本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外 树突状细胞分化
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摘要
摘要
树突状细胞（DCs）是重要的抗原呈递细胞，能够连接先天性免疫与适应性免疫应答。DCs具有异质性，可分为传统树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。cDCs擅长将抗原呈递给初始T细胞并激活其反应；而pDCs在病毒感染期间可大量产生I型干扰素（IFN-I）。DCs的特化过程始于骨髓（BM）中DC前体细胞的早期阶段，并由一系列转录因子（TFs）构成的调控网络决定。例如，cDCs高表达ID2，而pDCs高表达E2-2。随着越来越多DC亚群被鉴定，研究者对调控DC发育的关键TFs日益关注。本文建立了一种用于筛选调控DC分化关键转录因子的方法 树突状细胞，抗原呈递细胞，先天性免疫，适应性免疫，传统树突状细胞，浆细胞样树突状细胞，I型干扰素，骨髓，前体细胞，转录因子，ID2，E2-2，细胞分化，筛选方法 体外 通过将携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒导入永生化造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）系。经过筛选和 体外 通过流式细胞术分析稳定敲低细胞系的分化能力及其向cDC和pDC分化的潜能。该方法为鉴定可能调控树突状细胞从祖细胞发育命运的基因提供了平台 体外.
引言
树突状细胞（DCs）是天然免疫和适应性免疫的关键调节因子1。DCs主要分为两种功能上不同的细胞群，即浆细胞样DCs（pDCs）和经典DCs（cDCs）。此外，cDCs又包含两个亚群，分别为I型和II型cDCs，或分别称为cDC1s和cDC2s2。pDCs在小鼠中表达BST2、Siglec-H以及中等水平的CD11c3,4，是能够在炎症和病毒感染期间分泌大量I型干扰素（IFN-I）的细胞5。由于其强大的IFN-I产生能力，pDCs还被认为在包括系统性红斑狼疮（SLE）在内的自身免疫性疾病进展中发挥关键作用6。cDC1s在小鼠中以表面表达XCR1、CD8a、CLEC9A和CD103为特征7，擅长通过抗原交叉提呈激活和极化细胞毒性CD8+ T细胞（CTLs），从而在应对胞内病原体和癌症时启动I型免疫应答8,9。另一方面，cDC2s在人和小鼠中均表达CD11b和CD172α（也称为Sirpα），能够激活CD4+ T细胞，促进针对....
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方案
慢病毒的操作按照中国台湾大学医学院环境健康与安全部门的规定进行。
1. 永生化造血干细胞和祖细胞系（iHSPCs）的制备
- 在含有 100 ng/mL FL 和 1 µM β-雌二醇的完全 RPMI 1640 培养基中培养 iHSPC 细胞系。
- 每 3 天以 1:10 的比例传代细胞。
注意：通过添加 10% 胎牛血清 (FBS)、5 x 10-5 M β-巯基乙醇和 10 µg/mL 庆大霉素配制完全 RPMI 1640 培养基。重组小鼠 FL 也可从商业途径获得。
2. 慢病毒转导
- 将iHSPCs以1 × 105 个细胞/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入含100 ng/mL FL、1 µM β-雌二醇和8 µg/mL polybrene的1 mL完全培养基。
注意：polybrene的浓度取决于细胞类型，通常在4–8 µg/mL范围内。 - 在每孔中加入携带shRNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。
注意：慢病毒载体为带有嘌呤霉素筛选标记的pLKO.1-Puro（图1）。针对LacZ、Tcf4和Id2的shRNA靶序列分别列于<....
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结果
pLKO.1-Puro 慢病毒载体图谱如下所示（图1）。在递送表达针对 shRNA 的慢病毒后 LacZ （非靶向对照）， Tcf4，以及 Id2 在iHSPCs中，通过RT-qPCR验证的敲低效率显示，基因表达水平 Tcf4 在 sh 中减少Tcf4 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs（诱导型造血干细胞样细胞）图2A）。另一方面，表达降低的 Id2 在sh中也观察到Id2 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs 对照组（图2B）。shLacZ,shTcf4，以及 shId2 iHSPCs 细胞系被分化为 pDCs 和 cDCs 体外 与FL共培养五天后LacZ iHSPCs中CD11.......
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讨论
基于慢病毒的shRNA载体常用于通过病毒转导实现细胞基因沉默，并可稳定整合到宿主基因组中。然而，不同细胞类型的转导效率存在差异，需予以考虑，目前已有多种方法用于克服这一问题。
Polybrene 是一种多聚阳离子聚合物，能够中和细胞膜上的电荷，从而在转导过程中增强病毒颗粒与细胞的结合20。尽管这是一种提高转导效率的有效方法，但在使用过量时，Polybrene 对某些细胞类型具有毒性。因此，需要检测 Polybrene 的细胞毒性，并在不同细胞中优化其使用浓度。硫酸鱼精蛋白是一种阳离子化合物，可能作为替代方法以提高细胞存活率21。此外，在感染当天更换完全培养基，可改善转导后的细胞存活率。
大多数shRNA递送系统都带有选择性标记，用于清除未成功感染的细胞。我们使用的慢病毒系统含有嘌呤霉素抗性基因，以便在转导后对感染细胞进行筛选。此外，表达GFP的慢病毒也是另一种可选的筛选方法。然而，这两种方法各有优缺点。使用嘌呤霉素作为筛选方法时，除.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢陈姿伶博士提供的技术支持。感谢台湾国家RNA干扰核心设施（中央研究院，中国台湾）提供shRNA慢病毒（http://rnai.genmed.sinica.edu.tw）。本研究由台湾科技部（MOST 108-2320-B-002-037-MY3 和 MOST 109-2320-B-002-054-MY3）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| APC/Cy7 抗小鼠 CD11c 抗体 | Biolegend | 117324 | (克隆号: N418) |
| FITC 抗小鼠/人 CD11b 抗体 | Biolegend | 101206 | (克隆号: M1/70) |
| PE 抗小鼠/人 B220 抗体 | Biolegend | 103208 | (克隆号: RA3-6B2) |
| 细胞培养 | |||
| 1.5 mL 微量离心管 | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12 孔组织培养处理板 | Falcon | 353043 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 培养基 | gibco | 11875-085 | |
| 试剂 | |||
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-巯基乙醇 (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS 缓冲液 | 自制 | 配方: 1×PBS + 0.5% FBS + 0.1% NaN3 | |
| Flt3 配体 (FL) | 自制 | ||
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| 嘌呤霉素 | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA（靶序列/克隆编号） | 公司 | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | RNAi 联合体 (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | RNAi 联合体 (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | RNAi 联合体 (TRC) |
参考文献
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al.
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