本方案旨在介绍一种利用微电极阵列记录完整窦房结组织以测量内在心脏起搏频率的新方法，用于识别小鼠的起搏功能缺陷。该方法还可引入药理学试剂，以研究其对内在起搏活动的影响。
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本文内容
摘要
摘要
位于右心房的窦房结（SAN）含有心脏起搏细胞，该区域功能障碍可导致心动过速或心动过缓。可靠地识别心脏起搏功能缺陷需要通过最大限度地排除自主神经系统的影响来测量心脏的固有心率，因为自主神经系统可能掩盖心率异常。传统分析心脏固有起搏功能的方法包括使用药物诱导的自主神经阻断以测量体内心率、离体心脏记录以测量固有心率，以及窦房结条带或单个窦房结起搏细胞的膜片钳记录以测量自发动作电位发放频率。然而，这些传统技术在操作上具有较高的难度且实施困难。本文介绍一种新方法，即通过对小鼠完整窦房结组织进行微电极阵列（MEA）记录来测量心脏固有放电频率。MEA由多个微电极以网格状排列组成，用于记录体外细胞外场电位。本文所述方法相较于以往方法具有更快速、更简便且更精确的优点，同时便于进行药理学干预研究。
引言
心脏是一个复杂的器官，其功能受心脏内在因素和外在因素（如源自大脑的影响）共同调控。窦房结（SAN）是心脏中一个特定区域，包含起搏细胞（也称为窦房细胞或SA细胞），负责启动和维持哺乳动物的心跳1,2。固有心率是指仅由起搏细胞驱动、不受其他心脏因素或神经-体液影响的心率；然而，临床上对人类和活体动物心率的传统测量方法（如心电图）所反映的是起搏细胞活动与神经影响共同作用的结果。其中，对SA细胞最显著的神经影响来自自主神经系统，该系统持续调节其放电模式以满足机体的生理需求3。支持这一观点的是，在窦房结附近可发现交感神经和副交感神经的投射纤维4。内在心脏神经系统（ICNS）是另一个重要的神经调控系统，其位于右心房的神经节丛可支配并调节窦房结的活动5,6。
理解起搏功能障碍在临床上具有重要意义，因为此类功能障碍可能构成多种心脏疾病的基础，并增加其他并发症的风险。病态窦房结综合征（SSS）是一类以窦房结功能障碍为特征的疾病，可阻碍正常的起搏功能7,8
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方案
此处所述的所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）的指南进行，并经南卫理公会大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 用于记录的多电极阵列（MEA）包被
- 配制 25 mM 硼酸盐缓冲液。
- 将 0.953 g 的 Na2B4O7·10 H2O 溶解于 80 mL 蒸馏水中。
- 用 HCl 调节 pH 至 8.4，然后用蒸馏水定容至 100 mL。
- 配制 0.1% 的聚乙烯亚胺（PEI）储备液。
- 将 100 µL 的 50%（w/v）PEI 加入 4.9 mL 蒸馏水中，配制成 1% 的 PEI 溶液。
- 取 1 mL 的 1% PEI 溶液加入 9 mL 的 25 mM 硼酸盐缓冲液中，稀释成 0.1% 的 PEI 溶液。
- 用移液器将约 1 mL 的 0.1% PEI 溶液加入微电极阵列（MEA）培养皿中，确保电极完全被覆盖（图 1A 和 1B）。
注：MEA 的微电极通常由铂黑或碳纳米管制成，并以聚酰亚胺（或丙烯酸）绝缘；这两种材料均具有疏水性。通过在 MEA....
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结果
在组织于培养皿中适应15分钟后，记录10段持续一分钟的信号。我们目前的实验方案记录时长超过1小时，但在未展示的未发表数据中，我们已观察到持续≥4小时的稳定放电模式。如果实验制备状态良好，适合数据采集，则每个记录通道应表现出一致且等间距重复出现的、形态均匀的波形（即尖峰）（图11D）。这些波形对应于单个心跳事件，反映心脏固有的起搏活动。尽管各通道的波形形态应保持一致，但由于电极在组织中的位置相对于去极化起始点存在微小差异，不同通道之间的波形可能不会完全对齐，但各通道的尖峰间期应保持相同（图8）。然而，由于电极在组织中的位置不同，各通道之间的波形形态会有所差异（图8）。组织与电极之间的接触程度也可能影响波形特征，例如幅值。但如果制备状态良好，大多数通道的幅值峰值应至少达到0.5 mV。从记录的10段信号中，选择连续三个最符合上述质量标准的通道进行后续分析。图10A展示了三个连续通道的稳定搏动频率（上图）和.......
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讨论
练习并熟练掌握窦房结（SAN）的分离过程至关重要，因为该组织较为脆弱，且需要保持组织健康才能成功记录。在窦房结分离过程中，正确的方位判断对于获取合适的组织区域极为关键。然而，在解剖过程中心脏原有的方位很容易丢失，这给操作带来困难。因此，为确保正确的左右方位，应通过肉眼观察心房结构进行判断。通常情况下，右心房较为透明，而左心房颜色较深，呈较暗的红色25,48。此外，在操作或将其固定于电极阵列上时，切勿拉伸窦房结组织，因为该组织极易受到机械损伤51。一个判断窦房结组织是否健康且分离得当的小技巧是：将组织置于完全Tyrode溶液中，在显微镜下观察其是否具有搏动。一旦技术掌握熟练，至少90%的组织制备样本应可用于记录。
有几点注意事项可提高成功记录及后续数据分析的可能性。为确保最佳记录效果，应在正式实验记录前仔细配制并测试溶液，并先在练习用小鼠样本上进行验证。我们经过大量工作对记录溶液进行了调整和优化，以维持窦房结（SAN）组.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01NS100954 和 R01NS099188。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-氨基吡啶 | Sigma | A78403-25G | |
| 22 号注射器针头 | Fisher Scientific | 14-826-5A | 用于解剖 |
| 23 号注射器针头 | Fisher Scientific | 14-826-6C | 用于解剖 |
| 60 mm 培养皿 | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500 mL Pyrex 瓶 | Fisher Scientific | 06-414-1C | 用于储存溶液 |
| 1000 mL Pyrex 瓶 | Fisher Scientific | 06-414-1D | 用于储存溶液 |
| 骨钳 | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| 氯化钙二水合物 (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| 碳酰气 (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo 剪刀，4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| 数据采集计算机 | CPU：Intel Xeon 或 Intel Core i7，内存：8 GB，硬盘：1 TB，显卡：NVIDIA 或板载，屏幕：1920×1080 | ||
| 解剖显微镜 | Jenco | ||
| 解剖针 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 椎板切除钳 | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 镊子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 超细 Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| 玻璃腔室 | Grainger | 49WF30 | 用于小鼠安乐死 |
| Harp 固定锚具套件 | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | 用于 pH 平衡 |
| 止血钳 | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| 肝素 | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| 倒置显微镜 | Motic | AE2000 | |
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| 实验室封口膜 | Fisher Scientific | 15-950 | |
| 解剖显微镜光源 | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| 氯化镁 (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 头部放大器 | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 主放大器 | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 灌流帽 | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 灌流管支架套件 | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 温控连接器 | MED64 | MED-CP04 | |
| 网状支架 | Warner Instruments | 640246 | |
| 微电极阵列 (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius 软件 | WitWerx Inc. | MED64 专用软件 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | 用于 pH 平衡 |
| 生理盐水 | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| 毛笔 | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm 封口膜 | Genesee Scientific | PM-996 | |
| 蠕动泵 | Gilson | F155009 | |
| 蠕动泵管 | Fisher Scientific | 14-171-298 | 内径 1/8 英寸 |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma | P3143 | |
| 氯化钾 (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S6297 | |
| 氯化钠 (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgard 弹性体套件 | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | S6566 | |
| 四硼酸钠 | Sigma | S9640 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| 移液管 (3 mL 带刻度) | Samco Scientific | 225 |
参考文献
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....
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