利用高压氧提高人U251胶质瘤细胞的放射敏感性

摘要

本实验方案表明，高压氧可通过将细胞阻滞在G2/M期，增强X射线照射对U251胶质瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用，从而提高人胶质瘤细胞系的放射敏感性。

摘要

本研究旨在探讨高压氧在增强人脑胶质瘤细胞放射敏感性中的作用。将传代培养的U251人脑胶质瘤细胞随机分为四组：未处理对照组、仅高压氧（HBO）处理组、仅X射线照射（X-ray）处理组，以及HBO联合X射线处理组。通过观察各组细胞的形态、增殖活性、细胞周期分布及凋亡情况，评估HBO在提高胶质瘤细胞放射敏感性中的作用。随着X射线剂量的增加（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy），胶质瘤细胞的存活分数（SF）逐渐降低。

与单独X射线组相比，HBO联合X射线处理的各剂量组细胞存活率（SF）显著降低（所有 P < 0.05）。对于U251细胞系，HBO联合X射线组的增殖抑制作用显著高于单独X射线组（所有 P < 0.05）。U251细胞中G2/M期细胞百分比在HBO联合X射线（2 Gy）组（26.70% ± 2.46%）和HBO组（22.36% ± 0.91%）中显著高于对照组（11.56% ± 2.01%）和X射线（2 Gy）组（10.35% ± 2.69%）（所有 P < 0.05）。U251细胞的凋亡率在HBO联合X射线（2 Gy）组中显著高于HBO组、X射线（2 Gy）组及对照组（所有 P < 0.05）。我们得出结论：HBO可通过将胶质瘤细胞阻滞在G2/M期，增强胶质瘤U251细胞的增殖抑制和凋亡作用，并提高U251胶质瘤细胞的放射敏感性。

引言

胶质瘤是一种起源于中枢神经系统胶质细胞的原发性颅内肿瘤¹。目前胶质瘤的治疗策略为手术联合放疗和化疗。术后放疗可为胶质瘤患者带来生存获益（I级证据），早期术后放疗可有效延长患者生存期（II级证据）²。对于高级别胶质瘤（III级或IV级），尤其是高度恶性且具有侵袭性的胶质母细胞瘤（III级证据）³，应尽早实施术后放疗（<6周）。然而，尽管进行了早期干预，胶质瘤在综合治疗后仍具有较高的复发率和较差的预后。这些不良结局主要与胶质瘤的放射敏感性较低有关。影响肿瘤放射敏感性的因素包括肿瘤细胞的固有放射敏感性、缺氧或非缺氧状态的肿瘤细胞、缺氧肿瘤细胞所占比例，以及瘤周组织修复辐射损伤的能力⁴。

在这些因素中，缺氧或非缺氧的肿瘤细胞以及缺氧肿瘤细胞所占的比例对肿瘤的放射敏感性具有重要影响。高压氧（HBO）可通过提高组织氧张力和血液氧扩散能力来增加组织氧储备。HBO还可能产生一系列有益的生化、细胞学和生理学效应。⁵例如，高压氧（HBO）对放射治疗引起的辐射损伤具有显著的修复作用。尽管已有报道表明，高压氧联合放射治疗或化学治疗可提高胶质瘤放射治疗或化学治疗的临床疗效⁶，关于单独使用高压氧对恶性胶质瘤生长的....

方案

所有研究方法均经兰州大学第二医院机构审查委员会和伦理委员会批准，并按照相关指南和规定进行。

1. 胶质瘤细胞的处理

注意：本实验使用了 U251 胶质瘤细胞系。

1. U251 细胞培养
   1. 将 U251 细胞接种于多个培养皿中，使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下进行培养。
   2. 当细胞融合度达到 50%–60% 时，使用胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%，无酚红）消化细胞，随后继续培养至细胞融合度达 80%。
2. X 射线照射
   1. 用厚度不超过 1 cm 的等效组织补偿器覆盖培养皿或培养瓶。然后，通过远程控制板上点击 rotate 按钮，调节源-细胞距离为 100 cm，使用 6 MV 直线加速器对细胞进行 X 射线照射。
   2. 由物理师测量辐射剂量并校正衰减。作为对照，在 X 射线照射前，将含有培养基的培养瓶置于探测器中。
3. 高压氧（HBO）
   1. 开启紫外线灯照射 15 分钟对 HBO 舱进行消毒，随后向舱内充入 0.02 MPa 纯氧，持续 5 分钟。

结果

U251 胶质瘤细胞的培养
U251 胶质瘤细胞在 DMEM 中培养 24 至 48 小时后呈梭形，且贴壁生长。这些细胞用于后续研究（图 1）。

胶质瘤细胞形态学与计数
在细胞培养24小时、48小时和72小时后，HBO联合X射线（2 Gy）组的U251胶质瘤细胞数量均显著低于单独X射线（2 Gy）组（均 P < 0.05）（表1）。培养24小时时，对照组未经处理的U251细胞生长良好，呈细长的梭形形态；在X射线（2 Gy）组中，U251细胞密度降低，可见少量悬浮的死亡细胞；在HBO联合X射线（2 Gy）组中，细胞密度进一步降低，悬浮死亡细胞数量更多。培养48小时时，X射线（2 Gy）组和HBO联合X射线（2 Gy）组的细胞密度持续下降，而对照组细胞密度增加。培养72小时时，X射线（2 Gy）组的细胞密度进一步降低，尤其在HBO联合X射线（2 Gy）组中更为明显（

讨论

胶质瘤细胞系U251是最经典的胶质瘤细胞系之一，被广泛用作多种研究中的胶质瘤模型。

高压氧对U251胶质瘤细胞增殖的影响
高压氧（HBO）通常指在密闭舱内呼吸纯氧（氧浓度为100%），舱内压力为正常大气压的1.5至3倍，可提高微血管血浆中的氧含量¹⁴。对于胶质瘤患者，已有报道显示，将放射治疗或化学治疗与高压氧联合应用可提高这些治疗的临床疗效。在患有中枢神经系统肿瘤的儿童或年轻成人中，高压氧联合放疗可改善临床症状及肿瘤影像学表现。尽管高压氧的应用是安全的⁶，但关于单独使用高压氧对恶性胶质瘤生长的影响仍存在较大争议。Ding 等人⁷研究表明，高压氧通过促进血管内皮生长因子和缺氧诱导因子-1α的表达，抑制肿瘤组织中的细胞凋亡并增加微血管密度，提示单纯使用高压氧可能不利于胶质瘤的治疗。有报道指出，高压氧在胶质瘤大鼠模型中可促进胶质瘤细胞生长⁸，并在生理条件.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结合缓冲液	Dickinson and Company	RH10 9RR
CCK-8 检测试剂盒	DOJINDO	NJ	细胞计数实验
CELL FIT			细胞周期分析（DNA含量）
CELLQUEST			凋亡细胞分析
DMEM 和 Annexin V-FITC	Gibco BRL
流式细胞仪	Dickinson
胶质瘤 U251 和 U87 细胞系	中国科学院上海细胞生物学研究所
高压氧舱	宏远研究院
医用直线加速器	Elekta Limited Company
酶标仪
MOD FITLT formac v1.01			细胞分析——细胞周期时相
胰蛋白酶	Hyclone Laboratories Inc