）。
      ​注：用户必须将每个稀释度的平均浓度除以 5，以校正 qPCR 实验中每孔加入的 5 µL 样品体积，从而获得 vg/µL 浓度。因子 80,000 用于将样品平均浓度转换为 vg/mL。首先，每个样品浓度平均值需乘以 2，以校正单链基因组的影响，因为引物-探针组仅定量正义单链 DNA（ssDNA），而 AAV 基因组中正义与反义单链 DNA 大致呈 1:1 比例25,28。其次，每个样品浓度平均值需乘以 40，以校正从 5 µL 纯化载体（第 4.1 节）稀释至 200 µL 提取 DNA（第 4.6.12 节）的样品稀释过程。最后，每个样品浓度平均值需乘以 1000，以实现从 vg/µL 到 vg/mL 的单位转换。

6 载体质量与纯度的评估

  1. 质量控制 - 蛋白质印迹
    1. 制备12% SDS-PAGE凝胶。
    2. 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
      注意：每孔上样量为6 × 1010 vg。
    3. 将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
    4. PVDF膜封闭
      1. 从转膜装置中取出膜，用0.1% PBST冲洗以去除松散的丙烯酰胺。
      2. 将膜置于封闭液中，室温孵育至少1小时，或4 °C过夜。
        注意：封闭缓冲液可额外添加2%小牛血清。
    5. 与一抗孵育
      1. 倾去封闭液，加入一抗（抗AAV小鼠单克隆抗体），按1:200稀释后使用。
      2. 4 °C孵育过夜。
      3. 倾去一抗，用0.1% PBST在室温下振荡洗涤5次，每次5分钟。
    6. 与二抗孵育
      1. 倾去洗涤液，加入HRP标记的二抗，用封闭缓冲液按1:7500稀释，室温振荡孵育1小时。
      2. 倾去二抗，用0.1% PBST在室温下振荡洗涤5次，每次5分钟。
      3. 最后用PBS在室温下振荡洗涤一次。
    7. 使用增强型化学发光（ECL）底物检测蛋白质。
    8. 成像以观察病毒蛋白（VP1、VP2和VP3亚基）（图4）。

显示病毒载体 AAV6.2FF-hIgG01 至 AAV6.2FF-hIgG04 蛋白条带的 SDS-PAGE 凝胶。
图 4：Western 印迹显示 AAV 衣壳蛋白。 A 泳道：蛋白分子量标记物（MW ladder）；B 泳道：AAV6.2FF-hIgG01；C 泳道：AAV6.2FF-hIgG02；D 泳道：AAV6.2FF-hIgG03；E 泳道：AAV6.2FF-hIgG04。每种 AAV6.2FF-hIgG 样品上样量为 6 × 1010 vg。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 纯度控制——SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色
    1. 按照步骤 6.1.1 和 6.1.2 所述方法制备 SDS-PAGE 凝胶和样品。
    2. 将凝胶置于固定液中固定 1 小时或过夜，期间轻轻振荡。在第一个小时内更换一次固定液。
    3. 将凝胶置于染色液中染色 2–4 小时，期间轻轻振荡。
    4. 用脱色液对凝胶进行脱色。多次更换脱色液，直至凝胶背景完全脱净（4–24 小时）。
    5. 将脱色后的凝胶保存在保存液中。
    6. 对凝胶成像，以观察考马斯亮蓝染色液染色的所有蛋白质条带。

凝胶电泳图；蛋白条带 VP1-VP3；分离方法；分子量标记物。
图 5：考马斯亮蓝染色凝胶。 A 泳道：分子量标记物（MW ladder）；B 泳道：AAV6.2FF-hIgG01；C 泳道：AAV6.2FF-hIgG02；D 泳道：AAV6.2FF-hIgG03；E 泳道：AAV6.2FF-hIgG04；F 泳道：AAV6.2FF-hIgG05；G 泳道：AAV6.2FF-hIgG06。每种 AAV6.2FF-hIgG 样品上样量为 6 × 1010 vg。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 替代纯度检测方法——HEK293宿主细胞蛋白检测ELISA
    1. 按照制造商说明书进行HEK293宿主细胞蛋白的ELISA检测。
      注意：纯化的rAAV样品使用5 × 10-2和1 × 10-3的稀释度。加入TMB后，需避光孵育。不可使用线性回归分析结果。
    2. 采用点对点分析、立方样条插值或四参数逻辑拟合方法计算未知样品的浓度，并乘以稀释倍数以确定原始样品浓度。

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结果

从小型啮齿类动物模型向大型动物模型转化并最终应用于临床，由于需要大量腺相关病毒（AAV）才能转导更大的动物并实现治疗效果，因此面临重大挑战。为了比较理性设计的AAV6.2FF衣壳的转导效率（此前已证明其在小鼠肌肉细胞中的转导效率比AAV6高出101倍）3，本研究在小鼠、仓鼠和羔羊中均给予了表达人源单克隆抗体（hIgG）的AAV6.2FF。表达AAV6.2FF-hIgG的载体包含CASI启动子4、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）以及SV40 polyA序列。6周龄雌性BALB/c小鼠（n = 4）在40 µL体积中经肌肉注射（IM）给予1 x 1011 vg的AAV6.2FF-hIgG，并在注射AAV后的第0、7、14、21和28天采集血液以监测hIgG水平。4周龄叙利亚仓鼠（2只雌性，2只雄性）在40 µL体积中经肌肉注射给予1 x 1012 vg的AAV6.2FF-hIgG，并每周采血监测hIgG表达。最后，10日龄雄性多塞特羔羊（n = 3）按每公斤体重1 x 1013

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讨论

本文所述的重组腺相关病毒（rAAV）载体的制备方法，使用了大多数分子生物学研究实验室和实验设施中常见的材料、试剂和设备。本方法可使读者自行制备出高质量的体外（in vitro）和体内（in vivo）应用级别的rAAV。尤其与涉及氯化铯纯化的繁琐方法相比，该rAAV制备方案效率更高，且无需使用超速离心。在转染HEK293细胞后，仅需5个工作日即可获得纯化的AAV，可供直接使用。

在重组腺相关病毒（rAAV）的生产与纯化过程中，许多步骤都会影响载体的纯度和最终滴度。第一步也是最关键的一步是HEK293细胞的健康状态，这直接影响载体的滴度。相较于其他细胞类型或系统（如HEK293T细胞），使用HEK293细胞具有优势，因为HEK293细胞对培养板塑料涂层的黏附能力更强，能够形成稳定的细胞网络，有利于持续的细胞生长。建议定期检测细胞是否存在支原体污染，并避免将HEK293细胞传代超过约40代，或在细胞倍增时间明显延长时继续传代，否则会导致AAV产量降低。此外，转染前应确认细胞融合度约为80%，以确保细胞既不过于稀疏也不过度生长。关于转染组分，强烈推荐使...

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披露

Sarah K. Wootton 是一项美国专利 US10806802B2 中 AAV6.2FF 衣壳的发明人。

致谢

Amira D. Rghei、Brenna A. Y. Stevens、Sylvia P. Thomas 和 Jacob G. E. Yates 获得了安大略兽医学院学生津贴以及安大略省研究生奖学金。Amira D. Rghei 获得了 Mitacs Accelerate 学生奖学金。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（#66009）以及由自然 sciences 和工程研究委员会（NSERC）合作的协同健康研究项目资助（#433339）支持，资助对象为 SKW。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜Millipore SigmaS2GPU05RE
0.25% 胰蛋白酶Fisher ScientificSM2001C
1-丁醇赛默飞世尔科技A399-4注意：在层流罩下操作，佩戴手套
10层小室细胞培养堆康宁3271
1升PETG瓶赛默飞世尔科技2019-1000
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液Bio-Rad1610158
96孔带裙边板FroggaBioFS-96
粘性板封膜赛默飞世尔科技08-408-240
过硫酸铵（APS）伯乐（Bio-Rad）161-0700注意：在层流罩下操作，佩戴手套
血液与组织清洁试剂盒Qiagen69506用于方案第4.6节中的DNA纯化
溴酚蓝Fisher ScientificB392-5注意：在层流罩下操作，佩戴手套
细胞培养皿Greiner bio-one700023215 cm 培养皿
培养锥形管赛默飞世尔科技33965015 mL 一次性离心管
培养锥形管Fisher Scientific1495524050 mL 离心管
含1000 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Cytiva生命科学SH30022.01
ECL 蛋白质印迹底物赛默飞世尔科技32209
乙醇GreenfieldP016EA95将乙醇（95% vol）稀释至20%用于第3.7.4节，稀释至70%用于第6.1.1.1节
胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技SH30396.03
冰醋酸Fisher ScientificA38-500注意：在层流罩下操作，佩戴手套
甘油Fisher ScientificBP229-1
甘氨酸Fisher ScientificBP381-500
含镁的HBSS2+ 和 Ca2+赛默飞世尔科技SH302268.02
不含镁的HBSS2+ 和 Ca2+赛默飞世尔科技SH30588.02
HEK293细胞美国组织培养收藏中心CRL-1573收到细胞后，按制造商所述方法进行解冻和培养’s方案。当细胞经过最少传代且生长状态良好时，将其分装冻存于液氮中以备后续使用。始终使用传代次数低于30的细胞。一旦培养细胞的传代次数超过30次，建议从冻存的细胞分装管中重新开始培养。
HEK293 宿主细胞蛋白 ELISA 试剂盒Cygnus TechnologiesF650S遵循制造商说明’s 指令
肝素硫酸柱Cytiva生命科学17040703
Kimwipe赛默飞世尔科技KC34120
 L-谷氨酰胺（200 mM）赛默飞世尔科技SH30034.02
大容量离心管支撑垫康宁CLS431124使用大容量离心管时必须使用支撑垫，除非离心机转子已配备合适的V型底垫
大容量离心管康宁CLS431123-6EA500 mL 离心管
MgCl₂2 赛默飞世尔科技7791-18-6
微量离心管Fisher Scientific05-408-1291.5 mL 微量离心管，使用前灭菌
分子生物学级水Cytiva生命科学SH30538.03
N-月桂酰基肌氨酸钠盐Sigma AldrichL5125注意：佩戴手套
NaCl赛默飞世尔科技BP35810
OptiMEM，低血清培养基赛默飞世尔科技31985070
巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20D使用前灭菌
PBS（10倍浓缩液）赛默飞世尔科技70011044稀释至1倍浓度后用于细胞
青霉素-链霉素溶液Cytiva生命科学SV30010
pHelper 质粒从头设计或从质粒文库获取NA
移液盆赛默飞世尔科技13-681-502购买无菌移液管盆
聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）赛默飞世尔科技9002-93-1注意：佩戴手套
聚乙烯亚胺（PEI）Polyscience24765-1遵循制造商说明’s 说明，配制 1 L 溶液。0.22μm 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存°C
聚丙烯半裙边PCR板FroggaBioWS-96
聚山梨酯 20（Tween 20）赛默飞世尔科技BP337-100注意：佩戴手套
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜Cytiva生命科学10600023使用镊子操作。佩戴手套。
一抗祖细胞65158
蛋白阶梯FroggaBioPM008-0500
蛋白酶K赛默飞世尔科技AM2546
pTrangene 质粒从头设计或从质粒文库获取NA基因组中必须含有 SV40 polyA，才能与第 5.0 节中的 AAV 滴定相兼容
泵管Cole-ParmerRK-96440-14优化E1-E5各组分中病毒的管路长度及收集
RQ1 Dnase 10 反应缓冲液PromegaM6101在4.0节方案中以10倍浓度使用
RQ1 无RNase的DNasePromegaM6101
样品稀释液Cygnus TechnologiesI700需单独购买，用于HEK293宿主细胞蛋白ELISA试剂盒
二抗，HRP赛默飞世尔科技G-21040
脱脂奶粉OxoidLP0033B
十二烷基硫酸钠（SDS）赛默飞世尔科技28312注意：在层流罩下操作，佩戴手套
氢氧化钠（NaOH）赛默飞世尔科技SS266-4
SV40 polyA 引物探针IDT使用表 X 中的序列，向 IDT 下单进行合成
四甲基乙二胺（TEMED）赛默飞世尔科技15524010注意：在层流罩下操作，佩戴手套
Tris碱Fisher ScientificBP152-5
台盼蓝伯乐（Bio-Rad）1450021
超滤器默克生命科学UFC810024必须使用 Ultra-4 离心 10K 装置，因其具有 10000 分子量截断值
用于细胞裂解的通用核酸酶赛默飞世尔科技88702
通用型qPCR预混液NEBM3003L
沃特曼滤纸Millipore SigmaWHA1001325
β-巯基乙醇Fisher Scientific21985023注意：在层流罩下操作，佩戴手套
警告： 请参阅材料表，了解危险化学品使用的相关指南。

参考文献

  1. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  2. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  3. Nathwani, A. C., et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Ylä-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).
  6. FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss (2020).
  7. FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease (2020).
  8. Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics (2020).
  9. Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).
  10. Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).
  11. Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA. Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).
  12. Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).
  13. Ling, C. Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo. Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).
  14. Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLOS One. 8 (9), 76310(2013).
  17. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  18. Pillay, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor. Journal of Virology. 91 (18), (2017).
  19. Merkel, S. F. Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells. Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).
  20. van Lieshout, L. P., et al. A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).
  21. Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).
  22. Liu, J., Moon, Y. -A. Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression. Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).
  23. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  24. Kimura, T., et al. Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).
  25. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  26. dsDNA copy number calculator. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html (2021).
  27. qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html (2021).
  28. Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication (1996).
  29. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  30. Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity. Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).
  31. Burnham, B., et al. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).
  32. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).
  33. Backovic, A., et al. Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).

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AAV 载体生产细胞堆叠培养高滴度 AAV贴壁型 HEK293 细胞肝素 Sepharose 纯化病毒载体纯度外源基因表达临床前基因治疗骨骼肌转导
用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产
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