通过大胞饮作用介导的ATP内化在人肿瘤细胞及肿瘤异种移植小鼠中的荧光显微镜检测

摘要

我们开发了一种可重复的方法，以高细胞分辨率可视化非水解性荧光三磷酸腺苷（ATP）（一种ATP类似物）的内化过程。我们使用独立的实验验证了该方法 体外 和 体内 人肿瘤细胞系和移植人肿瘤组织的免疫缺陷小鼠的检测。

摘要

三磷酸腺苷（ATP），包括细胞外ATP（eATP），已被证明在肿瘤发生发展的多个方面发挥重要作用，例如药物耐药性、上皮-间质转化（EMT）以及转移。肿瘤内eATP的浓度比正常组织高出10³至10⁴倍。eATP不仅作为信使分子激活嘌呤能信号通路以诱导EMT，还可通过癌细胞上调的大胞饮作用（一种特殊的内吞作用）被摄入细胞内，从而执行多种生物学功能。这些功能包括为依赖ATP的生化反应提供能量、在信号转导过程中提供磷酸基团，以及作为转录共因子促进或加速基因表达。ATP易于获取，其在癌症及其他领域的研究无疑将持续增长。然而，eATP的研究仍处于早期阶段，在全面揭示eATP及其被内化后的细胞内ATP所发挥的重要而多样的生物学活性之前，仍有许多未解的问题有待解答。

这些作者的实验室在早期细胞外ATP（eATP）研究中的贡献包括：利用非水解型荧光标记ATP结合高分子量与低分子量荧光葡聚糖（分别作为巨胞饮和内吞作用的示踪剂），并联合多种内吞抑制剂，通过显微成像技术对eATP的内化过程进行监测与表征。该成像方法被应用于肿瘤细胞系以及移植了人源肿瘤的免疫缺陷小鼠模型，以研究eATP的内化行为。 体外 和 体内本文描述了这些 体外 以及在 体内 方案，重点在于调整和优化检测条件，以确保在不同体系中成功开展由大胞饮作用/内吞作用介导的eATP内化检测。

引言

肿瘤内细胞外（即ie）营养物质的 opportunistically 摄取最近被认定为癌症代谢的一个关键特征¹。其中一种重要的营养物质是ATP，因为肿瘤内细胞外ATP（ieATP）的浓度比正常组织高出10³至10⁴倍，浓度范围可达数百µM至低mM水平^2,3,4,5。作为一种关键的能量和信号分子，ATP在癌细胞和正常细胞的细胞代谢中均发挥核心作用^6,7,8。细胞外ATP不仅参与促进癌细胞生长，还可增强药物耐药性⁹。最近还发现了ATP此前未被认知的功能，例如其水溶性促进活性（hydrotropic activity），提示ATP可能参与阿尔茨海默病等疾病的发生发展¹⁰。事实上，目前我们对ATP在癌细胞、正常细胞及其他病变细胞中的功能理解仍远未完善。然而，由于ATP在细胞内的不稳定性及其高周转率，从技术上监测ATP跨细胞膜进入细胞内的动态过程仍具有较大挑战性。

为了解决这一问题并填补该研究领域的空白，已开发出一种使用不可水解的荧光标记ATP（NHF-ATP）的方法（图1被用作替代物以可视化ATP的内化过程，并观察内化ATP的细胞内空间定位 体外 和 体内^11,12NHF-ATP 已被证明可用于替代内源性 ATP，以研究 ATP 在动物细胞膜上的转运，该研究已在癌细胞系以及移植于免疫缺陷小鼠体内的人类肿瘤组织中开展。^11,12此外，向细胞施用巨胞饮抑制剂可阻断细胞外ATP的内化，表明细胞外ATP的细胞内摄取涉及巨胞饮机制。^9,11,12该方案允许针对细胞特异性蛋白进行免疫共标记，从而确定哪种细胞类型内化了NHF-ATP。使用 体内 肿瘤异种移植和高分辨率显微镜技术可实现NHF-ATP在组织样本中的空间可视化，甚至可在单个细胞内进行观察。这些方法还支持定量分析，例如细胞摄取百分比、巨胞饮囊泡数量以及内化动力学。本文详细描述了NHF-ATP单独或与内吞示踪荧光葡聚糖联用时的操作方法^13,14,15,16可用于不同的实验条件下，研究ATP进入细胞后的内化过程及其在细胞内的定位。

图 1：不可水解荧光 ATP 与四甲基罗丹明标记的高分子量荧光葡聚糖的结构。（A）NHF-ATP 的结构。（B）HMWFD 的示意图。缩写：ATP = 腺苷三磷酸；NHF-ATP = 不可水解荧光 ATP；TMR = 四甲基罗丹明；HMWFD = 高分子量荧光葡聚糖。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本文报告的所有操作均按照俄亥俄大学动物护理和使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院（NIH）的规定进行。

1. 选择非水解性荧光ATP（NHF-ATP）和葡聚糖

1. 根据所需的发射波长（例如，配备适当滤光片的成像系统）以及拟研究的特定内吞过程，选择荧光染料标记的 NHF-ATP（图 1A）和内吞示踪剂，即高分子量和低分子量荧光葡聚糖（TMR-HMWFD 和 TMR-LMWFD）（图 1B）。

2. ATP 定位研究， 体外 (图2)

图2：检测ATP内化的体外实验流程。 该示意图展示了利用荧光显微镜观察培养的癌细胞中胞外ATP内化过程的实验方案。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 细胞培养与细胞制备
   注意：在组织培养罩内无菌条件下进行细胞培养。
   1. 在37 °C水浴中预热含10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和1% (v/v) 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM/FBS）、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）以及0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。
   2. 将人源癌细胞接种于100 mm组织培养皿中的DMEM/FBS培养基中，在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养并维持细胞生长。
   3. 当细胞达到汇合状态时，首先吸除培养基，然后用5 mL无菌PBS冲洗培养皿，吸除PBS后加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C、5% CO₂环境中孵育5分钟以进行消化。
   4. 取出培养皿，加入6 mL DMEM/FBS以终止胰蛋白酶消化作用。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在800 × g条件下离心5分钟以收集细胞沉淀。
   5. 离心后吸除上清液，用10 mL DMEM/FBS通过移液器吹打重悬细胞沉淀。
   6. 使用血细胞计数板测定细胞密度和活率，并用DMEM/FBS将细胞悬液稀释至约7.5 × 10⁴ 个细胞/mL。
2. 盖玻片准备与细胞接种
   1. 用70%乙醇清洗12 mm盖玻片，并用精细擦拭纸小心擦干。通过高压灭菌法对盖玻片及一对镊子进行灭菌处理。
   2. 在组织培养罩内，使用镊子将一片盖玻片放入24孔板的每一孔中。
      ​注意：后续实验中，带有细胞的盖玻片将直接封片于显微镜载玻片上用于成像。
   3. 向含有灭菌盖玻片的24孔板中每孔加入300 µL细胞悬液（含DMEM/FBS），接种密度约为每孔2.5 × 10⁴ 个细胞，在37 °C、5% CO₂条件下无菌孵育。
3. 细胞饥饿处理
   1. 接种24小时后，吸除各孔中的DMEM/FBS培养基，立即向每孔加入300 µL预热的无血清DMEM，使细胞处于无血清环境15–18小时，以诱导细胞摄取胞外营养物质。
      注意：15–18小时的饥饿处理是关键实验参数。
4. NHF-ATP与HMWFD/LMWFD溶液的配制
   1. 使用分析天平在1.5 mL微量离心管中称取高分子量（70 kDa）荧光TMR-葡聚糖（TMR-HMWFD，1 mg/mL）——用于可视化巨胞饮体的示踪剂，或NHF-ATP（10 µmol/L），溶于无血清DMEM中。将离心管避光置于37 °C水浴中15分钟。
   2. 在室温下以12,000 × g离心5分钟。小心转移上清液至新的1.5 mL微量离心管中，保留任何沉淀或不溶物，以去除未溶解的晶体。
   3. 将步骤4.1中配制的溶液加入各孔细胞中，于37 °C孵育30分钟。
      ​注意：若需将HMWFD与NHF-ATP溶液混合后共孵育细胞，应分别配制为最终浓度的2倍，后续以1:1比例混合，以获得准确的工作浓度。试剂对光敏感，操作过程应避光。
5. 细胞处理与固定
   1. 在新的24孔板中，向五个孔中各加入500 µL预热的PBS。
   2. 细胞孵育结束后，用镊子小心取出每一片盖玻片，将其浸入500 µL预热的PBS中进行漂洗，重复五次，依次使用五个含PBS的孔。
      注意：对附着细胞的盖玻片进行轻柔洗涤是本实验成功的关键。
   3. 最后一次PBS漂洗后，将盖玻片轻触精细擦拭纸以吸除多余PBS，立即转移至已预装于24孔板中的冷（4 °C）3.7%甲醛溶液中，在室温下固定15分钟。
   4. 细胞固定期间，用70%乙醇预先清洁显微镜载玻片。从孔中取出盖玻片，每片盖玻片使用5 µL含核染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂封片于载玻片上，并用纸巾或精细擦拭纸轻轻吸除多余PBS。
6. 荧光显微镜观察与图像采集
   1. 上述步骤完成后2至24小时内，使用落射荧光成像系统及数据采集软件获取细胞及其内化HMWFD和/或NHF-ATP的图像。
      注意：本小节描述使用配备落射荧光成像功能的Nikon NiU显微镜及Nikon NIS Elements软件进行图像采集的步骤。也可使用其他性能相当的成像系统和采集软件，请遵循设备制造商的操作说明。
      1. 将载玻片置于直立式落射荧光显微镜的载物台上，切换至双目观察模式，并启动成像程序。
      2. 选择10倍物镜，调节载物台以确定焦平面，以蛇形路径从左至右扫描载玻片，识别感兴趣的区域。
         注意：不同细胞类型的感兴趣区域识别标准可能不同，某些细胞系或癌症类型对TMR-HMWFD和/或NHF-ATP的摄取程度存在显著差异。
      3. 切换至40倍物镜，并通过显微镜上的切换开关从双目观察模式转为图像采集模式。
      4. 点击成像程序中的实时质量图标，以预览并随后采集图像。
      5. 使用标注与测量工具栏中的OC面板，为每个滤光片组或荧光通道设定曝光参数。
         注意：应根据各通道信号强度差异选择合适的曝光时间。例如，DAPI通道曝光时间为200 ms，HMWFD通道为2 s，NHF-ATP通道为4 s。一旦确定各通道曝光时间，后续所有相同通道的图像均应使用相同设置，无论处理方式或实验条件如何。
      6. 各通道曝光参数设定完成后，使用多通道采集工具栏，以设定参数采集三通道图像。
         注意：通过多通道ND采集模式可自动完成同一视野下各通道的图像采集，物镜转盘切换时快门将自动关闭。
      7. 也可手动采集多通道图像：通过切换滤光片组、设定各通道曝光时间、在每次图像采集前后开关快门，并将各通道单独采集的图像进行叠加。
         注意：ND采集模式可自动化该过程并生成合并图像。
      8. 将图像保存为.nd2文件（Nikon Elements格式可保存元数据），同时保存包含合并通道图像及各单独通道图像的TIF文件。
         注意：TIF文件可兼容更广泛的软件应用。
      9. 使用分析工具栏中的对象计数功能，在已保存的.nd2图像文件中统计NHF-ATP、TMR-HMWFD和/或TMR-LMWFD阳性细胞的数量。
      10. 通过分析程序将数据导出至电子表格。
7. 数据量化与分析
   1. 对每种实验条件，采集50至100个细胞用于定量分析。使用数据分析软件（落射荧光成像系统自带软件或其他分析软件）统计并计算每个细胞中荧光囊泡的平均数量。
   2. 采用适当的统计学方法对量化结果进行分析。

3. 肿瘤中ATP的内化，ex vivo（图3）

图3: 体内 检测ATP内化的实验步骤 利用冷冻切片和荧光显微镜观察肿瘤异种移植体内细胞外ATP内化的实验流程示意图 请点击此处以查看此图的放大版本。

1. 用于移植的细胞培养物制备
   1. 在37 °C条件下，使用添加了FBS（终浓度为10% v/v）和青霉素/链霉素（1% v/v）的DMEM培养基，在225 cm²培养瓶中培养癌细胞至80%汇合度。
   2. 用10 mL PBS洗涤细胞两次。将0.25%胰蛋白酶/EDTA预热至37 °C，加入8 mL胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育2分钟。
   3. 当细胞开始从培养瓶底部脱落时，使用10 mL无菌移液管加入8 mL DMEM/FBS。反复吹打两次以去除所有贴壁细胞。用移液管将脱落的细胞转移至50 mL锥形离心管中。
   4. 使用10 mL移液管加入10 mL DMEM/FBS，并将所有残留的悬浮细胞收集到同一个50 mL锥形离心管中。
   5. 将细胞悬液在600 × g、4 °C条件下离心4分钟。弃去上清液，用1 mL冰上预冷的PBS重悬细胞。
   6. 使用血细胞计数板测定细胞密度。计数过程中保持细胞悬液置于冰上。
   7. 将细胞悬液在600 × g、4 °C条件下离心4分钟。弃去上清液，用冰上预冷的PBS重悬细胞，使细胞密度达到每100 µL PBS中含有5 × 10⁶个细胞。将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
2. 皮下注射癌细胞以建立异种移植肿瘤模型
   1. 使用无乳胶注射器（1 mL）和精密滑动针头（27 G针头）进行癌细胞注射。
   2. 将细胞悬液（5 × 10⁶个细胞溶于100 µL PBS中）转移至1.5 mL微量离心管中，然后吸入注射器内。
   3. 选择免疫缺陷（裸鼠）小鼠侧腹部作为注射部位，使用75%乙醇轻轻清洁皮肤，并用精密擦拭纸擦去多余乙醇。
   4. 进行皮下注射时，将针头与皮肤呈约10°角持握。将针尖斜面朝上插入皮肤下方，仅使1–2 mm针头露出皮肤表面。在约10秒内缓慢推注细胞悬液。
   5. 注射完毕后，保持针头原位停留3–5秒，然后拔出针头，并用手指对注射部位施加轻柔但稳固的压力持续3–5秒，以防止注入物外渗。
   6. 使用游标卡尺监测并测量肿瘤生长情况，直至肿瘤体积达到200–500 mm³。
3. 肿瘤切除后使用的HMWFD和NHF-ATP溶液的制备
   1. 将300 µL浓度为16 mg/mL的HMWFD溶解于无血清DMEM（培养基）中，在37 °C水浴中孵育30分钟，并按上述方法在12,000 × g条件下离心5分钟。将溶液转移至1.5 mL微量离心管中。
   2. 将40 µL NHF-ATP类似物储备液（1 mM）加入160 µL无血清DMEM中，配制成0.2 mM的NHF-ATP溶液。
4. 实验孔板的准备
   ​注：本实验设计用于检测HMWFD + NHF-ATP的细胞内吞作用，提示其通过巨胞饮作用被摄取。
   1. 按如下方式准备各孔：第1孔，对照组：200 µL无血清DMEM；第2孔，对照组：100 µL浓度为16 mg/mL的LMWFD + 100 µL无血清DMEM = 200 µL浓度为8 mg/mL的LMWFD；第3孔，对照组：100 µL浓度为0.2 mM的NHF-ATP + 100 µL无血清DMEM = 200 µL浓度为0.1 mM的NHF-ATP；第4孔，实验组：100 µL浓度为16 mg/mL的HMWFD + 100 µL浓度为0.2 mM的NHF-ATP = 200 µL含0.1 mM NHF-ATP和8 mg/mL HMWFD的混合溶液。
5. 肿瘤组织的制备
   1. 通过颈椎脱位法或根据IACUC批准的方案处死小鼠。
   2. 使用10号手术刀将分离出的肿瘤切成约500–1,000 µm厚度的切片。
   3. 将肿瘤切片置于含100 µM NHF-ATP和/或8 mg/mL H/LMWFD的无血清DMEM中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育40分钟。
      注：孵育后，由于肿瘤组织代谢活动，培养基颜色会发生变化。
   4. 用37 °C预热的PBS冲洗组织（每轮冲洗使用2 mL PBS，置于24孔板中）。
   5. 将组织转移至新的24孔板中，加入预热的新鲜PBS，轻轻振荡，重复冲洗四次。
6. 冷冻包埋（制备冷冻组织块）
   1. 为每份待采集的肿瘤准备标识标签。剪取一段长约2 cm的实验室胶带，沿长度方向对折，使粘性面相对贴合。使用记号笔在标签上标注信息，例如小鼠/肿瘤编号。
   2. 将不锈钢组织模具直接放置于干冰上以准备包埋模具。
      ​注：干冰可能导致冻伤、灼伤和窒息。操作干冰时应佩戴隔热手套，在通风良好的区域使用。切勿将干冰储存在密封容器中，应使用允许气体逸出的容器（如泡沫塑料冷藏箱）储存。
   3. 在模具冷却的同时，将少量组织冷冻介质滴入10 mm细胞培养皿中，确保液体量足以完全浸没待采集的肿瘤组织。
   4. 使用带孔勺子捞起切除的肿瘤组织，并立即放入冷冻介质中，确保组织完全浸没。用带孔勺子轻轻滚动组织，使冷冻介质充分覆盖所有组织表面。
   5. 小心地将组织移入含有冷冻介质的包埋模具中。将对应的标签垂直插入冷冻介质/模具中，使其冻结固定。确保标签上的文字部分露在介质外部以便识别。
   6. 当冷冻完成（冷冻介质变为不透明白色）后，将组织块从模具中取出，置于干冰上，并对每个肿瘤重复此过程。在进行冷冻切片前，可将组织块在-80 °C条件下保存数月。
7. 组织样本切片的制备
   1. 为最大程度提高检测到内吞阳性细胞的概率并获得更具代表性的组织区域，使用冷冻切片机在-18至-20 °C条件下连续切取冷冻切片。
      1. 预先冷却冷冻切片机工具（刀片、剃刀片、防卷板、组织夹头架、毛笔），并将肿瘤组织块置于冷冻切片机腔室内于-18至-20 °C条件下平衡。将刀片架角度设置为5–10°。根据需要使用剃刀片修整组织块，并使用组织冷冻介质作为“胶水”将其固定在夹头架上。
      2. 将夹头架锁定在切片机单元的垂直位置，该装置每次手动旋转手柄时会前进设定距离（例如10 µm）。调整防卷板位置，使其刚好位于刀片上方高度。为防止切片前进前组织卷曲，可小心地用拇指滑过组织块底边。
      3. 当切片机前进且组织切片落在金属板上时，使用毛笔引导组织切片，并在必要时展开组织。
      4. 将显微镜载玻片悬于组织切片上方而不接触，使切片被吸附至载玻片上。
         注：冷冻切片机刀片（高轮廓、一次性）极为锋利，可能造成严重伤害。操作刀片和冷冻切片机时需格外小心。如有条件，应使用刀片保护装置。操作前必须接受适当培训。
      5. 将肿瘤切成10 µm厚的切片，并立即将切下的切片转移至带正电荷的玻璃显微镜载玻片上。
         注：对于连续切片，首先将10 µm厚的切片依次收集到八张带正电荷载玻片的左上角。然后使冷冻切片机前进100–200 µm，弃去中间组织。立即继续将后续切片全部转移至玻璃载玻片上。
      6. 接着，在每张载玻片上先前放置的组织切片旁再收集另一片10 µm厚的切片。重复此连续收集过程，直至每张载玻片上均含有八个组织切片，且相邻切片间间隔100–200 µm。将组织切片避光保存以维持荧光信号。
         ​注：载玻片上的组织切片可在-80 °C条件下置于切片盒中保存数月。
8. 组织切片的固定
   1. 关键步骤：在-18至-20 °C条件下，用95%乙醇固定组织切片5分钟。
   2. 用室温PBS洗涤固定后的切片5分钟，然后使用10 µL含DAPI的水性封片剂将固定后的肿瘤切片封固于盖玻片下。
   3. 封片后12–24小时，按照前述培养细胞的方法，通过荧光显微镜观察固定肿瘤切片并采集图像。
9. 荧光显微镜观察与图像采集
   1. 确定感兴趣区域并采集图像，方法见第2.6节。
10. 数据量化与分析
    1. 对细胞进行定量分析，并按照第2.7节所述方法进行适当的统计学分析。

4. 肿瘤内ATP的内化，体内

1. 按照第 3.1 节所述方法准备用于移植的细胞培养物。
2. 通过皮下注射癌细胞以建立异种移植肿瘤
   1. 按照第 3.2 节所述方法建立异种移植肿瘤。
3. 向异种移植肿瘤中注射 ATP 和/或葡聚糖
   1. 按照上述方法配制 DMEM（对照溶剂）或含 8 mg/mL HMWFD 或 LMWFD 的处理溶液，可选择性加入 NHF-ATP（100 µM）于 DMEM 中。
   2. 使用 1 mL 注射器吸取 50 µL 处理溶液，直接注射至每个异种移植肿瘤中。每种处理条件重复四次生物学重复实验。
4. 组织采集与冷冻包埋
   1. 为待采集的每个肿瘤制备标识标签。剪取一段长约 2 cm 的实验室胶带，沿长度方向对折，使粘性面相对贴合。使用记号笔在标签上标注信息，例如小鼠/肿瘤编号。
   2. 注射后约 5 分钟，采用颈椎脱位法或根据 IACUC 批准的方案处死小鼠。
   3. 使用 10 号手术刀在肿瘤附近做切口，切口方向大致垂直于针头注射方向。使用镊子和手术剪将肿瘤组织从周围组织中分离切除。
   4. 根据肿瘤总体积大小，将肿瘤分割为两至四个约 1 cm² 的组织块。
   5. 按照第 3.6 节所述方法准备包埋模具并进行组织包埋。确保从瘤内注射葡聚糖到完成冷冻包埋的采集时间不超过 7–8 分钟。
5. 组织样本切片的制备
   1. 按照第 3.7 节所述方法收集肿瘤连续切片。
6. 组织切片的固定
   1. 按照第 3.8 节所述方法对组织进行固定。
7. 荧光显微镜观察与图像采集
   1. 确定感兴趣区域并采集图像，具体操作见第 2.6 节。
8. 数据定量与分析
   1. 对细胞进行定量分析，并按照第 2.7 节所述方法进行适当的统计学分析。

结果

体外研究
通过观察NHF-ATP与HMWFD或LMWFD的共定位，证明了NHF-ATP的细胞内吞作用（图4）。该实验成功的关键主要在于使用适当浓度的NHF-ATP和葡聚糖，并确定合适的葡聚糖类型（聚赖氨酸型与中性型）。例如，在研究巨胞饮作用时，应选择HMWFD，因其仅被巨胞饮小体所内吞^13,14,15,16。相反，若研究网格蛋白和/或小窝蛋白介导的内吞作用，则应选择LMWFD，因为这些内吞相关内体体积较小，仅能摄取LMWFD^14,15,16。荧光标...

讨论

开发了一种用于分析非水解性ATP细胞内化作用的空间、时间和定量特征的方法。该方法可广泛适用于多种生物系统，包括各类肿瘤发生模型，并提供了相应的技术指导和代表性数据。为获得可解读的数据，在 体内 ATP内化研究（方案第4部分）中，从瘤内注射葡聚糖到冷冻包埋所经历的实验时间必须严格控制。在荧光显微镜成像前，对肿瘤切片后的组织切片进行固定是必要步骤。这两个关键步骤共同确保肿瘤细胞在成像过程中保留已内化的ATP。在分析ATP内化时另一个重要考虑因素是异种移植瘤的异质性。由于不同癌细胞类型的成瘤过程存在差异，可能需要针对该方法的某些环节进行优化，以确定适用于不同癌细胞的理想实验条件。为全面评估肿瘤中ATP的大胞饮作用，必须对整个肿瘤的不同区域进行组织切片成像，因为不同区域的驻留细胞及其内化胞外ATP（eATP）的能力可能存在差异。事实上，该方法在未来的研究中可能揭示不同癌细胞/肿瘤细胞间eATP内化机制的差异。

需要注意的是，NHF-ATP仅可用于取代非结合型ATP或放射性ATP进行内化研究，不能用于其他研究（如代谢研究），因为一旦NHF-ATP从细胞内的巨胞饮体和/或内体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549 细胞，人肺上皮细胞，癌	美国国家癌症研究所	n/a	成本较低的来源
丙酮	费希尔科技公司	S25904
铝箔，雷诺兹	固安捷公司	6CHG6
水性封片剂，ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂	赛默飞世尔科技	P36930
ATP 类似物	耶拿生物科学公司	NK-101
高压灭菌器，灭菌锅	固安捷公司	33ZZ40
刀片，恒冷切片机用，高剖面	C. L. Sturkey 公司	DT554550
游标卡尺	固安捷公司	4KU77
细胞培养基，Ham's F12 营养混合物，无血清	密理博-西格玛公司	51651C-1000ML
带摆动转子的冷冻离心机	艾本德公司	5810R
氯仿	Acros 有机化学公司	423555000
锥形管，15 mL	VWR 公司	21008-216
锥形管，50 mL	VWR 公司	21008-242
盖玻片，玻璃，12 mm	康宁公司	2975-245
恒冷切片机，Leica CM1950	徕卡生物系统公司	CM1950
精密擦拭纸，Kim Wipes	金佰利公司	34155
葡聚糖，可被赖氨酸固定的，高分子量（HMW）	英潍捷基公司	D1818	分子量 = 70,000，四甲基罗丹明标记
葡聚糖，中性，高分子量（HMW）	英潍捷基公司	D1819
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），无血清	费希尔科技公司	11885076
干冰	本地配送	定制订单
落射荧光成像系统，Nikon NiU 及 Nikon NIS Elements 采集软件	尼康公司	定制订单
乙醇	费希尔科技公司	BP2818-4
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	16000044
镊子，Dumont #7，弯头	精细科学工具公司	11274-20
镊子，Dumont #5，直头	精细科学工具公司	11254-20
手套（小号、中号、大号）	麦克罗弗莱克斯公司	N191, N192, N193
手套，MAPA Temp-Ice 700 保温手套（用于操作干冰）	费希尔科技公司	19-046-563
血细胞计数板	戴杰公司	EF16034F EA
细胞培养箱	艾本德公司	Galaxy 170 S
标签胶带	费希尔科技公司	159015R
记号笔，Sharpie（超细）	史泰博公司	642736
小鼠，免疫缺陷型（Nu/J）	杰克逊实验室	2019
微量离心机，accuSpin Micro17	费希尔科技公司	13-100-675
微量离心管，Eppendorf 管（1.5 mL）	Axygen 公司	MCT-150-C
显微镜载玻片盒	费希尔科技公司	50-751-4983
针头，27 号	贝克顿-迪金森公司	752 0071
画笔	固安捷公司	39AL12
纸巾	史泰博公司	33550
多聚甲醛	Acros 有机化学公司	416785000
青霉素/链霉素	吉布科公司	15140122
穿孔勺，直径 15 mm，长度 135 mm	Roboz 外科器械公司	RS-6162
磷酸盐缓冲液（PBS）	费希尔科技公司	BP3991
移液器吸头（10 μL）	费希尔科技公司	02-707-438
移液器吸头（200 μL）	费希尔科技公司	02-707-411
移液器吸头（1000 μL）	费希尔科技公司	02-707-403
移液管，血清学用（10 mL）	VWR 公司	89130-910
移液器，Gilson P2	戴杰公司	EF9930A
移液器起始套装，Gilson（2-10 μL，20-200 μL，200-1000 μL）	戴杰公司	EF9931A
平台式摇床 — 旋转式，台式	科尔-帕尔默公司	EW-51710-23
带正电荷的显微镜载玻片，Superfrost	费希尔科技公司	12-550-15
手术刀，10 号，Surgical Design 公司	费希尔科技公司	22-079-707
手术剪，锐利，弯头	精细科学工具公司	14005-12
图像分析软件，Nikon Elements	尼康公司	定制订单
图像分析软件，ImageJ（FIJI）	美国国立卫生研究院	n/a	在线下载（免费）
样本盘，30 mm（卡盘架），恒冷切片机配件	徕卡生物系统公司	14047740044
染色缸，245 mm BioAssay 培养皿	康宁公司	431111
注射器，1 cc	贝克顿-迪金森公司	309623
胶带，实验室用，19 mm 宽	费希尔科技公司	15-901-5R
计时器	费希尔科技公司	14-649-17
组织培养皿，直径 100 × 15 mm	费希尔科技公司	08-757-100D
组织培养瓶，225 cm2	赛默飞世尔科技	159933
组织培养板，24 孔	贝克顿-迪金森公司	353226
组织包埋模具，不锈钢	Tissue Tek 公司	4161
组织冷冻介质，最佳切割温度（OCT）	费希尔科技公司	4585
胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸），0.25%	吉布科公司	25200072
水浴锅，Precision GP 2S	赛默飞世尔科技	TSGP2S