利用高压氧提高人U251胶质瘤细胞的放射敏感性

摘要

本实验方案表明，高压氧可通过将细胞阻滞在G2/M期，增强X射线照射对U251胶质瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，从而提高人胶质瘤细胞系的放射敏感性。

摘要

本研究旨在探讨高压氧在增强人脑胶质瘤细胞放射敏感性中的作用。将传代培养的U251人脑胶质瘤细胞随机分为四组：未处理对照组、仅高压氧（HBO）处理组、仅X射线照射（X-ray）处理组，以及HBO联合X射线处理组。通过观察各组细胞的形态、增殖活性、细胞周期分布及凋亡情况，评估HBO在提高胶质瘤细胞放射敏感性中的作用。随着X射线剂量的增加（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy），胶质瘤细胞的存活分数（SF）逐渐降低。

与单独X射线组相比，HBO联合X射线处理的各剂量组细胞存活率（SF）显著降低（所有 P < 0.05）。对于U251细胞系，HBO联合X射线组的增殖抑制作用显著高于单独X射线组（所有 P < 0.05）。U251细胞中G2/M期细胞百分比在HBO联合X射线（2 Gy）组（26.70% ± 2.46%）和HBO组（22.36% ± 0.91%）中显著高于对照组（11.56% ± 2.01%）和X射线（2 Gy）组（10.35% ± 2.69%）（所有 P < 0.05）。U251细胞的凋亡率在HBO联合X射线（2 Gy）组中显著高于HBO组、X射线（2 Gy）组及对照组（所有 P < 0.05）。我们得出结论：HBO可通过将胶质瘤细胞阻滞在G2/M期，增强胶质瘤U251细胞的增殖抑制和凋亡作用，并提高U251胶质瘤细胞的放射敏感性。

引言

胶质瘤是一种起源于中枢神经系统胶质细胞的原发性颅内肿瘤¹。目前胶质瘤的治疗策略为手术联合放疗和化疗。术后放疗可为胶质瘤患者带来生存获益（I级证据），早期术后放疗可有效延长患者生存期（II级证据）²。对于高级别胶质瘤（III级或IV级），尤其是高度恶性且具有侵袭性的胶质母细胞瘤（III级证据）³，应尽早实施术后放疗（<6周）。然而，尽管进行了早期干预，胶质瘤在综合治疗后仍具有较高的复发率和较差的预后。这些不良结局主要与胶质瘤的放射敏感性较低有关。影响肿瘤放射敏感性的因素包括肿瘤细胞的固有放射敏感性、缺氧或非缺氧状态的肿瘤细胞、缺氧肿瘤细胞所占比例，以及瘤周组织修复辐射损伤的能力⁴。

在这些因素中，缺氧或非缺氧的肿瘤细胞以及缺氧肿瘤细胞所占的比例对肿瘤的放射敏感性具有重要影响。高压氧（HBO）可通过提高组织氧张力和血液氧扩散能力来增加组织氧储备。HBO还可能产生一系列有益的生化、细胞学和生理学效应。⁵例如，高压氧（HBO）对放射治疗引起的辐射损伤具有显著的修复作用。尽管已有报道表明，高压氧联合放射治疗或化学治疗可提高胶质瘤放射治疗或化学治疗的临床疗效⁶，关于单独使用高压氧对恶性胶质瘤生长的影响，目前仍存在较大争议。Ding 等人⁷ 和 Wang 等人⁸ 均表明HBO可促进生长 原位 小鼠胶质瘤 通过 涉及抑制细胞凋亡和促进肿瘤血管生成的机制。在生理条件下，据报道高压氧通过诱导氧化应激促进肿瘤血管生成⁹.

然而，一项研究表明，短期高压氧暴露可促进肿瘤细胞增殖，而长期高压氧暴露则促进细胞凋亡并抑制增殖¹⁰。因此，仍需进一步研究以明确高压氧对胶质瘤生长的促进或抑制作用，以及高压氧联合放疗或化疗如何诱导治疗增敏效应。特别是，亟需阐明高压氧提高胶质瘤放射敏感性的具体分子机制。为探讨高压氧如何提高人U251胶质瘤细胞的放射敏感性，本研究采用高压氧联合X射线照射处理胶质瘤细胞，观察其对细胞增殖、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。

方案

所有研究方法均经兰州大学第二医院机构审查委员会和伦理委员会批准，并按照相关指南和规定进行。

1. 胶质瘤细胞的处理

注意：本实验使用了 U251 胶质瘤细胞系。

1. U251 细胞培养
   1. 将 U251 细胞接种于多个培养皿中，使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。
   2. 当细胞融合度达到 50%–60% 时，使用胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%，无酚红）消化细胞，随后继续培养至细胞融合度达 80%。
2. X 射线照射
   1. 用厚度不超过 1 cm 的等效组织补偿材料覆盖培养皿或培养瓶。然后，通过 6 MV 直线加速器对细胞进行 X 射线照射，源-细胞距离为 100 cm，通过点击遥控板上的 rotate 按钮进行调节。
   2. 由物理师测量辐射剂量并校正衰减。作为对照，在 X 射线照射前，将含有培养基的培养瓶置于探测器中。
3. 高压氧（HBO）
   1. 开启紫外线灯照射 15 分钟对 HBO 舱进行消毒，随后向舱内充入 0.02 MPa 纯氧，持续 5 分钟。
   2. 将细胞置于培养板或培养瓶中放入舱内后，点击舱外控制面板上的 pressure regulator 按钮，在照射前 30 分钟内将舱内 HBO 压力升至 0.2 MPa（2.0 ATA）。
   3. 30 分钟后，再次点击 pressure regulator 按钮，将 HBO 压力降至先前水平（0.1 MPa）。随后，每天进行 1 次 HBO 处理，连续处理 3 天。

2. 不同组别的U251胶质瘤细胞

1. 设置对照组、X射线（2 Gy）组以及HBO联合X射线（2 Gy）组，用于绘制细胞生长曲线。
2. 取处于最大生长速率时期的胶质瘤U251细胞，制备单细胞悬液（参见步骤1.1.2）。使用血细胞计数板计数细胞，将细胞密度调整至1 × 10⁶/mL。随后，将1 mL细胞悬液接种至培养瓶中（细胞密度：1 × 10⁶/瓶），每组设三个独立的培养瓶。
3. 在培养24 h、48 h和72 h后，于100倍明场显微镜下观察细胞形态，并对贴壁细胞进行计数。

3. 胶质瘤U251细胞在高压氧处理后30分钟内的放射敏感性（克隆形成实验）

1. 将U251单细胞悬液以5 × 10² 个细胞/mL的密度接种于6孔板各孔中，随后分别接受指定剂量的X射线照射（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy），每种X射线剂量设三个平行样本。
2. 对于高压氧（HBO）联合X射线（2 Gy）组，在HBO处理后30分钟内对细胞进行X射线照射。处理后，将细胞置于37 °C、5% CO₂ 条件下培养14天。
3. 待克隆可见后，吸除培养基，并用PBS洗涤克隆2次。
4. 加入1 mL 10%甲醇固定细胞15分钟，随后加入1 mL 0.1%结晶紫染色20分钟。
5. 染色完成后，使用移液器加入6 mL蒸馏水洗涤细胞，吸除结晶紫溶液，然后让细胞自然晾干。
6. 在显微镜下计数直径介于0.3 mm至1.0 mm之间的克隆，确保每个克隆包含>50个细胞。
7. 使用公式（1）计算存活分数（SF）：
   SF = × 100%    （1）
8. 利用统计软件，基于单击多靶模型（SHMT），通过公式（2）绘制辐射剂量-存活曲线：
   S = 1 - (1 - )^N    （2）
   其中，S = 存活概率；k = 平均致死剂量（引起每个细胞平均一次击中的剂量）；x = 每个细胞的击中次数；N = 靶点数量（导致细胞死亡所需的击中次数）。
9. 计算放射生物学参数，包括平均致死剂量（D₀）、拟阈值剂量（Dq）、外推数（N）、2 Gy照射剂量下的存活分数（SF₂）、增敏增强比（D₀）（SER = 对照组D₀/实验组D₀）以及SER（Dq）（SER = 对照组Dq/实验组Dq），以评估HBO对U251胶质瘤细胞放射敏感性的影响。
   其中，D₀ = 存活曲线线性部分斜率的倒数（使存活率降低63%的剂量）
   N = 将存活曲线线性部分外推至与纵轴相交点的数值（反映细胞修复辐射损伤的能力）
   Dq = 从纵轴上1.0处作平行于横轴的直线，与外推线相交后向横轴投影所得交点在横轴上的数值。

4. 细胞计数实验评估U251胶质瘤细胞增殖

1. 设置对照组、HBO组，以及单独接受X射线照射（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）或X射线联合HBO处理的各组。
2. 使用U251细胞的单细胞悬液，将细胞密度调整至1 × 10⁴ 个细胞/mL。
3. 将细胞悬液（100 µL，密度：1 × 10³/孔）接种于96孔板中（每组5个孔）。进行细胞计数实验（参见材料表），培养48 h后使用微孔板读板仪在450 nm波长下测定吸光度（OD）。
4. 根据公式（3）计算细胞增殖抑制率（IR）：
   IR = × 100%    （3）

5. U251 胶质瘤细胞凋亡的检测

1. 设置对照组、HBO组、X射线（2 Gy）组以及HBO联合X射线（2 Gy）组。
2. 培养结束后弃去培养基，用1× PBS洗涤细胞。
3. 用胰蛋白酶消化细胞，当显微镜下观察到细胞呈圆形时，加入DMEM终止胰蛋白酶作用。
4. 将细胞转移至离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。
5. 弃去上清液，向沉淀中加入3 mL 1× PBS，轻轻吹打重悬细胞。
6. 再次在200 × g 条件下离心5分钟，吸除上清PBS，用Binding Buffer轻柔吹打重悬细胞，洗涤2次后重悬于50 µL Binding Buffer中。
7. 在4 °C条件下向细胞中加入5 µL annexin V-FITC，避光孵育15分钟后加入400 µL Binding Buffer。将混合液转移至含有5 µL碘化丙啶（PI）染色液（10 mg/mL）的流式细胞仪检测管中，5分钟后通过流式细胞术检测凋亡细胞¹¹。
8. 在488 nm激发波长下记录红色荧光信号，输入计算机分析5,000个细胞中各细胞周期所占百分比，然后打印凋亡细胞峰图。
9. 通过annexin V和PI双标记法收集绿色和红色荧光信号，输入计算机进行分析，然后打印散点图。

6. U251 胶质瘤细胞周期分布的检测

1. 用 1 mL PBS 将上述细胞洗涤 2 次，然后加入胰蛋白酶处理。
2. 在光学显微镜下观察到细胞呈圆形形态时，加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。
3. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中，随后加入预冷的 75% 乙醇溶液。
5. 在 −20 °C 下孵育混合物至少 4 小时或过夜。
6. 用冰预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，然后加入 180 µL EDTA（0.1 mM，3.7 mg EDTA + 100 mL PBS）、20 µL RNase A（10 mg/mL）、35 µL Triton X-100（2%，2 mL Triton + 98 mL FBS）和 96.5 µL PBS。随后加入 17.5 µL 碘化丙啶（PI）溶液（1 mg/mL）。
7. 在 4 °C 避光条件下孵育 10 分钟。
8. 用 200 µL PBS 洗涤细胞，然后将其置于流式细胞仪中，按照先前所述方法评估细胞周期分布¹²。
9. 在双激光、三维空间激发模式下操作流式细胞仪，光斑尺寸为 22 µm x 66 µm 和 13 µm x 66 µm。使用 430 µm x 180 µm 的流动室，光谱范围 300–1100 nm，检测灵敏度 ≤100 MESF，CV <2% 分辨率。随后用 488 nm 激发光照射细胞，并通过仪器软件检测和测量荧光信号，以确定细胞周期分布¹³。
10. 测定 DNA 含量，然后根据 DNA 含量分析细胞周期。

7. 统计分析

1. 进行统计分析。
2. 数据以均值 ± 标准差表示。
3. 采用学生氏 t 检验比较组间差异，统计学显著性设定为 P < 0.05。

结果

U251 胶质瘤细胞的培养
U251 胶质瘤细胞在 DMEM 中培养 24 至 48 小时后呈梭形，且贴壁生长。这些细胞用于后续研究（图 1）。

胶质瘤细胞形态学与计数
U251胶质瘤细胞在高压氧联合X射线（2 Gy）组中，经24 h、48 h和72 h培养后，细胞数量均显著低于单纯X射线（2 Gy）组（均 P < 0.05）（表1）。培养24 h时，对照组未经处理的U251细胞生长良好，呈细长的梭形形态；在X射线（2 Gy）组中，U251细胞密度降低，可见少量悬浮的死亡细胞；在高压氧联合X射线（2 Gy）组中，细胞密度进一步降低，悬浮死亡细胞数量更多。培养48 h时，X射线（2 Gy）组和高压氧联合X射线（2 Gy）组的细胞密度持续下降，而对照组细胞密度增加。培养72 h时，X射线（2 Gy）组的细胞密度进一步减少，尤其在高压氧联合X射线（2 Gy）组中更为明显（

讨论

胶质瘤细胞系U251是最经典的胶质瘤细胞系之一，被广泛用作多种研究中的胶质瘤模型。

高压氧对U251胶质瘤细胞增殖的影响
高压氧（HBO）通常指在密闭舱内呼吸纯氧（氧浓度为100%），舱内压力为正常大气压的1.5至3倍，可提高微血管血浆中的氧含量¹⁴。对于胶质瘤患者，已有报道显示，将放射治疗或化学治疗与高压氧联合应用可提高这些治疗的临床疗效。在患有中枢神经系统肿瘤的儿童或年轻成人中，高压氧联合放疗可改善临床症状及肿瘤影像学表现。尽管高压氧的应用是安全的⁶，但关于单独使用高压氧对恶性胶质瘤生长的影响仍存在较大争议。Ding 等人⁷研究表明，高压氧通过促进血管内皮生长因子和缺氧诱导因子-1α的表达，抑制肿瘤组织中的细胞凋亡并增加微血管密度，提示单纯使用高压氧可能不利于胶质瘤的治疗。有报道指出，高压氧在胶质瘤大鼠模型中可促进胶质瘤细胞生长⁸，并在生理条件...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结合缓冲液	Dickinson and Company	RH10 9RR
CCK-8 检测试剂盒	DOJINDO	NJ	细胞计数实验
CELL FIT			细胞周期分析（DNA含量）
CELLQUEST			凋亡细胞分析
DMEM 和 Annexin V-FITC	Gibco BRL
流式细胞仪	Dickinson
胶质瘤 U251 和 U87 细胞系	中国科学院上海细胞生物学研究所
高压氧舱	宏远研究院
医用直线加速器	Elekta Limited Company
酶标仪
MOD FITLT formac v1.01			细胞分析——细胞周期时相
胰蛋白酶	Hyclone Laboratories Inc