一种在癌症切除手术期间用于全静脉麻醉的In Vivo小鼠模型

摘要

本文介绍了一种在小鼠肿瘤切除手术期间模拟全静脉麻醉（TIVA）的方法。该方法旨在复制向癌症患者实施麻醉过程中的关键特征，可用于研究麻醉技术对肿瘤切除术后癌症复发的影响。

摘要

麻醉是癌症治疗中的常规组成部分，用于诊断和治疗性操作。近期研究表明，麻醉技术可能通过调节影响癌细胞行为和免疫细胞功能的肾上腺素能-炎症反应，进而影响癌症患者的长期预后。新兴证据提示，与吸入性挥发性麻醉相比，基于丙泊酚的全静脉麻醉（TIVA）可能更有利于改善癌症患者的长期预后。然而，现有的临床研究结果尚不一致。为了指导临床研究的设计以加快相关认知的进展，迫切需要开展阐明其潜在机制的临床前研究。目前大多数麻醉的临床前模型均源自麻醉在体内研究中的应用，并未针对麻醉本身作为主要终点指标进行优化设计。本文介绍了一种在乳腺癌切除小鼠模型中实施丙泊酚-TIVA麻醉的方法，该模型可模拟癌症患者临床麻醉的关键特征。该模型可用于研究麻醉对不同类型癌症预后影响的作用机制，并可推广至其他非癌症领域的临床前麻醉研究。

引言

超过60%的癌症患者在接受手术切除治疗时需要接受麻醉¹。目前尚无针对癌症患者麻醉方式选择的特定临床指南。对麻醉医师的调查显示，在癌症手术期间，他们倾向于使用基于挥发性麻醉药的麻醉方式^2,3。然而，越来越多的证据表明，在癌症手术期间使用基于丙泊酚的全静脉麻醉（TIVA）与采用挥发性麻醉相比，可能与更好的术后预后（无进展生存期、总生存期）相关⁴。后续的临床研究仍不断报道相互矛盾的结果^5,6,7,8。这些发现提示有必要开展临床前研究，以更深入地理解不同麻醉药物对癌症相关结局的机制性影响。

然而，在模拟癌症手术的体内研究中，麻醉通常是手术过程中的附带环节。实验设计往往不以麻醉方式的选择依据 为重点，且可能未评估其对癌症相关终点指标的影响。例如，需要在癌症手术期间维持麻醉状态的体内研究，最常采用吸入性挥发性麻醉⁹。在已使用丙泊酚的体内研究中，通常通过腹腔注射单次推注给药，该方法并不能模拟临床肿瘤麻醉方案¹⁰。这种丙泊酚给药方式仅能诱导浅麻醉，适用于短时操作。然而，它无法维持癌症切除手术所需的长时间麻醉状态，而此类手术可能持续较久。此外，腹腔给药的吸收动力学特征与临床常规给药方式明显不同。

为满足这一需求，建立了一种基于丙泊酚的靶控输注麻醉（TIVA）模型，用于癌症切除手术。制定了一项麻醉维持方案，通过滴定麻醉药物剂量以应对手术刺激，从而模拟癌症手术患者麻醉给药的关键特征。该方案应用于小鼠癌症模型，在癌症切除手术期间实施靶控输注麻醉，并评估其对短期和长期癌症相关结局的影响。

方案

所有动物实验均在莫纳什大学机构动物护理和使用委员会的批准下进行。本研究使用6至8周龄的雌性Balb/c小鼠。

1. 准备癌细胞

1. 在培养基中培养肿瘤细胞。将66cl4小鼠乳腺癌细胞培养在含有10%胎牛血清（FBS）和200 mM谷氨酰胺的α-MEM培养基中。细胞应检测为支原体阴性。可选： 使用稳定转导表达萤光素酶的细胞进行生物发光成像，以实现肿瘤切除术后癌症复发的监测¹¹ （参见步骤4）。
   注意：本研究中使用了上述细胞系和培养基。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂在生物安全柜中无菌传代细胞 在 <80% 汇合度。为获得最佳效果，应使用处于对数生长期的低传代次数细胞 体内 结果。
3. 用含10 mM EDTA的PBS配制的0.5 mg/mL胰蛋白酶消化贴壁细胞，T75培养瓶使用2 mL。待细胞脱落后，加入培养基以终止胰蛋白酶活性，并用PBS洗涤细胞。
4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。用PBS稀释细胞以用于注射。对于66cl4乳腺癌细胞，注射1 x 10⁵ 每只小鼠20 μL PBS中的细胞。
5. 将细胞置于冰上，然后再进行注射。

2. 构建小鼠乳腺癌模型

1. 使用诱导室中4%异氟烷对小鼠进行麻醉，随后通过鼻罩维持2%-3%异氟烷麻醉。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。
2. 使用一次性酒精棉片擦拭小鼠左侧第四乳腺脂肪垫区域，以准备注射部位。
3. 将肿瘤细胞（见步骤1.4）吸入一支连接无菌27 G皮下注射针头的25 μL Hamilton注射器中。
4. 将细胞注射至左侧第四乳腺脂肪垫内。用镊子固定并提起皮肤，于乳头约1 mm处注射。
5. 可选：若细胞标记有荧光素酶，可通过生物发光成像确认肿瘤细胞注射成功。使用0.5 mL胰岛素注射器连接30 G皮下注射针头，向麻醉小鼠的尾侧静脉注射100 μL浓度为150 mg/kg的D-荧光素。
6. 可选：将小鼠放入生物发光成像系统中，乳腺脂肪垫朝上。自注射荧光素后等待2分钟，以获得最佳组织摄取效果，随后成像10秒。
7. 将小鼠置于清洁笼具中，使其从麻醉中恢复。
8. 根据机构动物伦理指南持续监测动物福利状况。

3. 通过静脉输注丙泊酚诱导稳定麻醉

1. 使用卡尺测量原位肿瘤的生长情况，并通过以下公式计算肿瘤体积：体积（mm³）=（长度 ×（宽度）²）÷ 2。
2. 当原位肿瘤达到所需体积（此处为80–90 mm³）时，对小鼠进行肿瘤切除手术。
3. 使用装有丙泊酚制剂（2% Lipuro 丙泊酚）的30 G 1 mL胰岛素注射器设置自动注射泵（图1A）。
4. 在诱导室中使用3%七氟烷或异氟烷诱导小鼠麻醉。
   注意：此处使用七氟烷，因其是临床上最常用的挥发性麻醉剂。
5. 将小鼠转移至37 °C加热垫上，并在整个手术过程中通过鼻罩以2%–3%七氟烷维持麻醉状态。
6. 在眼睛上涂抹水性润滑剂，防止角膜干燥。 
7. 皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡以提供镇痛作用。
8. 术前准备时，剃除腹部毛发，并用碘伏溶液对皮肤进行消毒，再用酒精棉片或无菌擦拭巾擦拭皮肤。
9. 为实施基于丙泊酚的靶控输注麻醉（TIVA），使用连接无菌聚氨酯导管的无菌30 G皮下针穿刺小鼠侧尾静脉。通过导管内回血确认置管位置正确（图1B）。在静脉穿刺期间，根据需要调整七氟烷的输送，以维持稳定的麻醉深度，表现为角膜反射和足底反射消失，且呼吸频率 < 100 次/分钟。
10. 以27 mg/kg剂量的2%丙泊酚静脉推注（持续超过1分钟）开始丙泊酚-TIVA，并停止七氟烷给药。
11. 以2.2–4.0 mg/kg/min的维持速率持续输注丙泊酚，以在整个手术期间保持稳定的麻醉深度（图1C）。

4. 切除原发肿瘤

1. 做一条直线 在左侧第四乳腺脂肪垫区域的肿瘤下方做一长约1 cm的切口。使用钝头镊子仔细分离并切除肿瘤及左侧腹股沟淋巴结。
2. 可选：若使用荧光素酶标记的肿瘤细胞，可通过生物发光成像确认手术切缘是否清晰。经尾静脉注射 150 mg/kg D-荧光素，等待 2 分钟后，使用生物发光成像系统成像 60 秒。若检测到残留肿瘤，需从乳腺脂肪垫进一步切除组织并重新成像，直至切缘清晰。
3. 确保手术部位止血彻底，并使用5-0尼龙缝线缝合皮肤。注意避免毛发进入手术区域。
4. 切除手术结束后，停止麻醉。将小鼠置于干净的笼子中，放在37 °C加热垫上，使其从麻醉中恢复。
5. 麻醉后每15分钟监测一次，直至小鼠恢复正常的警觉状态。之后，术后每12小时监测一次，持续48小时。
6. 术后每12小时皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，持续48小时。
7. 7至10天后，在短暂的七氟烷或异氟烷麻醉下，使用无菌弯头拆线剪拆除缝线。

5. 通过以下方法追踪癌症复发 体内 成像

1. 使用生物发光成像技术无创地追踪切除手术后的癌症复发情况。手术后从下一周开始，每周使用生物发光成像系统对小鼠进行一次监测，以检测原发肿瘤复发或远处复发的迹象。
2. 在诱导室中使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉诱导，随后将小鼠转移至 37 °C 加热垫上，并通过鼻罩以 2%–4% 异氟烷维持麻醉状态直至操作结束。
3. 在小鼠眼部涂抹水性润滑剂，以防止角膜干燥。
4. 经尾静脉注射 D-荧光素钠 150 mg/kg，等待 2 分钟后，进行 60 秒曝光时间的生物发光信号检测，以判断原发肿瘤复发或远处转移情况。
5. 若原发肿瘤复发并可触及，则开始使用游标卡尺测量肿瘤体积，监测其生长情况。
6. 实验结束时，根据批准的实验方案对小鼠实施人道处死。本研究中采用 CO₂ 窒息法，随后进行颈椎脱位确认死亡。

结果

本方法描述了一种在小鼠肿瘤切除手术中使用丙泊酚进行全静脉麻醉（TIVA）的模型。在此小鼠模型中，通过静脉导管利用注射泵给予丙泊酚（图1A，B），以模拟临床肿瘤手术麻醉中TIVA的给药方式。使用注射泵可通过从吸入麻醉快速转换为静脉给药，从而最大限度减少对挥发性麻醉剂的暴露。

通过基于丙泊酚的靶控输注麻醉（TIVA）实现稳定麻醉后，切除原发性乳腺肿瘤。体内生物发光成像用于确认原发肿瘤的完全切除（图2）。通过无创体内生物发光成像对小鼠进行定期监测，可检测到肺部由荧光素酶标记的肿瘤细胞引起的远处复发（图2）。该方法也可用于追踪乳腺脂肪垫内的局部复发。

除了追踪复发等长期事件外，该模型还可用于评估围手术期发生的事件。这些早期事件可能有助于揭示麻醉及其他手术因素对癌症相关结局的作用机制。在异丙...

讨论

本研究报道了一种在乳腺癌小鼠模型中使用丙泊酚实施全静脉麻醉（TIVA）的实验方案，该模型复制了癌症手术患者临床实践中TIVA的关键特征。该方案可用于在模拟癌症进展的小鼠模型中，研究癌症手术后短期和长期的临床相关结局，包括细胞因子水平检测和癌症复发情况（图2 和 图3）。该方法对于评估TIVA对癌症相关结局的影响，以及将其与其他麻醉技术（如吸入麻醉）进行比较具有重要应用价值。

与现有方案中通过单次腹腔注射丙泊酚用于血液采样等小规模干预措施期间的镇静不同¹⁰，本方案允许通过静脉持续输注丙泊酚，以在手术等重大干预期间维持麻醉。丙泊酚的诱导剂量和维持剂量均经过仔细滴定，旨在为重大外科手术提供适宜的麻醉深度，同时最大限度降低因低血压或心脏骤停导致的死亡风险。研究发现，通过在60秒内严格给予27 mg/kg的诱导剂量，同时逐步减少并停止吸入七氟烷，可避免低血压的发生。维持麻醉可通过以2.2–4.0 mg/kg/min速率输注丙泊...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	Fresnius Kabi	AUST R 197198
动脉钳	Proscitech	TS1322-140
丁丙诺啡	Temgesic	TEMG I
加热手术垫	Custom	-
皮下注射针头（30 G，1 mL 胰岛素注射器）	Terumo	NN3013R
IVIS Lumina	PerkinElmer	126274
荧光素	Promega	P1041/2/3
聚氨酯导管	Intramedic	427401
聚维酮碘	Betadine	AUST R 29562
丙泊酚 Lipuro，2%	Braun	3521490
七氟烷	Baxter	ANZ2L9117
七氟烷蒸发器	Vetquip	VQ1334
无菌纱布	Multigate Medical Products	11-600A
手术剪	Proscitech	TS1044
缝线，5-0 尼龙线	Dynek	V504
注射泵	Harvard Apparatus	70-4500
注射器（1 mL）	Terumo	SS+01T