本文提供了一种在70 °C高温下制备样品载网的详细方案，适用于冷冻电镜实验前的快速冷冻步骤。
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本文内容
摘要
摘要
用于冷冻电子显微镜（cryo-EM）实验的样品载网通常在适合生物样品保存的温度下制备，多数情况下为 4 °C，偶尔在室温下进行。最近，我们发现低温下解析的蛋白质结构可能不具备功能相关性，特别是对于来自嗜热古菌的蛋白质。为此，我们开发了一种在较高温度（最高达 70 °C）下制备蛋白质样品用于 cryo-EM 分析的方法。我们证明，在较高温度下制备的样品所获得的结构具有功能相关性，并且依赖于温度。本文以 55 °C 为例，详细描述了在高温下制备样品载网的实验方案。实验中使用了一个经过改造的玻璃化装置，增加了一个离心管，并将样品在 55 °C 下孵育。相关操作步骤经过精细优化，以最大限度减少水蒸气冷凝，并在载网上形成一层薄冰。文中同时提供了成功与失败实验的示例。
引言
用于解析蛋白质复合物结构的冷冻电镜（cryo-EM）技术持续进步，尤其在获得高分辨率结构方面取得了显著进展1,2。与此同时，通过在玻璃化冷冻前改变样品条件（如pH值或配体）也拓展了该技术的应用范围3，该过程包括样品载网的制备及随后的快速冷冻4,5。另一个重要条件是温度。尽管冷冻电镜实验与X射线晶体学一样在低温下进行，但通过冷冻电镜解析出的结构反映的是样品在玻璃化前溶液状态下的构象。迄今为止，大多数单颗粒分析（SPA）冷冻电镜研究在玻璃化前将样品保持在冰上（即4 °C）6，尽管也有不少研究使用接近室温7,8,9,10甚至高达42 °C11的样品。在最近的一项报告中，我们对嗜热古菌Sulfolobus solfataricus（Sso）的酮酸还原异构酶（KARI）在4 °C至70 °C的六个不同温度下进行了温度依赖性研究12。我们的研究表明，在具有功能相关性的温度下制备样品载网至关重要，而冷冻电镜是目前唯一在实践上可行的、可用于解析同一蛋白质复合物在多个温度下结构的结构生物学方法。
在高温下进行玻璃化处理的主要困难在于尽量减少蒸汽冷凝并获得薄冰层。本文报道了我们先前在 Sso-KARI12 研究中用于高温制备样品载网的详细方案。我们假定读者或观众已熟悉冷冻电镜实验的整体样品制备和数据处理流程，因此重点强调与高温相关的操作要点。
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方案
注意：本实验方案旨在使用改进的商用玻璃化冷冻装置，在特定温度下制备冷冻电子显微镜（cryo-EM）样品，尤其适用于高于37 °C的温度条件。整体实验装置如图1所示。本方案以55 °C为例进行说明。关于其他温度下的具体条件，请参见参考文献12中的补充表2。
1. 玻璃化装置的准备
- 在50 mL离心管的封闭端打一个直径1 cm的孔。
- 将该离心管置于玻璃化装置腔室内的超声波出水口处，如图2所示。
注意：目的是在水蒸气进入整个腔室之前，通过该管路将其引导至热交换器，从而最大限度减少冷凝水的形成。 - 将玻璃化装置的温度设定为指定温度（例如55 °C，如图3所示），使装置腔室达到55 °C和100%相对湿度。实验开始前，至少静置半小时，以确保条件稳定。
2. 预热样本和工具
- 将水浴锅放在加热板上，并将加热板设定至所需温度（此处为 55 °C）。使用温度计检查，确保水温达到 55 °C。
- 将样品置于水浴锅中孵育，并在印迹实验前将移液器吸头放在加热板边缘预热 2 分钟或更长时间。
注意：玻璃化装置腔室的最高温度设置为 60 °C。若需为冷冻电镜实验准备更高温度的载网（例如 70 °C），可将样品在 80 °C 的水浴中孵育，并估算样品温度与玻璃化装置温度的平均值作为样品在载网上的实际温度（本例中为 70 °C）。有关此估算方法的更多细节和局限性，请参见讨论部分。
3. 印迹实验的准备工作
- 使用电晕放电装置对覆有孔状碳膜的载网进行放电处理，条件为25 mA、30秒；或根据所用设备的不同，采用相应的替代参数。
- 将镊子与载网一起在冷冻制样装置中孵育至少2分钟或更长时间。
- 按照标准操作程序向乙烷容器中充入乙烷，注意避免乙烷溢出。
注意：此步骤约需10分钟，完成后应立即开始 blotting 实验，以防止乙烷冻结。 - 在进行 blotting 实验前不少于5分钟时，将冷冻制样用滤纸放入冷冻制样装置的腔室内。
注意：过早将滤纸放入腔室会导致滤纸过度湿润。
4. 印迹实验
注意：持握载网时，应确保载网稳定，并尽量减少镊子与载网的接触面积（图4）。这样做是为了保持乙烷最佳的冷却效率，并避免形成非玻璃态冰。
- 使用移液枪头将 7–9 μL 样品滴加到载网上，静置 1–2 秒，用滤纸吸去多余液体 1–1.5 秒，然后迅速将样品浸入液态乙烷中冷冻。
- 将载网从液态乙烷转移至存放在液氮中的冷冻盒中。
注意：此步骤必须格外小心，因为镊子仍处于较热状态，此时整个冷却罐内充满蒸气。
5. 载网的质量检查
- 夹取载网并将其装入冷冻电镜仪器中。
- 利用冷冻电镜仪器的显示屏及软件的低剂量成像功能，检查载网上的冰层状态以及样品在载网上的分布情况。
注意：载网常常过于干燥，或冰层过厚。在较高温度下制备的载网成功率明显低于室温或 4 °C 下制备的载网。良好载网与不合格载网的代表性结果见下节。 - 若所得载网质量不佳，可调整条件（如等待时间、 blotting 时间等）重复载网制备过程。若载网质量良好，则重复相同步骤，在不同温度下制备载网。
6. 数据采集
- 将高质量的载网转移至高分辨率冷冻电镜仪器中。
- 根据既定流程进行数据采集和数据分析。
注意：如我们先前发表的研究所示，结构的分辨率不受高温影响12。
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结果
低倍率下的整体视图如图5A、B所示。图A为一张成功的载网示例，其冰层从左上角（较厚）到右下角（较薄或无冰）呈现梯度变化。此类载网便于在中间区域找到适合数据采集的合适冰层厚度，例如蓝色和绿色方框所示区域。图B的载网则过于干燥，网格中的方格对比度过亮，表明冰层过薄或完全无冰层。仅有红箭头所指示的两个方格适合进行数据采集。
此外，图 5C、D 展示了来自不同载网的低剂量图像示例。图 C 中的图像显示，大部分冰处于结晶态，不适合用于数据收集；而图 D 中的图像表明，冰层主要呈非晶态，适合用于数据收集。
请注意，这是一篇专注于高温条件下载网制备的短文。载网仅用于承载样品以进行数据采集。一个优质的载网虽不能完全保证，但有很大可能获得可用于解析高分辨率结构的优质数据。本文所描述示例的实际冷冻电镜数据及最终结构已在已发表的论文中详细阐述。
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讨论
在实验方案的第1步中，务必确保离心管安装到位，在实验进行过程中不会脱落。由于腔室内会积聚大量水滴，可能改变滤纸的吸附能力，因此建议在玻璃化装置腔室达到平衡温度后，整个实验时间不应超过30分钟。若操作时间超过30分钟，操作者需更换滤纸，并等待舱内重新平衡温度和湿度。在实验方案的第8步中，建议的样品体积为7–9 µL，比常规体积稍大，否则样品在高温下会迅速蒸发，导致载网上出现空白区域。另一方面，强烈建议所加样品体积不得超过9 µL，否则在 blotting 前移动镊子的过程中，样品极有可能滴落。总体而言，该技术成功的关键在于对载网进行稳定且快速的夹持，以及准确、稳定地完成每一个限时操作步骤。此外，建议每轮实验仅针对一种特定的高温条件进行。在进行另一温度条件的实验前，所有系统必须完全恢复并重置。
由于腔室温度高、湿度大，窗口常被雾气覆盖，导致实验难以启动。建议使用少量肥皂水清除窗口雾气。如果载网效果不佳，可能的原因是未严格遵循上述操作步骤和/或操作耗时过长。请尝试精确且迅速地重复样品载网的制备。若重复后载网效果仍不理想，则可尝试调整实验条件。本实验中较常遇到的问题是在较高温度下载网上无冰...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的 Hervé Remigy 博士提供的有益建议。冷冻电镜实验在中央研究院冷冻电镜设施（ASCEM）完成。ASCEM 得到中央研究院（资助编号：AS-CFII-108-110）和台湾蛋白质计划（资助编号：AS-KPQ-109-TPP2）的支持。作者还感谢黄慧如女士在样品制备方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 方底离心管（Falcon管） | Falcon | 352070 | 规格：50 mL |
| 滤纸 | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20 mm，Grade 595 |
| HI1210 | Leica | 水浴锅 | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | 辉光放电仪 | |
| Quantifoil，1.2/1.3 200目铜网 | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | 低剂量成像 |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot镊子 | Ted Pella | 47000-500 |
参考文献
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- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
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