快速、经济且简便的细菌无细胞裂解物制备

摘要

本方案描述了一种快速且简单的制备细菌裂解液的方法，用于无细胞基因表达，该方法使用基因工程改造的Escherichia coli菌株，仅需常规实验室设备即可完成。

摘要

无细胞基因表达能够在无需完整生物体的情况下发挥生物学功能。尽管目前已存在多种此类基因表达系统，但大多数系统购买成本高昂，和/或需要特殊设备以及高度熟练的专业技术才能有效制备。本方案描述了一种仅使用常规实验室设备、且所需处理步骤极少的细菌无细胞裂解液制备方法，该裂解液可支持高水平的基因表达。该方法采用一种能够表达内溶素的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，该内溶素不影响细菌生长，但在收获的菌体沉淀物经历简单的冻融循环后可高效裂解细胞。后续仅需短暂孵育，再通过离心去除自溶产物中的细胞碎片即可。在收获细胞前，通过在细胞中异源表达ClpX蛋白酶，可实现动态基因回路的构建。采用缺失lacZ基因的大肠杆菌（E. coli）菌株，可用于基于比色或荧光信号检测的高灵敏度无细胞生物传感应用。整个实验流程最短仅需8至9小时，从接种到完成仅需1至2小时的动手操作时间。该方法通过降低获取无细胞裂解液的成本和时间，有望提升无细胞基因表达在各类应用中的可及性与经济性。

引言

无细胞裂解液中的基因表达相比使用活细胞具有多项优势^1,2,3,4。裂解液可轻松进行生化修饰，并可用于对活细胞有害或难以实现的实验条件。基因表达回路无需与宿主的生物学过程相互干扰或竞争，测试新的遗传回路仅需加入DNA即可完成。基于这些原因，无细胞基因表达已应用于多个领域，从生物传感器^5,6到合成基因回路的快速原型构建^7,8，再到人工细胞的开发⁹。目前大多数无细胞基因表达系统依赖经过高度加工的细胞裂解液，通常需要耗时且复杂的制备流程、专用设备和/或敏感的操作步骤，这些因素可能导致不同操作者之间以及不同批次之间出现显著差异^10,11。

本文介绍了一种简单高效的无细胞裂解液制备方法，该方法所需处理步骤极少，且无需专业技术

方案

1. 准备培养基和缓冲液。

1. 制备2xYTPG培养基。
   1. 将62 g 2xYT粉末、5.99 g磷酸二氢钾、13.93 g磷酸氢二钾溶于去离子水中，定容至2 L。
   2. 在液体循环条件下高压灭菌，灭菌时间为30 min¹⁴。
   3. 向1.1.2步骤中获得的400 mL 2xYTP培养基中加入7.2 g D-葡萄糖（右旋糖），搅拌至完全溶解。
   4. 通过0.2 µm滤膜过滤除菌。
2. 制备S30A缓冲液。
   1. 混合Tris-HCl（终浓度50 mM，pH 7.7）、谷氨酸钾（终浓度60 mM）和谷氨酸镁（终浓度14 mM）。
   2. 使用10 M KOH将pH调节至7.7。
3. 制备溶液1（见表1）。
   1. 将4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）溶于2 mL水中。
   2. 使用KOH将pH调节至8.0。
   3. 加入表1中列出的所有其他组分。
   4. 使用10 M KOH将pH调节至7.6，然后过滤除菌。
4. 制备2.5x预混液（见表2）。

结果

通过使用自裂解物在组成型表达质粒（此处为 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500）中表达 GFP，并在酶标仪中记录 GFP 荧光随时间的变化，可观察到代表性结果（图 1B）。对质粒 DNA 进行系列稀释后发现，即使在 1 nM DNA 浓度下仍可实现强表达。与 commercially available 裂解物相比，自裂解物可产生更高的总产量，并达到更高的最大合成速率，该速率通过 GFP 时间曲线的时间导数计算得出（图 1C、D）。有关使用该方法的更多结果，请参见 Didovyk 等人¹²。本方案的失败环节相对较少；然而，若自裂解物中细胞碎片未充分去除，则可能导致结果不理想。此外，为获得最佳结果，可能需要针对每批裂解物优化 PEG-8000 和 Mg²⁺ 的浓度（见注释 2）。

讨论

本方案可制备出具有高活性的细菌裂解液，用于无细胞基因表达。关键在于使用携带质粒 pAD-LyseR 的细菌，该质粒可在细胞质中表达λ噬菌体的内溶素。当细胞内膜通透性发生改变时，这些细胞即被致敏而发生自溶，从而使内溶素能够作用于细胞壁；本方法通过简单的冻融循环实现内膜通透化。由于细胞实质上是自我裂解，所得产物被称为自溶裂解液（autolysate）。细胞裂解后，仅需经过孵育和离心步骤，即可去除细胞碎片，获得澄清的自溶裂解液。

与其他制备细菌裂解液的方法相比，该方法显著简便且快速，同时并未牺牲裂解液的质量。在接种生产培养物后，整个方案可在8-9小时内完成，仅需1-2小时的动手操作时间。唯一建议使用但并非分子生物学实验室完全标配的设备是能够达到30,000 × g 的离心机。然而，即使使用转速较低的离心机，也能制备出质量相当的自溶裂解液（图1C、D）；此时用户只需在去除上清液时更加小心，可能需保留稍多液体以确保样品纯净。这种简便性不仅仅是操作上的便利；更简单的方案通常具有更高的可重复性，不同操作者执行时结果变异.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2xYT 培养基	EMD Millipore	4.85008	或同类产品
3-磷酸甘油酸（3-PGA）	Sigma Aldrich	P8877	或同类产品
Amicon Ultra-15 离心滤过管，3 kDa 截留分子量	Millipore Sigma	UFC900308	可选，可用于浓缩裂解液，应根据待浓缩体积选择合适容量的浓缩管
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A0166-5G	或羧苄青霉素，一种更稳定的变体
ATP	Sigma Aldrich	A8937	或同类产品
cAMP	Sigma Aldrich	A9501	或同类产品
辅酶A（CoA）	Sigma Aldrich	C4282	或同类产品
CTP	United States Biosciences	14121	或同类产品
D-葡萄糖（右旋糖）	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	AAA1749603	或同类产品
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma Aldrich	D0632-1G	或同类产品
携带 pAD-LyseR 质粒的大肠杆菌 BL21-Gold (DE3)	Addgene	99244
携带 pAD-LyseR 质粒的 lacZ 基因缺失型大肠杆菌 BL21-Gold (DE3) ΔlacZ	Addgene	99245
亚叶酸	Sigma Aldrich	F7878	或同类产品
GTP	United States Biosciences	16800	或同类产品
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-25G	或同类产品
LB 培养基	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	DF0446075	或同类产品
谷氨酸镁	Sigma Aldrich	49605-250G	或同类产品
NAD	Sigma Aldrich	N6522	或同类产品
谷氨酸钾	Sigma Aldrich	G1501-100G	或同类产品
氢氧化钾（KOH）	Sigma Aldrich	221473-25G	用于调节 pH
磷酸氢二钾	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP363-500	或同类产品
磷酸二氢钾	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	BP362-500	或同类产品
亚精胺	Sigma Aldrich	85558	或同类产品
Tris-HCl	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	9310500GM	或同类产品
tRNA 混合物	罗氏（Roche）	10109541001	或同类产品
UTP	United States Biosciences	23160	或同类产品