肾缺血-再灌注损伤与住院患者的高发病率和高死亡率相关。本文介绍一种简单且有效的小鼠单侧肾缺血-再灌注损伤模型，并系统概述肾脏中典型的病理学改变过程。
本文内容
摘要
摘要
缺血-再灌注损伤（IRI）是急性肾衰竭的主要原因，也是导致移植肾功能延迟恢复的重要因素。动物模型是目前唯一能够模拟IRI相关损伤复杂性的可用资源 体内本文描述了一种有效的单侧肾缺血再灌注损伤（IRI）小鼠模型，可获得高度可重复的实验数据。通过阻断右侧肾蒂30分钟诱导缺血，随后进行再灌注。除手术操作外，还将通过比较7个不同再灌注时间点（4 h、8 h、16 h、1天、2天、4天和7天）的数据，系统概述肾IRI后预期发生的生理学及组织病理学变化。本文还将提供用于前瞻性实验设计的关键数据，如平均手术时间、平均麻醉剂消耗量以及随时间变化的体重变化。本研究将有助于研究人员建立可靠的肾IRI模型，并根据其特定研究目标选择合适的再灌注时间点。
引言
肾脏是体内血流灌注最丰富的器官之一，对血流灌注的变化极为敏感1肾缺血-再灌注损伤（IRI）仍是急性肾衰竭的主要病因2,3 并与住院患者的高发病率和高死亡率相关4治疗选择有限，4,5 肾缺血再灌注损伤目前是生物医学多个研究领域的重点6,7 旨在发现新的治疗靶点，并鉴定肾脏损伤早期且敏感的生物标志物8,9,10. 确定一种可靠且省时的方法 且具有成本效益的动物模型被认为是满足这些需求的关键。本文介绍了一种简单而有效的小鼠单侧肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型。通过夹闭右侧肾蒂30分钟以诱导缺血11,12该模型的关键部分是选择最合适的再灌注时间，以重现感兴趣的病理事件，例如肾小管坏死、多形核炎性细胞浸润或纤维化。因此，本文为研究人员提供了缺血-再灌注损伤肾脏中预期典型病理变化的逐步概述。
方案
以下方案描述了一种存活手术，因此需采用最高标准的无菌和外科操作规范。所有动物实验均遵循机构指南，并经机构动物护理与使用委员会批准。为消除性别 并且由于不同品系对缺血再灌注损伤（IRI）效应存在差异，本研究仅使用雄性C57BL6小鼠。所有动物在年龄和体重上均相匹配，以获得可比的结果。
1. 准备
注意：不同实验阶段和干预措施的时间线如图1A所示。
- 每次手术前清洁并消毒手术台。将所有所需材料（无菌器械和棉签、无菌纱布和手术巾、预先稀释的麻醉剂、加热垫、无菌血管夹、无菌生理盐水、皮肤消毒剂和缝合线）准备好并放置于手术台上（参见材料表）。
- 通过腹腔注射给予雄性C57BL6小鼠（年龄范围为11-13周）氯胺酮/赛拉嗪（剂量分别为100 mg/kg和20 mg/kg体重，预先用无菌生理盐水稀释）。
注意：熟练的动物操作至关重要，以尽量减少动物应激反应，因为应激反应可能对麻醉效果产生负面影响。 - 给予氯胺酮/赛拉嗪后，使用刀片和肥皂剃除右侧 flank 区域的毛发。
注意：剃除皮肤毛发有助于促进伤口愈合并改善生存手术的整体预后。 - 皮肤准备完成后，先用70%酒精、再用棉签蘸取聚维酮碘溶液对手术区域皮肤进行消毒。
- 皮肤准备完毕后，将小鼠置于加热台上，采取仰卧位，并通过直肠探头和垫式传感器监测，将体温稳定维持在37 °C。
注意：相较于侧卧位，仰卧位更便于术中对肾脏的暴露和操作。 - 在维持体温稳定的同时，将眼膏涂抹于小鼠眼部。
注意：分离型麻醉剂（如氯胺酮）会导致动物在麻醉期间眼睛保持睁开状态。
2. 手术
- 当疼痛反射消失（用镊子夹脚趾无反应）时，使用手术刀片在右侧腰部做一长约1 cm的背外侧手术切口。切口起始于最后一条肋骨后方，沿腰部中线向尾侧平行延伸约1 cm。
- 使用剪刀横断腹壁肌肉组织，以暴露腹膜后间隙。用无菌棉签清除肌肉切割过程中产生的少量血液。
注意：由于采用背外侧入路，本操作进入的是腹膜后间隙而非腹腔。 - 将右肾从腹腔中轻轻推出。使用格拉夫钳（Graefe forceps）小心暴露肾脏。
注意：使用钳子时应始终保持闭合状态，避免在腹部操作时对肾脏造成创伤；仅用于轻柔推动并引导肾脏移向并突出于手术切口。 - 缓慢暴露右肾，并辨认肾蒂结构。仔细清除肾蒂周围的脂肪组织。
- 为诱导缺血，将血管夹夹闭肾蒂中的肾动脉和肾静脉，注意避免夹闭邻近的输尿管。使用哈尔斯泰德-蚊式止血钳（Halsted-Mosquito hemostat）操作血管夹。
注意：通过观察肾脏颜色由红粉色变为深紫色，可确认缺血成功（图1B）。 - 用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖夹闭后的肾脏，防止干燥，并维持30分钟。
- 在此期间定期监测麻醉深度及纱布湿度。
注意：麻醉诱导剂量足以在整个缺血过程中维持镇痛效果，因此无需追加麻醉药物注射。 - 在缺血期即将结束前，移除纱布并暴露肾脏。手持哈尔斯泰德-蚊式止血钳，准备取下血管夹。
- 第30分钟时，使用止血钳打开血管夹，并将其从肾蒂上移除，以恢复肾脏血流灌注。
注意：通过观察肾脏颜色由深紫色恢复为红粉色，可确认再灌注成功（图1C）。 - 对假手术组动物执行上述相同操作，但不夹闭肾蒂。
- 确认肾脏颜色变化后，将肾脏复位至腹腔内。使用5-0可吸收缝线以十字缝合方式关闭腹壁肌肉。
注意：在缝合肌肉和皮肤过程中，可能需要追加一次麻醉剂注射以维持镇痛效果。初始剂量的一半已被证实可有效维持镇痛至手术结束。 - 使用5-0可吸收缝线以水平褥式缝合法关闭皮肤。用棉签蘸取聚维酮碘溶液清洁伤口。
3. 恢复与术后护理
注意：由于术后时间即为实际再灌注时间，因此适当的术后护理在伦理上是必须的，在科学上也具有重要意义。再灌注时间可根据研究人员的需求进行选择。通过比较4小时、8小时、16小时、1天、2天、4天和7天的再灌注时间，可以获得肾缺血-再灌注损伤（IRI）所诱导的病理变化的连续性概述。
- 将小鼠保持在加热垫上，直至其从麻醉状态开始恢复。
注意：建议等待小鼠开始活动四肢并试图移动后再将其移开。若手术过程中需要追加麻醉注射，则恢复时间会更长。可给予α-2受体拮抗剂阿替美唑（0.5 mg/kg体重，腹腔注射），以逆转赛拉嗪的作用，缩短恢复期。为进行疼痛管理，术前及术后恢复期间每6小时给予一次布托啡诺（0.1 mg/kg体重，腹腔注射）。不建议使用非甾体类抗炎药物，因该类药物中的多种成分可引起肾毒性，从而影响实验结果。 - 麻醉恢复后，将小鼠放回笼中，并确保其可自由获取水和食物。
注意：可提供压碎的食物置于培养皿中，同时提供用于躲藏和玩耍的材料（如纸片、纸巾卷筒）。 - 每日监测小鼠伤口愈合情况、摄食与饮水量、体重变化及行为表现。
注意：伤口愈合状态采用以下评分标准进行评估：1分，干燥；2分，湿润；3分，部分开放；4分，完全开放。本研究中观察到伤口愈合较快，术后第2天起超过90%的伤口已呈干燥状态。
4. 安乐死与样本采集
- 以戊巴比妥钠按两倍小鼠麻醉剂量（100 mg/kg）经腹腔注射实施安乐死。
- 根据需要采集体液和组织样本。
注意：采集双侧肾脏、全血（用于血细胞计数）、血清（用于血液生化分析）、尿液、心脏和肺组织。血液生化分析（血尿素氮（BUN）、肌酐、电解质）需数微升血清。如需收集更多尿液以测定肾功能参数，可在安乐死前24小时将小鼠置于代谢笼中。
结果
生理参数
小鼠在接受单侧肾缺血再灌注损伤（IRI）手术后恢复顺利，表现活跃且警觉，术后次日进食、饮水及行为均正常。部分小鼠在IRI术后可能出现体重下降，但通常不超过初始体重的10%（图2）。若体重下降超过10%，可能对动物造成不利影响，此类动物应从研究中剔除。假手术小鼠在术后未出现体重变化（术后24小时测量）。大多数小鼠在术后第4至7天之间恢复至初始体重（参见IRI 7天组，图2）。肾功能可通过传统指标如血尿素氮（BUN）和肌酐进行评估。此外，分析中还包括血清电解质水平（钠、钾和氯）以及自动血液分类计数。
组织病理学改变
采用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋的肾脏全中矢状切片，经苏木精/伊红（HE）、过碘酸-雪夫染色及Masson三色染色后，对组织病理学结果进行评估。该单侧肾缺血再灌注损伤（IRI）模型最显著的改变出现在皮髓交界区，主要累及近端小管、亨利袢厚升支和远端曲状小管，以及小管间质（参见图3的图注）。图3展示了肾脏在IRI后最具代表性的显微病变图像。表1列出了IRI后依次出现的组织病理学改变。
建立了一种小管损伤评分系统，用于对随时间推移的损伤程度进行分类（图4）。该系统通过三位不同评估者对以下五种明确的改变进行评估：1）小管上皮变薄；2）刷状缘丢失；3）小管坏死；4）管腔阻塞；5）蛋白管型的存在。评分为“1”表示该改变存在，“0”表示不存在。
图1：小鼠肾脏缺血-再灌注损伤（IRI）实验模型。（A）显示实验各阶段及干预措施（麻醉诱导、缺血和再灌注）。请注意右肾在缺血期间颜色由正常变为深红色（B），再灌注期间恢复为粉红色（C）。（D）术后24小时，同一动物经IRI处理的右肾（红箭头）与对侧未处理肾的宏观外观对比。图（B）中红箭头指示止血钳的位置。缩写：IRI = 缺血-再灌注损伤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：小鼠肾缺血-再灌注损伤（IRI）前后体重变化。显示各数据点。缩写：IRI = 缺血-再灌注损伤；h = 小时；d = 天。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：缺血-再灌注手术小鼠皮质及皮髓交界区观察到的典型显微病变。 显示假手术组及不同再灌注时间点（每张图片上方标注）。(A) 假手术组显示结构完整（放大倍数40x；比例尺 = 20 µm）。IRI 4 h组箭头指示小管腔内蛋白样管型的存在（放大倍数40x；比例尺 = 20 µm）。IRI 8 h组箭头显示小管扩张（放大倍数40x；比例尺 = 50 µm）。IRI 16 h组黑箭头显示髓质段小管管型；白箭头显示细胞坏死区域（放大倍数40x；比例尺 = 50 µm）。IRI 1 d组黑箭头指示小管扩张（放大倍数10x；比例尺 = 100 µm）。IRI 2 d组黑箭头显示细胞核增大；白箭头指示淋巴细胞和巨噬细胞浸润区域（放大倍数40x；比例尺 = 50 µm）。IRI 4 d组白箭头指示有丝分裂的小管细胞（放大倍数40x；比例尺 = 50 µm）。IRI 7 d组黑箭头显示局灶性纤维化区域；白箭头指示再生区域（放大倍数20x；比例尺 = 100 µm）。(B) PAS染色显示早期再灌注阶段（4 h、8 h和16 h）小鼠肾皮质。注意刷状缘逐渐变薄（箭头）。放大倍数40x；比例尺 = 50 µm。(C) 假手术组与IRI 7 d组小鼠的Masson三色染色，显示间质纤维化区域（白箭头）。放大倍数40x；比例尺 = 50 µm。缩写：IRI = 缺血-再灌注损伤；Glo = 肾小球；PCT = 近曲小管；DCT = 远曲小管；CD = 集合管；PAS = 过碘酸雪夫染色；d = 天。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：假手术组与缺血-再灌注损伤（IRI）手术小鼠的肾小管损伤评分。 评分系统范围为1至5，评估指标包括肾小管上皮变薄、刷状缘丢失、肾小管坏死、管腔阻塞以及蛋白管型的存在。评分为“1”表示该改变存在，“0”表示不存在。显示为单个数据点，柱状图表示均值±标准差（n = 4）。缩写：IRI = 缺血-再灌注损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。
| IRI 后时间 | 最显著的病理变化 |
| 4 h | 肾小管阻塞 |
| 管腔内蛋白管型 | |
| 8 h | 肾小管扩张 |
| 早期坏死 | |
| 上皮变薄 | |
| 16 h | 细胞坏死 |
| 肾小管管型 | |
| 中性粒细胞浸润 | |
| 1 天 | 坏死 |
| 肾小管扩张 | |
| 中性粒细胞浸润 | |
| 2 天 | 肾小管扩张 |
| 淋巴细胞和巨噬细胞浸润 | |
| 细胞核增大 | |
| 4 天 | 肾小管细胞有明显的有丝分裂活性 |
| 7 天 | 局灶性纤维化 |
| 再生区域 |
表1：随时间推移最显著的病理学变化。 根据每组4-6只动物的显微镜检查结果进行诊断。
讨论
小鼠肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型在生物医学研究中广受欢迎，因其手术成本相对较低，且存在多种转基因模型可供选择12。本文介绍的单侧肾IRI模型可模拟人类肾IRI中观察到的典型病理改变，如肾小管扩张、坏死和纤维化13。这些结果基于不同的再灌注时间而获得。
该方案的关键步骤包括维持恒定的体温以及将血管夹正确放置于肾蒂部位。体温会影响动物的代谢14，从而在生理和细胞水平上改变实验结果15。在本模型中，术前使用直肠和垫式传感器探头对体温进行稳定。此外，强烈建议在整个手术过程中持续监测体温，尤其是在放置血管夹以诱导缺血之前。
暴露肾脏并正确放置血管夹对于实验的成功也至关重要。在经手术切口暴露肾脏过程中，若使用镊子操作不当而损伤肾包膜，将导致肾周出血和炎症。血管夹应夹在肾蒂上，阻断肾动脉和肾静脉，同时避免影响输尿管和肾上腺上动脉。此步骤的关键在于仔细分离肾门周围脂肪组织14,16。
该模型具有成本低、耗时短的优点。每只小鼠麻醉剂消耗量为156.47 ± 37.88 µL（均值 ± 标准差，n = 17），所用麻醉剂为预先稀释的氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮1:10，赛拉嗪1:50，溶于生理盐水；储备液浓度均为100 mg/mL）。手术可在相对较短的时间内完成，每只小鼠的总手术时间为53 ± 5.23分钟（均值 ± 标准差，n = 17）。在经过培训的人员操作下，可同时开展多台手术。在本研究团队中，一名经验丰富的研究人员负责完成从开始至肾蒂夹闭释放的手术步骤，另一名研究人员则接手从伤口缝合直至小鼠恢复的后续操作。通过这种协作方式，我们能够在单日内完成大量手术。在本模型中，我们采用了背外侧入路，与腹正中入路相比，该方法造成的创伤更小，并减少了腹腔的液体和热量流失16。
既往已发表的实验方案描述了通过肾蒂夹闭技术在小鼠中诱导急性肾损伤17,18,19。然而，在这些研究中，除单侧缺血-再灌注损伤（IRI）外，还进行了对侧肾切除术，缺血时间范围为15至26分钟。在本方案中，我们对单侧肾脏进行30分钟缺血处理，同时保留对侧肾脏。该方法实现了100%的存活率。然而，由于未手术干预的对侧肾脏具有代偿作用，该模型不适用于诱导氮质血症性肾损伤。尽管如此，在同一动物中保留一个未受损的肾脏，其优势在于可采用更长的缺血时间并获得更高的存活率。此外，该模型还可利用对侧肾脏评估实验过程中所用测试药物或治疗措施可能产生的副作用，并用于研究肾脏之间的交互作用20,21。例如，该模型已被成功用于揭示缺血-再灌注损伤肾脏及未手术干预的对侧肾脏在细胞水平上由活性氧物种诱导的改变11。
该模型在旨在识别和表征单侧肾损伤标志物、肾脏间相互作用效应、肾后性缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的血流动力学变化以及拟用于肾缺血-再灌注损伤药物候选物潜在肾毒性作用的研究中具有潜在应用价值。对主要病理变化的详细描述为选择研究特定细胞过程的最合适时间点提供了有价值的工具，这些过程包括从炎症和坏死（4小时至2天）、再生（4天）到纤维化（7天及以后）。
披露
作者声明本文不存在利益冲突。
致谢
本文所展示的部分工作由圣基茨和尼维斯罗斯大学兽医学院（RUSVM）整合哺乳动物研究中心资助。特此感谢长岛大学兽医学院兽医生物医学科学系提供的财政援助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸阿替美唑 | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PVS8700 | 5 mg/mL |
| 布托啡诺 | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PRMBURPEN22 | 0.3 mg/mL |
| 商用安乐死溶液 | 多个供应商 | na | 例如，Euthasol Virbac（戊巴比妥钠 390 mg/mL + 苯妥英钠 50 mg/mL） |
| 眼膏 Puralube | Dechra Veterinary Products, KS, USA | na | 3.5 g (1/8 oz) |
| 加热垫 RightTempJr | Kent Scientific, CT, USA | RT-JR-20 | 建议选择带有两个温度探头的型号 |
| 盐酸氯胺酮 | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VED1220 | 100 mg/mL |
| S&T 血管夹 | Fine Science Tools, Inc., Germany | 00398-02 | 钳口尺寸：5.5 × 1.5 mm；长度：11 mm |
| 无菌一次性手术巾单 | Kent Scientific, CT, USA | SURGI-5023-3 | 一次性使用，独立包装 |
| 外科手术器械（格拉费镊、哈尔斯特德-蚊式止血钳、剪刀等） | Fine Science Tools, Inc., Germany | Various | 建议选用超细直剪和弯头格拉费镊 |
| 薇乔缝线 | Ethicon US, LLC | J493G | 5-0 规格 |
| 盐酸赛拉嗪 | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VAM4821 | 100 mg/mL |
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