此处方案介绍了柚皮素溶液的配制方法 体内 腹腔注射。柚皮素完全溶解于二甲基亚砜、吐温80和生理盐水的混合液中。通过血糖检测、抗酒石酸酸性磷酸酶染色和酶联免疫吸附测定评估柚皮素的抗糖尿病性骨质疏松作用。
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本文内容
摘要
摘要
化合物（植物化学物）溶液的配制是在药物筛选等研究应用前常被忽视但至关重要的步骤。化合物的完全溶解对其安全使用和获得相对稳定的结果十分关键。本文以柚皮素溶液的配制及其在高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病模型中的腹腔注射为例，展示了一种标准操作流程。使用少量柚皮素（3.52–6.69 mg）测试其在乙醇、二甲基亚砜（DMSO）以及DMSO联合吐温80溶于生理盐水（PS）中的溶解情况。通过观察溶液颜色及离心（2000 × g）后是否有沉淀生成来判断化合物是否完全溶解。 g 30秒），或在室温（RT）下静置2小时。获得稳定的化合物/植物化学物质溶液后，根据实验需求确定该化合物的最终浓度/用量 体内 可先用溶剂（不含PS）配制储备液，再根据需要稀释或与PS混合。通过检测小鼠血糖水平、骨量（显微CT）及骨吸收速率（TRAP染色与ELISA），评估柚皮素的抗糖尿病性骨质疏松作用（腹腔注射剂量为20 mg/kg体重，2 mg/mL）。该技术适用于需要详细有机物/植物化学溶液配制方案的研究人员。
引言
随着越来越多的研究关注植物化学成分在药物筛选中的应用，配制植物化学成分溶液以评估其最佳效应的方法值得重视。诸多方面，如溶解方法、剂量和浓度 在制备该化合物时需予以考虑1.
基于溶剂的溶解方法广泛用于有机化合物的制备1。常用的溶剂包括水、油、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙醇、甲酸、吐温、甘油等2。尽管在通过灌胃给药时允许存在未溶解物质的混悬液，但静脉给药时必须确保溶质完全溶解。由于油溶液、混悬液和乳剂可能引起毛细血管栓塞，建议采用水溶液来制备化合物，尤其是在进行静脉、肌肉和腹腔注射时3。
有效剂量范围因化合物而异，甚至使用同一种化合物治疗不同疾病时其有效剂量范围也有所不同。有效剂量、安全剂量及其浓度的确定依赖于文献资料和预实验结果4。本文以柚皮素化合物的制备为例进行说明。
柚皮素（4,5,7-三羟基黄烷酮）是一种多酚类化合物，因其具有保肝5、抗糖尿病6、抗炎7和抗氧化活性
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方案
所描述的研究符合美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的要求，并经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准。进行实验时，出于安全考虑，必须穿戴实验服、一次性丁腈手套和护目镜。
1. 溶剂的制备及柚皮素用量的估算 体内 应用
- 配制以下溶剂：Tween-80（终浓度范围：0.5%–1%）、DMSO、甘油（终浓度范围：15%–20%）、乙醇（肌肉注射时终浓度为12%）22，以及0.9% PS。
- 根据剂量、小鼠数量和注射频率估算所需柚皮素的量。
- 订购10只小鼠（C57BL/6，雄性，5周龄，SPF级），每周给予柚皮素5天，持续8周。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。
注意：腹腔注射所需剂量为 20 mg/kg b.w.23. - 根据以下计算称取160 mg柚皮素：20 mg/kg × 0.02 kg/只 × 10只 × 5天/周 × 8周 = 160 mg。
- 订购10只小鼠（C57BL/6，雄性，5周龄，SPF级），每周给予柚皮素5天，持续8周。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。
- 计算待注射柚皮素的浓度 体内.
- 根据小鼠体重准备推荐体积。每只小鼠给予的柚皮素推荐剂量为体重的1%（0.3 mL）。本实验中，每只小鼠使用0.2 mL。
- 计算总体积：0.2 mL/只 × 1....
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结果
高脂饮食喂养并经STZ诱导的糖尿病小鼠在STZ处理后0至8周内，其体重较对照组有所下降。在第4周时，柚皮素治疗组小鼠的体重减轻程度显著低于未治疗小鼠（STZ组）。对照组和STZ组均给予相同体积的PS（表1）。糖尿病小鼠在STZ诱导后1个月内血糖水平显著升高，随后自发性下降至建模后2个月时的水平。柚皮素治疗在1个月和2个月时分别使血糖水平降低51.8%和34.8%（表2）。STZ诱导的糖尿病小鼠出现骨量减少，表现为骨体积/组织体积（BV/TV）下降30.97%和骨小梁数量（Tb.N）减少11.4%。这两个参数的变化表明，柚皮素治疗显著缓解了骨丢失（表3）。在高脂饮食联合STZ诱导的糖尿病小鼠中，破骨细胞活性（以N.oc/Tb.Ar，即每单位骨小梁面积的破骨细胞数量表示）有所升高，尽管对照组与疾病模型组之间未达到统计学显著性。柚皮素治疗显著降低了破骨细胞活性，如图4和表4所示。糖尿病动物中I型胶原C端端肽（CTIX）和I型前胶原N端前肽（PINP）.......
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讨论
植物化学物质溶液的制备是其应用的基础 体内在此方案中，通过使用不同溶剂（如乙醇、DMSO、Tween 80 和 0.9% PS）演示了柚皮素溶液的制备。溶液需在室温下静置数小时，以观察其是否完全溶解，并在使用前进行过滤。 体内.
溶剂的选择是本实验方案中的关键步骤。溶解化合物时有多种溶剂可供选择，其中乙醇、DMSO 和 PS 是最常用的溶剂。乙醇因其高度极性的特性，能够形成氢键，从而溶解极性和非极性物质，因此可溶解许多水不溶性化合物。此外，乙醇的浓度可能影响植物化学 化合物的性质。例如，75 wt.% 的乙醇/水溶剂被认为是最适合提取多酚、获得最高产率并具有最强抗氧化性能的溶剂26。另一项研究发现，在 150 °C 条件下，乙醇浓度可降低至 32.5%，仍能使多酚提取物表现出抗氧化活性27。然而，高浓度的乙醇可能引起神经毒性和肝毒性28。在行为学评估中，常使用浓度范围为 8%–32% v/v 的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81973607 和 81573992）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微管 | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | 盛装液体 |
| 自动脱水机 | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | 样本脱水 |
| 血糖试纸 | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| 离心机 | MIULAB | 小型离心机 | 离心溶液 |
| 脱水机 | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | 脱水 |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | 共溶剂 |
| ELISA 检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | 小鼠 COL1（I 型胶原）ELISA 试剂盒：E-EL-M0325c 小鼠 CTX I ELISA 试剂盒：E-EL-M0366c 小鼠 PICP ELISA 试剂盒：E-EL-M0231c 小鼠 PINP ELISA 试剂盒：E-EL-M0233c | |
| 无水乙醇 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | 共溶剂 |
| 乙二醇单乙醚 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP 染色 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | 脱钙 |
| 滤器 | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | 过滤溶液 |
| 冰醋酸 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP 染色 |
| 血糖仪 | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | 序列号：COJJG8GW |
| 研磨仪 | 上海净信实验技术 | Tissuelyser-24 | |
| 苏木精 | 南京建成生物工程研究所 | D005 | TRAP 染色 |
| 胰岛素注射器 | 上海康他瑞医疗设备有限公司 | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | 腹腔注射 |
| L-(+) 酒石酸 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP 染色 |
| 显微镜 | OLYMPUS | sz61 | 观察 |
| 切片机 | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | 切片 |
| 小型离心机 | 杭州米优仪器有限公司 | Mini-6KC | 离心 |
| 萘酚 AS-BI 磷酸盐 | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP 染色 |
| 柚皮素 | 江苏永健医药有限公司 | 102764 | 溶质 |
| 石蜡包埋机 | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | 包埋 样本 |
| 副品红碱 | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP 染色 |
| 移液器 | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | 转移液体 |
| 酶标仪 | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 成像读板仪 | ELISA |
| 树脂 | 上海泱阳仪器有限公司 | 中性树胶 | TRAP 染色 |
| 生理盐水（0.9 PS） | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | 溶剂 |
| 无水乙酸钠 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP 染色 |
| 亚硝酸钠 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP 染色 |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | 乳化剂 |
| 氧化锆珠 | 上海净信实验技术 | 11079125z 454g | 研磨 |
参考文献
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific iso....
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