我们开发了一种可重复的方法，以高细胞分辨率可视化非水解性荧光三磷酸腺苷（ATP）（一种ATP类似物）的内化过程。我们使用独立的实验验证了该方法 体外 和 体内 人肿瘤细胞系和移植人肿瘤组织的免疫缺陷小鼠的检测。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
通过大胞饮作用介导的ATP内化在人肿瘤细胞及肿瘤异种移植小鼠中的荧光显微镜检测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
三磷酸腺苷（ATP），包括细胞外ATP（eATP），已被证明在肿瘤发生发展的多个方面发挥重要作用，例如药物耐药性、上皮-间质转化（EMT）以及转移。肿瘤内eATP的浓度比正常组织高出103至104倍。eATP不仅作为信使分子激活嘌呤能信号通路以诱导EMT，还可通过癌细胞上调的大胞饮作用（一种特殊的内吞作用）被摄入细胞内，从而执行多种生物学功能。这些功能包括为依赖ATP的生化反应提供能量、在信号转导过程中提供磷酸基团，以及作为转录共因子促进或加速基因表达。ATP易于获取，其在癌症及其他领域的研究无疑将持续增长。然而，eATP的研究仍处于早期阶段，在全面揭示eATP及其被内化后的细胞内ATP所发挥的重要而多样的生物学活性之前，仍有许多未解的问题有待解答。
这些作者的实验室在早期细胞外ATP（eATP）研究中的贡献包括：利用非水解型荧光标记ATP结合高分子量与低分子量荧光葡聚糖（分别作为巨胞饮和内吞作用的示踪剂），并联合多种内吞抑制剂，通过显微成像技术对eATP的内化过程进行监测与表征。该成像方法被应用于肿瘤细胞系以及移植了人源肿瘤的免疫缺陷小鼠模型，以研究eATP的内化行为。 体外 和 体内本文描述了这些 体外 以及在 体内 方案，重点在于调整和优化检测条件，以确保在不同体系中成功开展由大胞饮作用/内吞作用介导的eATP内化检测。
引言
肿瘤内细胞外（即ie）营养物质的 opportune 摄取最近被认定为癌症代谢的一个关键特征1。其中一种重要的营养物质是ATP，因为肿瘤内细胞外ATP（ieATP）的浓度比正常组织高出103至104倍，范围可达数百µM至低mM水平2,3,4,5。作为一种关键的能量和信号分子，ATP在癌细胞和正常细胞的细胞代谢中均发挥核心作用6,7,8。细胞外ATP不仅参与癌细胞的生长，还可促进药物耐药性9。最近还发现了ATP此前未被认知的功能，例如其水溶性促进活性（hydrotropic activity），提示ATP可能参与阿尔茨海默病等疾病的发生10。事实上，我们对ATP在癌细胞、正常细胞及其他病变细胞中的功能理解仍远未完善。然而，由于ATP在细胞内的不稳定性及其高周转率，从技术上监测ATP跨细胞膜进入细胞内的动态过程仍....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文报告的所有操作均按照俄亥俄大学动物照护与使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院（NIH）的规定进行。
1. 选择不可水解的荧光ATP（NHF-ATP）和葡聚糖
- 根据所需的发射波长（例如，配备合适滤光片的成像系统）以及拟研究的特定胞吞过程，选择荧光染料标记的 NHF-ATP（图 1A）和胞吞示踪剂，即高分子量与低分子量荧光葡聚糖（TMR-HMWFD 和 TMR-LMWFD）（图 1B）。
2. ATP定位研究， 体外 (图2)
图2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
体外研究
通过NHF-ATP与HMWFD或LMWFD的共定位，证明了NHF-ATP的细胞内吞作用（图4）。该实验的成功主要依赖于使用适当浓度的NHF-ATP和葡聚糖，并确定合适的葡聚糖类型（聚赖氨酸型与中性型）。例如，在研究巨胞饮作用时，选择HMWFD，因为它仅被巨胞饮小体摄取13,14,15,16。相反，若研究网格蛋白和/或小窝蛋白介导的内吞作用，则应选择LMWFD，因为这些内吞相关内体体积较小，只能摄取LMWFD14,15,16。荧光葡聚糖有两.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
开发了一种用于分析非水解性ATP细胞内化作用的空间、时间和定量特征的方法。该方法可广泛适用于多种生物系统，包括各类肿瘤发生模型，并提供了相应的技术指导和代表性数据。为获得可解读的数据，在 体内 ATP内化研究（方案第4部分）中，从瘤内注射葡聚糖到冷冻包埋所经历的实验时间必须严格控制。在荧光显微镜成像前，对肿瘤切片后的组织切片进行固定是必要步骤。这两个关键步骤共同确保肿瘤细胞在成像过程中保留已内化的ATP。在分析ATP内化时另一个重要考虑因素是异种移植瘤的异质性。由于不同癌细胞类型的成瘤过程存在差异，可能需要针对该方法的某些环节进行优化，以确定适用于不同癌细胞的理想实验条件。为全面评估肿瘤中ATP的大胞饮作用，必须对整个肿瘤的不同区域进行组织切片成像，因为不同区域的驻留细胞及其内化胞外ATP（eATP）的能力可能存在差异。事实上，该方法在未来的研究中可能揭示不同癌细胞/肿瘤细胞间eATP内化机制的差异。
需要注意的是，NHF-ATP仅可用于取代非结合型ATP或放射性ATP进行内化研究，不能用于其他研究（如代谢研究），因为一旦NHF-ATP从细胞内的巨胞饮体和/或内体.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
冰冻切片在俄亥俄大学组织病理学核心实验室现场完成。本工作部分由启动资金（俄亥俄大学文理学院）资助。 & 科学) 致 C Nielsen；NIH 资助 R15 CA242177-01 和 RSAC 奖项致 X Chen。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A549 细胞，人肺上皮细胞，癌 | 美国国家癌症研究所 | n/a | 成本较低的来源 |
| 丙酮 | 费希尔科技公司 | S25904 | |
| 铝箔，雷诺兹 | 固安捷公司 | 6CHG6 | |
| 水性封片剂，ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | 赛默飞世尔科技 | P36930 | |
| ATP 类似物 | 耶拿生物科学公司 | NK-101 | |
| 高压灭菌器，灭菌锅 | 固安捷公司 | 33ZZ40 | |
| 刀片，恒冷切片机用，高剖面 | C. L. Sturkey 公司 | DT554550 | |
| 游标卡尺 | 固安捷公司 | 4KU77 | |
| 细胞培养基，Ham's F12 营养混合物，无血清 | 密理博-西格玛公司 | 51651C-1000ML | |
| 带摆动转子的冷冻离心机 | 艾本德公司 | 5810R | |
| 氯仿 | Acros 有机化学公司 | 423555000 | |
| 锥形管，15 mL | VWR 公司 | 21008-216 | |
| 锥形管，50 mL | VWR 公司 | 21008-242 | |
| 盖玻片，玻璃，12 mm | 康宁公司 | 2975-245 | |
| 恒冷切片机，Leica CM1950 | 徕卡生物系统公司 | CM1950 | |
| 精密擦拭纸，Kim Wipes | 金佰利公司 | 34155 | |
| 葡聚糖，可被赖氨酸固定的，高分子量（HMW） | 英潍捷基公司 | D1818 | 分子量 = 70,000，四甲基罗丹明标记 |
| 葡聚糖，中性，高分子量（HMW） | 英潍捷基公司 | D1819 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），无血清 | 费希尔科技公司 | 11885076 | |
| 干冰 | 本地配送 | 定制订单 | |
| 落射荧光成像系统，Nikon NiU 及 Nikon NIS Elements 采集软件 | 尼康公司 | 定制订单 | |
| 乙醇 | 费希尔科技公司 | BP2818-4 | |
| 胎牛血清（FBS） | 赛默飞世尔科技 | 16000044 | |
| 镊子，Dumont #7，弯头 | 精细科学工具公司 | 11274-20 | |
| 镊子，Dumont #5，直头 | 精细科学工具公司 | 11254-20 | |
| 手套（小号、中号、大号） | 麦克罗弗莱克斯公司 | N191, N192, N193 | |
| 手套，MAPA Temp-Ice 700 保温手套（用于操作干冰） | 费希尔科技公司 | 19-046-563 | |
| 血细胞计数板 | 戴杰公司 | EF16034F EA | |
| 细胞培养箱 | 艾本德公司 | Galaxy 170 S | |
| 标签胶带 | 费希尔科技公司 | 159015R | |
| 记号笔，Sharpie（超细） | 史泰博公司 | 642736 | |
| 小鼠，免疫缺陷型（Nu/J） | 杰克逊实验室 | 2019 | |
| 微量离心机，accuSpin Micro17 | 费希尔科技公司 | 13-100-675 | |
| 微量离心管，Eppendorf 管（1.5 mL） | Axygen 公司 | MCT-150-C | |
| 显微镜载玻片盒 | 费希尔科技公司 | 50-751-4983 | |
| 针头，27 号 | 贝克顿-迪金森公司 | 752 0071 | |
| 画笔 | 固安捷公司 | 39AL12 | |
| 纸巾 | 史泰博公司 | 33550 | |
| 多聚甲醛 | Acros 有机化学公司 | 416785000 | |
| 青霉素/链霉素 | 吉布科公司 | 15140122 | |
| 穿孔勺，直径 15 mm，长度 135 mm | Roboz 外科器械公司 | RS-6162 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 费希尔科技公司 | BP3991 | |
| 移液器吸头（10 μL） | 费希尔科技公司 | 02-707-438 | |
| 移液器吸头（200 μL） | 费希尔科技公司 | 02-707-411 | |
| 移液器吸头（1000 μL） | 费希尔科技公司 | 02-707-403 | |
| 移液管，血清学用（10 mL） | VWR 公司 | 89130-910 | |
| 移液器，Gilson P2 | 戴杰公司 | EF9930A | |
| 移液器起始套装，Gilson（2-10 μL，20-200 μL，200-1000 μL） | 戴杰公司 | EF9931A | |
| 平台式摇床 — 旋转式，台式 | 科尔-帕尔默公司 | EW-51710-23 | |
| 带正电荷的显微镜载玻片，Superfrost | 费希尔科技公司 | 12-550-15 | |
| 手术刀，10 号，Surgical Design 公司 | 费希尔科技公司 | 22-079-707 | |
| 手术剪，锐利，弯头 | 精细科学工具公司 | 14005-12 | |
| 图像分析软件，Nikon Elements | 尼康公司 | 定制订单 | |
| 图像分析软件，ImageJ（FIJI） | 美国国立卫生研究院 | n/a | 在线下载（免费） |
| 样本盘，30 mm（卡盘架），恒冷切片机配件 | 徕卡生物系统公司 | 14047740044 | |
| 染色缸，245 mm BioAssay 培养皿 | 康宁公司 | 431111 | |
| 注射器，1 cc | 贝克顿-迪金森公司 | 309623 | |
| 胶带，实验室用，19 mm 宽 | 费希尔科技公司 | 15-901-5R | |
| 计时器 | 费希尔科技公司 | 14-649-17 | |
| 组织培养皿，直径 100 × 15 mm | 费希尔科技公司 | 08-757-100D | |
| 组织培养瓶，225 cm2 | 赛默飞世尔科技 | 159933 | |
| 组织培养板，24 孔 | 贝克顿-迪金森公司 | 353226 | |
| 组织包埋模具，不锈钢 | Tissue Tek 公司 | 4161 | |
| 组织冷冻介质，最佳切割温度（OCT） | 费希尔科技公司 | 4585 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），0.25% | 吉布科公司 | 25200072 | |
| 水浴锅，Precision GP 2S | 赛默飞世尔科技 | TSGP2S |
参考文献
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
- Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
