本方案描述了一种快速且简单的制备细菌裂解液的方法，用于无细胞基因表达，该方法使用基因工程改造的Escherichia coli菌株，仅需常规实验室设备即可完成。
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摘要
摘要
无细胞基因表达能够在无需完整生物体的情况下发挥生物学功能。尽管目前已存在多种此类基因表达系统，但大多数系统购买成本高昂，和/或需要特殊设备以及高度熟练的专业技术才能有效制备。本方案描述了一种仅使用常规实验室设备、且所需处理步骤极少的细菌无细胞裂解液制备方法，该裂解液可支持高水平的基因表达。该方法采用一种能够表达内溶素的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，该内溶素不影响细菌生长，但在收获的菌体沉淀物经历简单的冻融循环后可高效裂解细胞。后续仅需短暂孵育，再通过离心去除自溶产物中的细胞碎片即可。在收获细胞前，通过在细胞中异源表达ClpX蛋白酶，可实现动态基因回路的构建。采用缺失lacZ基因的大肠杆菌（E. coli）菌株，可用于基于比色或荧光信号检测的高灵敏度无细胞生物传感应用。整个实验流程最短仅需8至9小时，从接种到完成仅需1至2小时的动手操作时间。该方法通过降低获取无细胞裂解液的成本和时间，有望提升无细胞基因表达在各类应用中的可及性与经济性。
引言
无细胞裂解液中的基因表达相比使用活细胞具有多项优势1,2,3,4。裂解液可轻松进行生化修饰，并可用于对活细胞有害或难以实现的实验条件。基因表达回路无需与宿主的生物学过程相互干扰或竞争，测试新的遗传回路仅需加入DNA即可完成。基于这些原因，无细胞基因表达已应用于多个领域，从生物传感器5,6到合成基因回路的快速原型构建7,8，再到人工细胞的开发9。目前大多数无细胞基因表达系统依赖经过高度加工的细胞裂解液，通常需要耗时且复杂的制备流程、专用设备和/或敏感的操作步骤，这些因素可能导致不同操作者之间以及不同批次之间出现显著差异10,11。
本文介绍了一种简单高效的无细胞裂解液制备方法，该方法所需处理步骤极少，且无需专业技术图1A)12该方法依赖于 E. coli 经过基因改造的细胞可在简单的冻融循环后发生裂解。这些细胞表达来自λ噬菌体的一种内溶素，可降解细胞壁。在细胞生长过程中，该内溶素滞留在细胞质中，与细胞壁隔离。然而，一次简单的冻融循环会破坏细胞质膜，使内溶素释放至周质空间，在此降解细胞壁，从而导致细胞迅速裂解。该实验方案仅需数小时的动手操作时间，且仅需一台冷冻设备和一台可达到30,000 × g （为获得最佳效果；较低转速也可使用，但需小心避免扰动沉淀），涡旋混合器以及一种简单的缓冲溶液。甚至可通过将细胞冻干后再重新水化来制备具有功能的裂解液 原位然而，该方法制备的裂解液活性较低，可能原因是 由于残留的细胞碎片。
裂解液具有高效的无细胞基因表达活性，并可根据最终用途通过多种方式加以优化。使用标准的离心浓缩装置浓缩裂解液可进一步提高蛋白质合成速率。通过添加纯化的GamS蛋白，可保护线性DNA免受降解。为了实现更复杂的电路动态（如振荡）所必需的蛋白质降解，可在自裂解液生产菌株中共表达ClpX六聚体13。此外，使用缺失lacZ基因的自裂解菌株可实现基于LacZ的可视化读出。总体而言，该方法可制备出具有高活性的无细胞裂解液，适用于多种应用。
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方案
1. 准备培养基和缓冲液。
- 制备2xYTPG培养基。
- 将62 g 2xYT粉末、5.99 g磷酸二氢钾、13.93 g磷酸氢二钾溶于去离子水中，定容至2 L。
- 在液体循环条件下高压灭菌，灭菌时间为30 min14。
- 向1.1.2步骤中获得的400 mL 2xYTP培养基中加入7.2 g D-葡萄糖（右旋糖），搅拌至完全溶解。
- 通过0.2 µm滤膜过滤除菌。
- 制备S30A缓冲液。
- 混合Tris-HCl（终浓度50 mM，pH 7.7）、谷氨酸钾（终浓度60 mM）和谷氨酸镁（终浓度14 mM）。
- 使用10 M KOH将pH调节至7.7。
- 制备溶液1（见表1）。
- 将4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）溶于2 mL水中。
- 使用KOH将pH调节至8.0。
- 加入表1中列出的所有其他组分。
- 使用10 M KOH将pH调节至7.6，然后过滤除菌。
- 制备2.5x预混液（见表2）。
- 混合表2中列出的所有组分。
- 使用KOH将pH调节至7.5。
- 分装后于-80 °C保存。
注意：每20 µL反应体系中加入8.9 µL预混液。
2. 准备细胞。
- 用接种环将自溶细胞涂布于含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，在 37 °C 培养（见注释 1）。
- 用移液器吸头挑取单菌落接种至含有氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 °C 过夜培养。
- 将 400 µL 起始培养物接种至含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 400 mL 2xYTPG 培养基中，于 1 L 三角烧瓶中在 37 °C、300 rpm 条件下振荡培养。
- 使用分光光度计定期测定培养物在 600 nm 处的光密度（OD600），采用光程为 1 cm 的比色皿进行检测。当 OD600 超过 1 时，开始在测定前将培养物稀释 5 倍，以确保测定值处于典型实验室分光光度计的线性范围内。继续培养细胞，直至 5 倍稀释后的培养物 OD600 达到 0.3（相当于原始培养物 OD600 为 1.5）。
3. 准备裂解液。
- 制备含有2 mM二硫苏糖醇（DTT）的S30A缓冲液。混合3 加入6 µL 1 M的DTT储存液至S30A缓冲液中，混匀后置于冰上，用于步骤3.7。
- 通过在1800 × g下离心收集细胞 g 室温下孵育15分钟。
- 弃去上清液，先倾倒掉大部分液体，再用移液器吸除残留液体。
- 将沉淀物用45 mL冷的（4–10 °C）S30A缓冲液通过涡旋混合器重悬。
- 称量一个空的50 mL离心管，将细胞转移至其中，重复步骤3.2–3.3以洗涤细胞。
- 称量沉淀，需减去一个空的50 mL离心管的重量。务必仔细吸除残留的上清液，以确保沉淀重量的准确测量。
注意：400 mL 生产培养物通常可获得约 1.3 g 细胞沉淀。 - 加入2倍体积的冷S30A缓冲液（含2 mM二硫苏糖醇），即每1 g细胞沉淀加入2 mL缓冲液，并通过剧烈涡旋振荡重悬细胞。
- 冻存细胞。将含有细胞的50 mL离心管置于 将细胞置于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中冷冻，直至沉淀完全冻结。
注意：冷冻步骤是当天实验的一个合适暂停点。 - 在室温水浴中解冻细胞。
- 剧烈涡旋振荡 2-3 分钟。
- 37 °C、300 rpm 条件下振荡孵育 45 分钟。
- 通过在透明离心管中以30,000 × g离心，去除样品中的大量细胞碎片 g 45 分钟，4 °C。
注意：如果无法提供可达到 30,000 × g 的离心机，则在 21,000 × g 条件下离心 45 分钟 g，并在步骤 3.13 中需格外小心，因为沉淀物会较为松散。 - 用移液器小心地将上清液转移至新离心管中，尽量避免扰动沉淀。若转移的上清液中混有沉淀物，则重复上一步骤。
- 将上清液转移至1.5 mL离心管中，再次于21,000 × g （或台式离心机的最高转速）离心5分钟。
- 将澄清的自溶产物分装至所需体积，注意避免混入残留的沉淀物，立即使用或于 -80 °C 冻存。
注意：单个20 µL反应使用8 µL自溶物。
4. 无细胞基因表达
注意：自溶物现在已准备好用于任何所需的最终用途。以下是无细胞基因表达的一个标准操作流程示例。
- 对于20 µL反应体系，冰上混合8 µL自溶产物和8.9 µL预混液。有关谷氨酸镁和PEG 8000浓度优化的说明，请参见本方案末尾的 NOTE 。
- 加入DNA（例如pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500，终浓度为8 nM）、其他任何试剂以及水，补足至20 µL。
- 将反应液加入384孔微孔板中，使用酶标仪测定荧光随时间变化曲线和/或终点信号。对于绿色荧光蛋白（GFP），激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。
5. 实验方案的修改
注意：对本方案进行以下修改后，可使其适用于其他应用。
- 使用线性DNA模板进行无细胞基因表达
- 执行第4节中的步骤，在加入线性DNA之前，向反应体系中补充2.2 µM纯化的GamS蛋白（其表达与纯化方法见文献12）。
- 整合蛋白质降解的无细胞基因表达
- 在步骤2.1中，使用含有质粒pACYC-FLAG-dN6-His的自溶细胞（参见材料表）。在所有培养基中额外添加34 µg/mL氯霉素。
- 在步骤2.3中，在培养基中加入40 µM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），以诱导质粒上的基因表达。
- 重复步骤3.2–3.4（洗涤）两次（共洗涤三次），以确保完全去除作为翻译抑制剂的氯霉素。前两次洗涤（步骤3.4）中，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）替代S30A缓冲液。
- 在步骤4.2中，额外补充3 mM ATP（从100 mM ATP水溶液储备液，pH 7.2中添加）和4.5 mM谷氨酸镁（使用1 M水溶液储备液），以补偿ClpXP高消耗ATP以及额外ATP对镁离子的螯合作用（均为终浓度）。
- 基于LacZ检测读数（包括比色法）的无细胞基因表达
- 在步骤2.1中，使用本身不表达LacZ的自溶细胞（参见材料表）。
- 或者，直接从冻干细胞制备裂解液。
- 完成步骤1.1至3.7的所有操作。
- 将8 µL细胞悬液与8.9 µL预混液混合。
- 加入质粒DNA（如需要）、其他定制试剂和水，使终体积达到20 µL。
- 将反应液转移至384孔微孔板并进行冻干。
注意：冻干样品可保存长达一周，甚至更长时间。 - 启动反应时，用18 µL去离子水重悬反应体系，并可根据需要添加DNA或其他试剂。
- 使用酶标仪监测荧光动力学变化。
注意 1：自溶细胞在冻融循环中会裂解，因此在制备冻存菌种时使用冷冻保护剂尤为重要。我们将菌种悬浮于24%（w/v）甘油中，于-80 °C保存。
注意 2：镁离子和 PEG 8000 对裂解液性能至关重要。基础 2.5× 预混液根据先前发表的数据配制，含有 6 mM 谷氨酸镁和 4.8%（wt/vol）PEG 8000，在最终反应体系中的浓度分别为 2.4 mM 和 1.9%。采用本方案制备的自裂解液在最终反应体系中通常最佳性能需要额外添加 5 mM 谷氨酸镁和 1.5% PEG 8000。然而，可根据实际情况在额外添加 0–10 mM 谷氨酸镁和 0–3% PEG 8000 的范围内进行优化（相对于基础预混液）。为配制推荐的额外含有 5 mM 谷氨酸镁和 1.5% PEG 8000（终浓度）的预混液，将 380 µL 预混液与 4.75 µL 的 1 M 谷氨酸镁溶液以及 36.1 µL 的 40%（weight/volume）PEG 8000 溶液混合即可。
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结果
通过使用自裂解物在组成型表达质粒（此处为 pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500）中表达 GFP，并在酶标仪中记录 GFP 荧光随时间的变化，可观察到代表性结果（图 1B）。对质粒 DNA 进行系列稀释后发现，即使在 1 nM DNA 浓度下仍可实现强表达。与 commercially available 裂解物相比，自裂解物可产生更高的总产量，并达到更高的最大合成速率，该速率通过 GFP 时间曲线的时间导数计算得出（图 1C、D）。有关使用该方法的更多结果，请参见 Didovyk 等人12。本方案的失败环节相对较少；然而，若自裂解物中细胞碎片未充分去除，则可能导致结果不理想。此外，为获得最佳结果，可能需要针对每批裂解物优化 PEG-8000 和 Mg2+ 的浓度（见注释 2）。
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讨论
本方案可制备出具有高活性的细菌裂解液，用于无细胞基因表达。关键在于使用携带质粒 pAD-LyseR 的细菌，该质粒可在细胞质中表达λ噬菌体的内溶素。当细胞内膜通透性发生改变时，这些细胞即被致敏而发生自溶，从而使内溶素能够作用于细胞壁；本方法通过简单的冻融循环实现内膜通透化。由于细胞实质上是自我裂解，所得产物被称为自溶裂解液（autolysate）。细胞裂解后，仅需经过孵育和离心步骤，即可去除细胞碎片，获得澄清的自溶裂解液。
与其他制备细菌裂解液的方法相比，该方法显著简便且快速，同时并未牺牲裂解液的质量。在接种生产培养物后，整个方案可在8-9小时内完成，仅需1-2小时的动手操作时间。唯一建议使用但并非分子生物学实验室完全标配的设备是能够达到30,000 × g 的离心机。然而，即使使用转速较低的离心机，也能制备出质量相当的自溶裂解液（图1C、D）；此时用户只需在去除上清液时更加小心，可能需保留稍多液体以确保样品纯净。这种简便性不仅仅是操作上的便利；更简单的方案通常具有更高的可重复性，不同操作者执行时结果变异...
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披露
J.H. 是专注于癌症治疗的 GenCirq 公司的联合创始人。他在 GenCirq 董事会任职，并持有该公司股权。
致谢
作者感谢加州理工学院的Zachary Sun和Richard Murray慷慨提供质粒P_araBAD-gamS，以及京都工艺纤维大学的Kaeko Kamei慷慨提供高速冷冻离心机。本研究得到了美国国立卫生研究院资助、美国陆军研究办公室多学科大学研究计划（ARO MURI）资助，以及日本文部科学省优秀青年研究者领军计划的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2xYT 培养基 | EMD Millipore | 4.85008 | 或同类产品 |
| 3-磷酸甘油酸（3-PGA） | Sigma Aldrich | P8877 | 或同类产品 |
| Amicon Ultra-15 离心滤过管，3 kDa 截留分子量 | Millipore Sigma | UFC900308 | 可选，可用于浓缩裂解液，应根据待浓缩体积选择合适容量的浓缩管 |
| 氨苄青霉素 | Sigma Aldrich | A0166-5G | 或羧苄青霉素，一种更稳定的变体 |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | 或同类产品 |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | 或同类产品 |
| 辅酶A（CoA） | Sigma Aldrich | C4282 | 或同类产品 |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | 或同类产品 |
| D-葡萄糖（右旋糖） | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | AAA1749603 | 或同类产品 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich | D0632-1G | 或同类产品 |
| 携带 pAD-LyseR 质粒的大肠杆菌 BL21-Gold (DE3) | Addgene | 99244 | |
| 携带 pAD-LyseR 质粒的 lacZ 基因缺失型大肠杆菌 BL21-Gold (DE3) ΔlacZ | Addgene | 99245 | |
| 亚叶酸 | Sigma Aldrich | F7878 | 或同类产品 |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | 或同类产品 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | 或同类产品 |
| LB 培养基 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | DF0446075 | 或同类产品 |
| 谷氨酸镁 | Sigma Aldrich | 49605-250G | 或同类产品 |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | 或同类产品 |
| 谷氨酸钾 | Sigma Aldrich | G1501-100G | 或同类产品 |
| 氢氧化钾（KOH） | Sigma Aldrich | 221473-25G | 用于调节 pH |
| 磷酸氢二钾 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP363-500 | 或同类产品 |
| 磷酸二氢钾 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | BP362-500 | 或同类产品 |
| 亚精胺 | Sigma Aldrich | 85558 | 或同类产品 |
| Tris-HCl | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 9310500GM | 或同类产品 |
| tRNA 混合物 | 罗氏（Roche） | 10109541001 | 或同类产品 |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | 或同类产品 |
参考文献
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