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使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

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DOI：

10.3791/62762

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2021年7月21日

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1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠和GST融合的TPR基序共伴侣蛋白，以及与Hsp90来源肽段偶联的受体微珠来检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。我们已应用该技术筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并鉴定出高效且选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。

摘要

靶向热休克蛋白90（Hsp90）与共伴侣蛋白之间的相互作用，为特异性调控依赖Hsp90的细胞内过程提供了可能。Hsp90 C末端保守的MEEVD五肽是其与共伴侣蛋白中四肽重复（TPR）结构域相互作用的关键区域。FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是两种结构相似但功能不同的含TPR结构域的共伴侣蛋白，参与类固醇激素相关疾病的发生发展。因此，发现能够特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的小分子化合物，为多种人类疾病的治疗提供了有前景的策略。本文描述了一种放大发光 proximity 均相检测方法的实验方案，用于检测Hsp90与其伴侣蛋白FKBP51和FKBP52之间的相互作用。首先，我们纯化了带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签的含TPR结构域的FKBP51和FKBP52蛋白。利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠捕获GST融合的TPR结构域蛋白，并使用与Hsp90 C末端10个氨基酸肽段偶联的受体微珠，在均相体系中检测蛋白质-蛋白质相互作用。我们应用该检测方法筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并成功鉴定出高效且具有选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。

引言

分子伴侣参与蛋白质稳态，包括蛋白质折叠、转运和降解。它们调控多种细胞过程，并与癌症和神经退行性疾病等多种疾病相关联1热休克蛋白90（Hsp90）是最重要的一类分子伴侣，其功能依赖于由ATP水解驱动的构象变化，以及通过其共伴侣蛋白介导的与客户蛋白的结合。2尽管Hsp90作为治疗靶点具有明显的潜力，但对其功能进行精细调控仍面临巨大挑战。目前已有多款靶向N端ATP结合区的Hsp90抑制剂进入临床试验阶段，但尚无任何一种获得上市批准。3由于缺乏明确的配体结合口袋4，靶向Hsp90的C端区域收效有限4近年来，小分子干扰Hsp90与共伴侣蛋白相互作用已被研究作为一种替代策略5靶向Hsp90与共伴侣蛋白之间的相互作用不会引发普遍的细胞应激反应，且提供了特异性调控多种细胞内过程的可能性。Hsp90羧基末端保守的MEEVD五肽是其与共伴侣蛋白中四肽重复（TPR）基序相互作用的关键结构。6在人类蛋白质数据库注释的736种含有TPR模体的蛋白质中，约有20种不同的蛋白质通过该肽段与Hsp90相互作用7竞争MEEVD肽结合位点的分子会破坏Hsp90与含有TPR结构域的共伴侣蛋白之间的相互作用。该肽结合位点具有相似的三级结构，但不同TPR模体结构域之间的整体同源性相对较低7，为鉴定能够特异性阻断Hsp90与特定TPR基序共伴侣蛋白之间相互作用的分子提供了机会。在这些TPR基序共伴侣蛋白中，FK506结合蛋白（FKBP）51和FKBP52是类固醇激素受体（SHR）信号通路的调控因子，参与多种类固醇激素依赖性疾病，包括癌症、应激相关疾病、代谢性疾病和阿尔茨海默病8尽管FKBP51和FKBP52具有相似性 > 序列相似性达80%，但其功能不同：FKBP52通常是SHR活性的正向调节因子，而FKBP51在大多数情况下是负向调节因子8因此，鉴定出特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的分子，为相关疾病的治疗提供了有前景的治疗潜力。

A扩增的 L发光的 P邻近性 H均一的 AAlphaScreen 检测法最初由 Ullman EF 等人于 1994 年开发。9。如今，它被广泛用于检测多种类型的生物相互作用，例如肽10蛋白质11，DNA12，RNA13，以及糖14该技术使用两种微珠（直径200 nm），一种为供体微珠，另一种为受体微珠。生物分子被固定在这些微珠上，其生物相互作用使供体与受体微珠相互靠近。在680 nm激发下，供体微珠中的光敏剂被激活，将氧气转化为单线态氧。由于单线态氧寿命较短，其扩散距离不超过200 nm。若受体微珠处于邻近位置，其含有的硫代蒽衍生物将与单线态氧反应，产生370 nm的化学发光。该能量进一步激活同一受体微珠中的荧光基团，使其发射520–620 nm的光信号。15如果生物相互作用被破坏，受体微珠与供体微珠无法接近，导致单线态氧衰变，信号产生降低。

本文介绍了一种利用该技术筛选抑制Hsp90与TPR结构域共伴侣蛋白（特别是FKBP51和FKBP52）相互作用的小分子的实验方案。将对应于Hsp90极端C末端的10个氨基酸长的肽段连接至受体微珠上，纯化的GST标签TPR结构域共伴侣蛋白则与谷胱甘肽偶联的供体微珠结合。当Hsp90来源的肽段与TPR结构域共伴侣蛋白相互作用使两种微珠靠近时，会产生放大信号（图1A）。若待测小分子能够抑制Hsp90与TPR结构域共伴侣蛋白之间的相互作用，则该放大信号会减弱（图1B）。通过定量检测可计算其IC50值。本方案可推广至其他感兴趣的分子伴侣与TPR结构域共伴侣蛋白之间的相互作用研究，在开发特异性阻断Hsp90与FKBP51或FKBP52相互作用的新型分子方面具有重要意义。

单线态氧生成示意图，显示在 680 nm 处激发并在 520-620 nm 处发射。
图 1：本检测的基本原理。（A）纯化的 GST-FKBP51 与谷胱甘肽连接的供体微珠结合。与 Hsp90 极端 C 末端对应的 10 个氨基酸长的肽段连接至受体微珠。Hsp90 来源的肽段与 FKBP51 的 TPR 结构域之间的相互作用使供体和受体微珠彼此靠近。在 680 nm 激发下，供体微珠中的光敏剂被激活，将氧气转化为单线态氧。受体微珠上的噻吨衍生物与单线态氧反应，并在 370 nm 处产生化学发光。该能量进一步激活同一受体微珠中的荧光团，使其在 520-620 nm 发射光信号。（B）当小分子抑制 Hsp90 与 FKBP51 之间的相互作用时，供体和受体微珠无法接近。此时具有短寿命的单线态氧发生衰变，不产生可检测的信号。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

注意：本方案的概述见图2。

1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化（图 2A）

  1. 质粒
    注意：从 IMAGE 联盟获取人源 FKBP51（克隆编号：5723416）和人源 FKBP52（克隆编号：7474554）的 cDNA 克隆。
    1. 使用引物（正向引物：5`GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP51 DNA，该引物包含 BamHI 和 XhoI 突出端，随后将其克隆至 pGEX6-1 载体的 BamHI / XhoI 限制性酶切位点。
    2. 使用引物（正向引物：5`-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP52 DNA，该引物包含 EcoRI 和 XhoI 突出端，随后将其克隆至 pGEX6-2 载体的 EcoRI / XhoI 限制性酶切位点。
      注意：PCR 反应体系及反应条件见表 1和表 2。
    3. 验证插入序列的正确性，并按照制造商说明书将质粒转化至化学感受态E. coli中。
  2. 蛋白表达与纯化
    1. 将 25 g LB 培养基基础成分溶于 1 L 去离子水中配制 LB 溶液，121 °C 高压灭菌 15 分钟。冷却后加入 50 µg/mL 氨苄青霉素。
    2. 挑取表达 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 的单菌落，加入 1.5 mL 离心管中的 500 µL LB 溶液中，涡旋混匀。
    3. 将步骤“1.2.2”的混合液转移至铝箔封口的锥形瓶中的 1 L LB 溶液中，37 °C 摇床过夜培养。
    4. 加入 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，继续孵育 2 小时。
    5. 以 5,000 x g 离心 15 分钟收集菌体沉淀，弃去上清液。
      注意：菌体沉淀可于 -20 °C 保存。
    6. 将菌体沉淀重悬于 40 mL PBS 中，冰上超声处理 3 次，每次 20 秒。加入 1 mM PMSF、1 mM EDTA 及蛋白酶抑制剂混合物（1 片）以防止蛋白降解。
    7. 将裂解液在 50,000 x g 离心 30 分钟以去除细胞碎片，上清液上样至 5 mL GST-trap 柱。
    8. 用 30 mL PBS 洗涤层析柱后，使用 5 mL 含 10 mM 谷胱甘肽的 PBS 缓冲液洗脱 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52。
    9. 使用 15 mL 10,000 MWCO 离心浓缩装置浓缩蛋白。为去除游离谷胱甘肽，将浓缩液通过以 0.5x PBS 平衡的 PD-10 脱盐柱，并再次使用离心过滤装置浓缩。
    10. 收集含蛋白的洗脱组分，通过 SDS-PAGE 验证蛋白，并将蛋白浓度调整至 1 mg/mL。
      注意：典型蛋白得率为 2–5 mg/L 培养液。蛋白可于 -20 °C 保存。

2. 将 Hsp90 C 端肽段偶联至受体珠（图 2B）

  1. Hsp90 肽段制备
    1. 合成十氨基酸肽 NH2-EDASRMEEVD-COOH，对应人Hsp90β同工型第714-724位氨基酸（UniProt ID: P08238），由多肽合成服务制备。
    2. 将Hsp90肽用PBS稀释至1 mg/mL浓度。
  2. 受体珠制备
    1. 将未结合的受体珠用 PBS 稀释至 1 mg/mL 浓度，并转移至 1.5 mL 离心管中。
    2. 通过离心在 16,000 x g 条件下进行洗涤 g 孵育15分钟。小心移除上清液。
  3. 结合
    1. 将珠子与肽的比例设为10:1。在含有1 mg受体珠沉淀（按上述方法制备）的1.5 mL离心管中，加入1 mL PBS（pH 7.4）和0.1 mg稀释后的肽。 1.25 µL Tween-20， 10 µL 400 mM 氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）溶液3CN) 溶于水中。
      警告：NaBH3CN 有毒；使用时应佩戴手套，并在通风橱中操作。NaBH3CN溶液应新鲜配制。
    2. 在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时 37 °C 在旋转摇床中以末端对末端的方式振荡（10-20 rpm）。
  4. 反应终止与磁珠洗涤
    1. 添加 20 µL 加入1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液以封闭未反应位点，于室温孵育1小时 37 °C.
    2. 以 16,000 x g 离心 g （或最大速度）离心15分钟 4 °C. 弃去上清液，将珠粒沉淀重悬于 1 mL Tris-HCl 溶液（100 mM，pH 8.0）中。
    3. 重复洗涤步骤三次。
    4. 最后一次离心后，用储存缓冲液（含0.01%叠氮化钠作为防腐剂的0.5 × PBS 1 mL）将磁珠重悬至浓度为1 mg/mL。将偶联的受体磁珠溶液储存于 4 °C 避光
      警告：叠氮化钠具有毒性；需在通风橱中操作并佩戴手套。

3. 探测 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 与 Hsp90 C 端肽相互作用的实验，以及小分子量化合物的抑制作用（图 2C）

  1. 与谷胱甘肽供体珠结合的 GST 标签蛋白
    1. 在 384 孔板中设置反应体系。
    2. 配制含有 10 µg/mL 谷胱甘肽供体珠的溶液，溶剂为 0.5x PBS，pH 7.4。
      注意：长期储存后珠子会沉降，使用前需涡旋混匀。
    3. 加入 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52，使其终浓度为 10 µg/mL。
    4. 在 25 °C 避光孵育 10 分钟。
      注意：此步骤中，GST 标签蛋白将与珠子上连接的谷胱甘肽结合。每个孔使用 22.5 µL 该混合液。结合伴侣的浓度需通过实验确定。对 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 进行滴定，选择信号最佳的浓度。
  2. 化合物添加
    1. 在 DMSO 中对测试化合物进行系列稀释。
      注意：通常使用的浓度为 10、30、100、300、1,000 和 3,000 µM。
    2. 向每孔板的孔角加入 0.25 µL DMSO（阴性对照）或 Hsp90 C 端肽（阳性对照，30 µM）或 DMSO 中的化合物。每个化合物浓度设三个重复。
    3. 向每个孔中加入 22.5 µL 含有谷胱甘肽供体珠与 GST 标签蛋白的混合溶液。
    4. 用手轻轻但充分振荡混匀，25 °C 避光孵育 15 分钟。
      注意：在此期间，化合物将与 Hsp90 C 端肽结合位点处的 TPR 结构域相互作用。
  3. 受体珠添加
    1. 用 0.5x PBS 将连接有 Hsp90 C 端肽的受体珠稀释至 100 µg/mL。
    2. 向每个孔中加入 2.25 µL 稀释后的受体珠。
    3. 轻轻但充分混匀，25 °C 避光孵育 15 分钟。
      注意：此步骤中，供体珠和受体珠通过蛋白-肽相互作用靠近。反应体系终体积为 25 µL，因此化合物的终浓度范围为 0.1 至 30 µM。
  4. 板读取
    注意：使用设定为相应模式的酶标仪读取板。
    1. 打开仪器并启动软件
    2. 选择相应的检测程序。
    3. 点击 编辑板图，并选择板中用于检测的孔位。
    4. 点击 下一步 继续，然后点击 运行 所选程序。
    5. 检测完成后，点击 显示结果 查看结果。
    6. 导出数据。

4. 数据分析

  1. Z'因子和信噪比（S/B比值）
    1. 使用以下公式计算该检测的 Z' 因子和 S/B 比值：
      Z'=1-(3σ阳性+3σ阴性)/│µ阳性-µ阴性│16
      S/B=µ阴性/µ阳性
      其中，σ 和 µ repr呈现阳性对照（Hsp90 C末端肽）的标准差和均值 30 µM）和阴性（DMSO）对照。Z' 因子 > 0.5 将确保该检测方法具有足够的稳健性以用于筛选。为监测检测的灵敏度，还计算了S/B比值。
  2. 剂量-反应曲线和IC 50
    注意：使用软件通过非线性回归分析拟合Hsp90-共伴侣蛋白PPI抑制剂的数据。
    1. 在 XY 数据表中创建 欢迎 对话框并选择 X 数字，以及 Y 输入 3 （若设三个重复） 并列列中的重复值.
    2. 将样本的信号数据归一化至阴性对照组。将浓度值导入 X 列，信号值导入 Y 列。
    3. 点击 分析 并选择 转化浓度（X） 在……下方 转换 | 归一化. 选择 转换为对数.
      注意：这将把浓度转换为对数尺度。如果您的起始浓度为零，请将其设为一个极小的、可视为零的数值（例如 0.1 nM），以避免丢失这些数据，因为零的对数无定义。
    4. 点击 分析 并选择 非线性回归（曲线拟合） 在……下方 XY 分析，打开 剂量-反应抑制 并选择 对数（抑制剂）与反应关系——可变斜率.
    5. 点击 好的 以查看 结果 （含IC50 值）和 图表.

GST-FKBP 表达纯化过程及 Hsp90 耦合；珠结合实验相互作用示意图。
图 2：本实验方案的示意图。 （A）GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化。（B）将 Hsp90 C 端肽段耦合至受体珠上。（C）检测 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 与 Hsp90 C 端肽段之间相互作用的实验。小分子化合物的抑制作用。图片由 BioRender.com 制作 请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

在我们的检测中，Z' 因子和 S/B 比值分别为 0.82 和 13.35（图3A)，表明我们的检测方法稳定可靠，适用于高通量筛选。随后，我们利用该方法对小分子量化合物进行了筛选。 图3B 呈现小分子（D10）对分子伴侣-共伴侣相互作用的剂量依赖性抑制。D10 的剂量-反应曲线通过非线性回归分析生成，并据此计算 IC50 计算得出。D10 对 Hsp90 - GST-FKBP51 和 Hsp90 - GST-FKBP52 蛋白相互作用均表现出剂量依赖性抑制，但其 IC50 是不同的：其IC50 Hsp90与GST-FKBP51相互作用的IC50为65 nM，而Hsp90与GST-FKBP52相互作用在最高化合物浓度下也未达到完全抑制100 µM），其IC50 估计为 > 30 µM这些结果表明，利用小分子选择性抑制Hsp90-HKBP51或Hsp90-FKBP52蛋白-蛋白相互作用是可行的（FKBP51和FKBP52的TPR结...

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讨论

本文介绍了一种利用该检测方法筛选抑制Hsp90与含TPR基序共伴侣蛋白（特别是FKBP51和FKBP52）相互作用的小分子的实验方案。其具有较高的Z'分数（>0.8）表明该方法在高通量模式下具有良好的稳健性和可靠性。结果可在一小时内获得，且仅需少量磁珠、蛋白质和化合物。此外，本方案可轻松拓展至任何感兴趣的Hsp90/Hsp70与含TPR模体的共伴侣蛋白之间的相互作用研究。已有多种Hsp90的含TPR模体共伴侣蛋白被发现与多种人类疾病相关，包括阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、癌症等。本文所述方案提供了一种 体外 一种用于高通量筛选抑制具有重要医学意义的分子伴侣-共伴侣相互作用的小分子的稳定且经济的检测方法。

此外，在评估靶向 TPR 结构域并抑制其与 Hsp90 相互作用的药物时，不仅需要考察其对靶标的亲和力，还需评估其对其他含 TPR 模体蛋白的选择性。人类基因组编码了> 20 种能够与 Hsp90 C 末端肽段相互作用的 TPR 模体蛋白。本实验利用谷胱甘肽磁珠和 GST 标签蛋白，可评估药物对多个结合型 TPR 靶点的影响。本实验室拥有包含 20 种...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由瑞典研究理事会（2018-02843）、瑞典脑基金会（Fo 2019-0140）、卡罗林斯卡 Institutet 老年疾病基金会、Gunvor 和 Josef Anérs 基金会、Magnus Bergvalls 基金会、Gun 和 Bertil Stohnes 基金会、Tore Nilssons 医学研究基金会、Margaretha af Ugglas 基金会以及老雇员基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
384孔板Perkin Elmer6008350检测体积 25 ml
Amicon 10,000 MWCO 离心浓缩管MilliporeUFC901008浓缩蛋白
氨苄青霉素SigmaA0166抗生素
细菌摇床 Unimax 1010Heidolph培养细菌
人 FKBP51 的 cDNA 克隆Source BioScience克隆编号：5723416pCMV-SPORT6 载体
人 FKBP52 的 cDNA 克隆Source BioScience克隆编号：7474554pCMV-SPORT6 载体
化学感受态 E. coliInvitrogenC602003One Shot BL21 Star (DE3)
数据分析软件GraphPad Prism9.0.0分析数据并制图
数据分析软件Excel分析数据
DMSOSupelco1.02952.1000稀释化合物
DPBSGibco14190-144配制溶液
EDTACalbiochem344504超声过程中防止蛋白降解
谷胱甘肽SigmaG-4251洗脱 GST 标签蛋白
谷胱甘肽供体微珠Perkin Elmer6765300供体微珠
GST-trap 柱Cytiva (GE Healthcare)17528201纯化 GST 标签蛋白
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Thermo Fisher ScientificR0392诱导蛋白表达
LB 肉汤（Miller）SigmaL3522微生物培养基
PCR 仪BIO-RADS1000 Thermal Cycler扩增/PCR
PD-10 柱Cytiva (GE Healthcare)17085101溶液置换
pGEX-6P-1 载体Cytiva (GE Healthcare)28954648质粒
pGEX-6P-2 载体Cytiva (GE Healthcare)28954650质粒
酶标仪Perkin ElmerEnSpire 2300 Multilabel Reader读取 Alpha 检测板
酶标仪软件Perkin ElmerEnSpire Manager酶标仪软件
酶标仪软件程序Perkin ElmerAlpha 384-well Low volume使用该程序读取检测板
PMSFSigmaP7626超声过程中防止蛋白降解
蛋白酶抑制剂混合物SigmaS8830超声过程中防止蛋白降解
叠氮化钠SigmaS2002用作防腐剂
氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)Sigma156159活化基质用于偶联
对应人 Hsp90 β 亚型第 714-724 位氨基酸的十肽 NH2-EDASRMEEVD-COOHPeptide 2.0 inc合成 Hsp90 C 末端肽
试管旋转仪LABINCO实现翻转式振荡
Tris-HClSigma10708976001封闭受体微珠上的未反应位点
Tween-20SigmaP1379防止微珠聚集
超速离心机 Avanti J-20 XPBeckman Coulter离心收集细菌细胞沉淀
超声细胞破碎仪Microson超声破碎细胞以释放蛋白
未偶联受体微珠Perkin Elmer6762003受体微珠
XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转印模块InvitrogenEI0002SDS-PAGE

参考文献

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Hsp90 FKBP51 FKBP52 TPR IC50

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