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通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

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DOI：

10.3791/62730

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2022年3月7日

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1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Pathology, Division of Microbiology and Immunology, University of Utah

本文内容

摘要

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外 树突状细胞分化

摘要

树突状细胞（DCs）是重要的抗原呈递细胞，能够连接先天性免疫与适应性免疫应答。DCs具有异质性，可分为传统树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。cDCs擅长将抗原呈递给初始T细胞并激活其反应；而pDCs在病毒感染期间可大量产生I型干扰素（IFN-I）。DCs的特化过程始于骨髓（BM）中DC前体细胞的早期阶段，并由一系列转录因子（TFs）构成的调控网络决定。例如，cDCs高表达ID2，而pDCs高表达E2-2。随着越来越多DC亚群被鉴定，研究者对调控DC发育的关键TFs日益关注。本文建立了一种用于筛选调控DC分化关键转录因子的方法 树突状细胞，抗原呈递细胞，先天性免疫，适应性免疫，传统树突状细胞，浆细胞样树突状细胞，I型干扰素，骨髓，前体细胞，转录因子，ID2，E2-2，细胞分化，筛选方法 体外 通过将携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒导入永生化造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）系。经过筛选和 体外 通过流式细胞术分析稳定敲低细胞系的分化能力及其向cDC和pDC分化的潜能。该方法为鉴定可能调控树突状细胞从祖细胞发育命运的基因提供了平台 体外.

引言

树突状细胞（DCs）是天然免疫和适应性免疫的关键调节因子1。DCs主要分为两种功能上不同的细胞群，即浆细胞样DCs（pDCs）和经典DCs（cDCs）。此外，cDCs又包含两个亚群，分别为I型和II型cDCs，或分别称为cDC1s和cDC2s2。pDCs在小鼠中表达BST2、Siglec-H以及中等水平的CD11c3,4，是能够在炎症和病毒感染期间分泌大量I型干扰素（IFN-I）的细胞5。由于其强大的IFN-I产生能力，pDCs还被认为在包括系统性红斑狼疮（SLE）在内的自身免疫性疾病进展中发挥关键作用6。cDC1s在小鼠中以表面表达XCR1、CD8a、CLEC9A和CD103为特征7，擅长通过抗原交叉提呈激活和极化细胞毒性CD8+ T细胞（CTLs），从而在应对胞内病原体和癌症时启动I型免疫应答8,9。另一方面，cDC2s在人和小鼠中均表达CD11b和CD172α（也称为Sirpα），能够激活CD4+ T细胞，促进针对过敏原和寄生虫的II型免疫应答10，并在识别胞外细菌和微生物群后调节III型免疫应答11,12。

树突状细胞（DCs）的分化由骨髓中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的一组转录因子（TFs）决定。E2-2（由Tcf4编码）是浆细胞样DCs（pDCs）分化与功能的关键调控因子13,14。相反，DNA结合抑制因子2（ID2）通过阻断E蛋白活性促进经典DCs（cDCs）的特化，并抑制pDC的发育15。此外，cDC1的发育依赖于IRF8和BATF3，而cDC2的分化则高度依赖于IRF416。近期研究已探索了pDCs17和cDCs的异质性及其转录调控机制18。由于DC网络的复杂性，目前迫切需要建立一个平台，以鉴定其他调控DC发育和功能的转录因子。

此处，我们使用了一种通过在骨髓细胞中表达可被雌激素调控的Hoxb8核转位而产生的诱导型造血干细胞/祖细胞（iHSPC）（也称为Hoxb8-FL细胞）。19iHSPCs 在 β-雌二醇和 Flt3 配体（FL）存在下可增殖并保持未分化状态，而在撤除 β-雌二醇后，仅在 FL 存在下即开始分化为不同类型的树突状细胞19基于这一特性，我们可以在前体阶段敲低目标基因，随后检测其对 体外 pDCs 和 cDCs 的分化。因此，该方法是发现调控 DCs 发育和功能基因的有力工具。

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方案

慢病毒的操作按照中国台湾大学医学院环境健康与安全部门的规定进行。

1. 永生化造血干细胞和祖细胞系（iHSPCs）的制备

  1. 在含有 100 ng/mL FL 和 1 µM β-雌二醇的完全 RPMI 1640 培养基中培养 iHSPC 细胞系。
  2. 每 3 天以 1:10 的比例传代细胞。
    ​注意：通过添加 10% 胎牛血清（FBS）、5 × 10-5 M β-巯基乙醇和 10 µg/mL 庆大霉素配制完全 RPMI 1640 培养基。重组小鼠 FL 也可从商业途径获得。

2. 慢病毒转导

  1. 将iHSPCs以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12孔板中，每孔加入含100 ng/mL FL、1 µM β-雌二醇和8 µg/mL polybrene的1 mL完全培养基。
    注：polybrene的浓度取决于细胞类型，通常在4–8 µg/mL范围内。
  2. 在每个孔中加入携带shRNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。
    注：慢病毒载体为带有嘌呤霉素筛选标记的pLKO.1-Puro（图1）。针对LacZ、Tcf4和Id2的shRNA靶序列分别列于材料表中。MOI定义为感染过程中每个细胞所添加的病毒颗粒数量。
    MOI公式：病毒滴度计算，示意图，病毒学，细胞培养，pfu/mL，研究方法
  3. 在37 °C下，以1,100 × g离心90分钟。
    注：感染离心使用摆桶转子进行。
  4. 将含有感染细胞的培养板置于培养箱中，在37 °C下孵育过夜。
    注：若细胞对polybrene敏感，则在离心感染后更换为不含polybrene的完全培养基。
  5. 感染24小时后，更换为含100 ng/mL FL和1 µM β-雌二醇的完全培养基。
  6. 再过24小时后，在培养基中加入6 µg/mL嘌呤霉素，以筛选被感染的细胞。
    注：慢病毒载体通常需要48小时才能表达基因，包括嘌呤霉素抗性基因。请确保针对每种细胞系优化嘌呤霉素的浓度。
  7. 每3天更换一次含100 ng/mL FL、1 µM β-雌二醇和6 µg/mL嘌呤霉素的筛选培养基，并持续培养至少一周，以扩增稳定转导的iHSPC细胞。
    ​注：嘌呤霉素筛选通常在48小时后开始起效，筛选持续时间取决于细胞类型。

3. 通过逆转录和实时 PCR（RT-PCR）检测基因敲低效率

  1. 从1 × 10⁶个细胞中提取总RNA7 shLacZ，shTcf4，以及 shId2 使用商用RNA提取试剂从稳定敲低iHSPC细胞中提取RNA，并用异丙醇沉淀水相中的RNA，随后用75%乙醇洗涤RNA沉淀。
  2. 将RNA（约5 µg）溶于5 µL经DEPC处理的H₂O中2O，并将浓度调整至1 µg/µL。
  3. 取1-3 µg RNA，与经DEPC处理的H2将反应体系补至终体积17.4 µL，加入1 µL浓度为1单位/µL的无RNase的DNase I，37 °C孵育20分钟。
    注意：此步骤旨在消化RNA样本中的基因组DNA。
  4. 向RNA样品中加入1 µL 20 mM EDTA，在65 °C孵育10分钟以灭活DNase I，立即将RNA样品置于4 °C。
  5. 加入11.6 µL反应混合液，其中包含1 µL寡核苷酸(dT)引物（45 µM）、6 µL 5x 1st 将3 µL dNTP（2 mM）、0.6 µL RNase抑制剂（50 Unit/µL）和1 µL逆转录酶（200 Unit/µL）加入RNA样品中，于40 °C孵育1小时。
  6. 通过在 70 °C 加热 10 分钟终止反应，并将反应混合物用 30 µL H2O.
  7. 取2 µL稀释后的反转录反应混合物作为DNA模板，使用针对Tcf4或Id2的引物进行PCR扩增（参见 表1 用于热循环仪的反应条件。
    注意：引物序列包含在以下内容中 材料表.

4. 体外 稳定敲低iHSPC细胞系的分化

  1. 在含有 100 ng/mL FL 和 1 µM β-雌二醇的完全培养基中维持 iHSPCs 中 LacZ (shLacZ)、Tcf4 (shTcf4) 或 Id2 (shId2) 的稳定单基因敲低。
  2. 将 shLacZ、shTcf4 和 shId2 未分化的 iHSPCs 收集至 15 mL 离心管中，在 500 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
  3. 弃去上清液，加入 10 mL PBS 洗涤细胞，重复此步骤两次。
  4. 将 iHSPC 细胞重悬，并以 2 x 105 个细胞/mL 的密度接种于 12 孔板中，每孔加入 1 mL 仅含 100 ng/mL FL 的完全培养基。
  5. 三天后，每孔加入 1 mL 新鲜的完全培养基，其中含 100 ng/mL FL。
  6. 再过两天后，通过流式细胞术分析分化后的细胞（shLacZ、shTcf4 和 shId2 iHSPCs）。

5. 分化树突状细胞的流式细胞术分析

  1. 用移液器在培养板中将细胞上下吹打2-3次，收集至1.5 mL离心管中，在室温（RT）下以500 × g 离心5分钟。
    注意：体外 分化的树突状细胞（DC）会轻微贴附于培养板上。轻柔吹打有助于从培养板上回收DC细胞。
  2. 弃去上清液，将细胞重悬于50 µL FACS缓冲液中。随后加入50 µL抗CD16/32杂交瘤上清液，置于冰上孵育5-10分钟。
    注意：Fc阻断抗体可防止抗体非特异性结合表达于某些髓系细胞和B细胞上的Fc受体，该抗体可通过多家供应商商业购得。
  3. 直接向细胞中加入荧光染料偶联抗体（每种抗体0.04 µg），避光冰上孵育15分钟。所用抗体包括APC/cy7标记的抗小鼠CD11c、FITC标记的抗小鼠CD11b以及PE标记的抗小鼠B220。
    注意：浆细胞样树突状细胞（pDCs）定义为CD11c+CD11b-B220+，而经典树突状细胞（cDCs）定义为CD11c+CD11b+B220-。
  4. 用1 mL FACS缓冲液洗涤细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟。
  5. 将细胞重悬于100 µL FACS缓冲液中，通过流式细胞术进行分析。

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结果

pLKO.1-Puro 慢病毒载体图谱如下所示（图1）。在递送表达针对 shRNA 的慢病毒后 LacZ （非靶向对照）， Tcf4，以及 Id2 在iHSPCs中，通过RT-qPCR验证的敲低效率显示，基因表达水平 Tcf4 在sh中减少Tcf4 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs（诱导性造血干细胞样细胞）图2A）。另一方面，表达降低的 Id2 在sh中也观察到Id2 iHSPCs 与 sh 相比LacZ iHSPCs 对照组（图2B）。shLacZ,shTcf4，以及 shId2 iHSPCs 细胞系被分化为 pDCs 和 cDCs 体外 与FL共同培养5天后LacZ iHSPCs中CD11c...

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讨论

基于慢病毒的shRNA载体常用于通过病毒转导实现细胞基因沉默，并可稳定整合到宿主基因组中。然而，不同细胞类型的转导效率存在差异，需予以考虑，目前已有多种方法用于克服这一问题。

Polybrene 是一种多聚阳离子聚合物，能够中和细胞膜上的电荷，从而在转导过程中增强病毒颗粒与细胞的结合20。尽管这是一种提高转导效率的有效方法，但在使用过量时，Polybrene 对某些细胞类型具有毒性。因此，需要检测 Polybrene 的细胞毒性，并在不同细胞中优化其使用浓度。硫酸鱼精蛋白是一种阳离子化合物，可能作为替代方法以提高细胞存活率21。此外，在感染当天更换完全培养基，可改善转导后的细胞存活率。

大多数shRNA递送系统都带有选择性标记，用于清除未成功感染的细胞。我们使用的慢病毒系统含有嘌呤霉素抗性基因，以便在转导后对感染细胞进行筛选。此外，表达GFP的慢病毒也是另一种可选的筛选方法。然而，这两种方法各有优缺点。使用嘌呤霉素作为筛选方法时，除...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢陈姿伶博士提供的技术支持。感谢台湾国家RNA干扰核心设施（中央研究院，中国台湾）提供shRNA慢病毒（http://rnai.genmed.sinica.edu.tw）。本研究由台湾科技部（MOST 108-2320-B-002-037-MY3 和 MOST 109-2320-B-002-054-MY3）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
APC/Cy7 抗小鼠 CD11c 抗体Biolegend117324(克隆号: N418)
FITC 抗小鼠/人 CD11b 抗体Biolegend101206(克隆号: M1/70)
PE 抗小鼠/人 B220 抗体Biolegend103208(克隆号: RA3-6B2)
细胞培养
1.5 mL 微量离心管 ExtraGeneTUBE-170-C
12 孔组织培养处理板Falcon353043
胎牛血清 (FBS)Corning35-010-CV
RPMI 1640 培养基gibco11875-085
试剂
β-雌二醇Sigma-AldrichE2758-250MG
β-巯基乙醇 (β-ME)Sigma-AldrichM6250
FACS 缓冲液自制配方: 1×PBS + 0.5% FBS + 0.1% NaN3
Flt3 配体 (FL)自制
聚凝胺Sigma-AldrichTR-1003-G
嘌呤霉素Invivogenant-pr-1
TRIsureBIOLINEBIO-38032
shRNA（靶序列/克隆编号）公司
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)RNAi 联合体 (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)RNAi 联合体 (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)RNAi 联合体 (TRC)

参考文献

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