Method Article

荧光显微镜用于人肿瘤细胞和肿瘤异种移植小鼠中巨细胞增多介导的ATP内化

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种可重复的方法，以可视化具有高细胞分辨率的不可水解荧光三磷酸腺苷（ATP）的内化，ATP替代物。我们使用独立的 体外 和 体内 测定验证了我们的方法 - 人肿瘤细胞系和用人类肿瘤组织异种移植的免疫缺陷小鼠。

Abstract

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三磷酸腺苷（ATP），包括细胞外ATP（eATP），已被证明在肿瘤发生的各个方面起重要作用，例如耐药性，上皮间充质转变（EMT）和转移。肿瘤内eATP的浓度比正常组织高103 至104 倍。虽然eATP作为激活嘌呤能信号传导的信使进行EMT诱导，但它也通过上调巨噬细胞增多症（一种特定类型的内吞作用）被癌细胞内化，以执行各种生物学功能。这些功能包括为需要ATP的生化反应提供能量，在信号转导期间捐赠磷酸基团，以及促进或加速作为转录辅因子的基因表达。ATP唾手可得，其在癌症等领域的研究无疑将会增加。然而，eATP研究仍处于早期阶段，在eATP和内化细胞内ATP所发挥的重要和多功能活动可以完全解开之前，尚未解决的问题仍未得到解答。

这些作者的实验室对这些早期eATP研究的贡献包括不可水解荧光ATP的显微成像，以及高分子量和低分子量荧光葡聚糖，其用作巨噬细胞增多和内吞作用示踪剂，以及各种内吞作用抑制剂，以监测和表征eATP内化过程。该成像方式应用于肿瘤细胞系和免疫缺陷小鼠，异种移植人癌症肿瘤， 以研究eATP在体外 和 体内的内化。本文描述了这些 体外 和 体内 方案，重点是修改和微调测定条件，以便可以在不同的系统中成功进行巨噬细胞增生/内吞作用介导的eATP内化测定。

Introduction

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肿瘤内细胞外（即）营养素的机会性吸收最近被命名为癌症代谢的关键标志1。这些重要的营养素之一是ATP，因为IEATP的浓度比正常组织中发现的浓度高103和104倍，在几百μM到低mM 2，3，4，5的范围内。作为一种关键的能量和信号分子，ATP在癌细胞和健康细胞的细胞代谢中起着核心作用6，7，8。细胞外ATP不仅参与癌细胞生长，而且还促进耐药性9。最近已经确定了以前未被识别的ATP功能，例如亲水活性，因此涉及ATP参与阿尔茨海默氏症等疾病10。事实上，我们对ATP及其在癌细胞，健康细胞和其他患病细胞中的功能的理解似乎远未完成。然而，由于ATP在细胞中的不稳定性和高周转率，监测ATP穿过细胞膜并进入细胞的运动在技术上具有挑战性。

为了解决这个问题并满足该研究....

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Protocol

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本文报告的所有程序均按照俄亥俄大学的IACUC和NIH进行。

1. 选择非水解荧光ATP（NHF-ATP）和葡聚糖

  1. 根据优选的发射波长（例如，配备适当滤光片的成像系统）和要研究的特定内吞过程，选择荧光团偶联的NHF-ATP（图1A）和内吞作用示踪剂，高分子量和低分子量荧光葡聚糖（TMR-HMWFD和TMR-LMWFD）（图1B）。

2. ATP定位研究，体外（图2）

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图2:检查ATP内化的 体外 程序。 使用荧光显微镜可视化培养癌细胞中细胞外ATP内化的方案的示意图。

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Results

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体外 研究
NHF-ATP的细胞内化通过NHF-ATP与HMWFD或LMWFD的共定位来证明（图4）。该程序的成功主要取决于使用适当浓度的NHF-ATP和葡聚糖，以及确定右旋糖酐的适当类型（聚赖氨酸与中性）。例如，为了研究宏卵酸细胞增多症，选择HMWFD，因为它仅由宏卵子体13，14，15，16内化。或者，如果研究克拉氏素和/或疣状体介导的内吞酶，则选择LMWFD，因为这些内吞作用相关内体的较小尺寸仅允许它们吞噬LMWFD14，15，16。荧光葡聚糖.......

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Discussion

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开发了一种用于不可水解ATP的细胞内化的空间，时间和定量分析方法。该方法广泛适用于各种生物系统，包括各种致瘤模型，我们为其提供技术指导和代表性数据。为了 在体内 ATP内化研究期间获得可解释的数据（方案第4节），限制从肿瘤内葡聚糖注射到冷冻包埋的实验时间至关重要。固定组织载玻片 - 肿瘤后切片 - 是荧光显微镜成像之前的必要步骤。这两个关键步骤共同确保肿瘤细胞在成像过程中保留内化的ATP。在ATP内化分析过程中的另一个重要考虑因素是考虑异种移植肿瘤的异质性。由于肿瘤发生在癌细胞类型之间的进展不同，因此可能需要对该方法的各个方面进行故障排除，以确定不同癌细胞的理想实验条件。为了确保对肿瘤中ATP的巨噬细胞增多症进行全面评估，对整个肿瘤中的组织切片进行成像至关重要，因为在驻留细胞及其内化eATP的能力方面可能存在区域差异。事实上，这种方法可能会在未来的研究中揭示癌症/肿瘤细胞之间eATP内化的不同机制。

重要的是要注意，NHF-ATP只能取代未结合的ATP或放射性ATP进行内化研究。它不能用于其他研究，如代谢研究，因为NHF-ATP一旦从细胞内的巨卵子体和/或内体释放.......

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Disclosures

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作者声明没有竞争利益。

Acknowledgements

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冷冻切除术在俄亥俄大学组织病理学核心现场进行。这项工作部分得到了创业基金（俄亥俄大学艺术与科学学院）对C Nielsen的支持;NIH授予R15 CA242177-01和RSAC奖给X Chen。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549 细胞，人肺上皮细胞，癌美国国家癌症研究所n/a较便宜的来源
丙酮Fisher ScientificS25904
铝箔，ReynoldsGrainger6CHG6
水性封固剂，ProLong Gold 抗淬灭试剂ThermoFisherP36930
ATP 类似物Jena BiosciencesNK-101
高压灭菌器，灭菌器Grainger33ZZ40
刀片，低温恒温器，高外形C. L. Sturkey， Inc.
卡尺、游标Grainger4KU77
细胞培养基、Ham's 营养混合物 F12、无血清Millipore Sigma51651C-1000ML
离心机，带摆动吊篮转子制冷Eppendorf5810R
氯仿Acros 有机物423555000
锥形管，15 mLVWR21008-216
锥形管，50 mLVWR21008-242
盖玻片，玻璃，12 mm康宁2975-245
低温恒温器，Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
精细任务湿巾，Kim WipesKimberly-Clark34155
右旋糖酐，赖氨酸可固定，高分子量 （HMW）InvitrogenD1818MW = 70,000，四甲基罗丹明
右旋糖酐，中性，高分子量 （HMW）InvitrogenD1819
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），无血清Fisher Scientific11885076
干冰本地交付定制订单
落射荧光成像系统，Nikon NiU 和 Nikon NIS Elements 采集软件Nikon定制订单
乙醇Fisher ScientificBP2818-4
胎牛血清 （FBS）ThermoFisher16000044
镊子，Dumont #7，弯曲的精细科学工具11274-20
镊子，Dumont #5，直线精细科学工具11254-20
手套（小、中、大）MicroflexN191、N192、N193
手套， MAPA Temp-Ice 700 Thermal （用于处理干冰）Fisher Scientific19-046-563
血球计数器DaiggerEF16034F EA
培养箱， 细胞培养EppendorfGalaxy 170 S
贴标胶带Fisher Scientific159015R
记号笔， 记号笔（超细）订书钉
小鼠，免疫缺陷 （Nu/J）Jackson Laboratory2019
微量离心机，accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
微量离心管，Eppendorf 管 （1.5 mL）AxygenMCT-150-C
显微镜载玻片盒Fisher Scientific50-751-4983
针头，27 号Becton-Dickinson752 0071
画笔Grainger39AL12
纸巾订书钉33550
多聚甲醛Acros Organics416785000
青霉素/链霉素Gibco15140122
穿孔勺，直径 15 毫米，长度 135 毫米Roboz 手术器械公司RS-6162
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Fisher ScientificBP3991
移液器吸头 （10 &μ;L）Fisher Scientific02-707-438
移液器吸头 （200 μL）Fisher Scientific02-707-411
移液器吸头 （1000 μL）Fisher Scientific02-707-403
移液管，血清学 （10 mL）VWR89130-910
移液器，Gilson P2DaiggerEF9930A
移液器入门套件，Gilson （2-10 μL， 20-200 &μ;L， 200-1000 &μ;L）DaiggerEF9931A
平台摇床 - 轨道式，台式Cole-ParmerEW-51710-23
带正电荷的显微镜载玻片，SuperfrostFisher Scientific12-550-15
手术刀，尺寸 10，Surgical Design， Inc.Fisher Scientific22-079-707
外科剪刀 - 锋利、弯曲精细科学工具14005-12
图像分析软件，尼康元件尼康定制订购
图像分析软件，ImageJ （斐济）美国国立卫生研究院n/a在线下载（免费）
标本盘 30 毫米（卡盘支架），低温恒温器附件Leica Biosystems14047740044
染色盘，245 mm BioAssay 培养皿康宁431111
注射器，1 ccBecton-Dickinson309623
胶带，实验室，19 mm 宽Fisher Scientific15-901-5R
计时器Fisher Scientific14-649-17
组织培养皿，直径100 x 15 mmFisher Scientific08-757-100D
组织培养瓶，225 cm2ThermoFisher159933
组织培养板，24 孔Becton-Dickinson353226
组织包埋模具，不锈钢Tissue Tek4161
组织冷冻培养基，最佳切割温度 （OCT）Fisher Scientific4585
胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），0.25%Gibco25200072
水浴，Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S
DT554550642736

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....

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