本方案介绍了一种通过测量粪粒产量来评估钻木甲壳类动物Limnoria摄食速率的方法。该方法适用于非专业实验室，并有望纳入标准测试流程，用于评估在海洋条件下木材耐久性的提升情况。
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摘要
摘要
海洋蛀木无脊椎动物会迅速破坏海洋木材及木质海岸基础设施，每年在全球造成数十亿美元的损失。由于法规已限制在海洋环境中使用杂酚油和铬化砷酸铜（CCA）等广谱生物杀灭剂处理木材，因此需要具有天然耐久性的木材种类以及新型木材防腐方法。这些方法需经过测试以满足监管标准，例如欧洲关于海洋蛀木生物防腐剂测试的标准 EN 275。对耐久性木材种类或木材防腐处理的初步研究，可通过实验室测试快速且低成本地完成，相比通常耗资巨大且周期较长的海洋野外试验，实验室测试具有诸多优势。许多Limnoria（俗称“蛀木水虱”）种类是海洋中蛀食木材的甲壳类动物。Limnoria因其易于在水族箱中饲养，且其在木材上的取食速率便于测量，成为实验室中研究海洋蛀木生物对木材生物降解作用的理想物种。本文介绍了一种利用蛀木水虱评估木材生物降解性的可标准化实验室测试方法。
引言
钻木生物可对海洋中的木质结构（如海堤、码头和水产养殖设施）造成严重破坏，全球每年用于这些结构的更换或修复费用高达数十亿美元1,2,3。为保护此类结构，通常会对木材进行处理以降低其生物降解性。然而，由于澳大利亚、欧盟、英国和美国已限制在海洋环境中使用广谱杀菌剂，因此人们正积极寻求新的木材改性技术以及天然耐蛀的木材种类4,5,6,7。针对海洋环境中木材防腐的新技术，必须经过充分测试，以满足监管标准，并限制化学防腐剂溶出等潜在危害对环境的影响。例如，现行的欧洲标准 EN 275（自1992年起实施）即用于评估木材防腐处理对海洋钻木生物破坏的防护效果8,9。该标准，以及针对杀菌化合物（如CCA4,5,6,7和杂酚油10）使用的其他法规，均要求采用可持续、无毒的木材防护方法，并使用天然耐蛀的木材种类以替代杀菌剂处理11,12。按照EN 275等标准开展的海洋实地试验需要长期暴露，因此成本高昂且获得有意义结果的速度较慢。相比之下，实验室测试为评估木材产品抵御海洋钻木生物侵害的防护方法提供了更加快速的替代方案，可快速评价处理方案的调整效果13。本快速实验室实验的结果旨在为木材新型改性工艺提供依据，并识别出具有天然抗蛀能力的木材种类。较低的取食率和蛀虫活力可能表明潜在产品的抗性增强，该信息可反馈给产业合作伙伴，以助其优化设计。本方法可实现产业界所期望的灵活快速响应；一旦筛选出有前景的产品，可进一步通过海洋试验结果予以补充验证。
蛀船虫 （Limnoria） 属于 Limnoriidae 科的等足类甲壳动物。该属包含 60 多个物种 Limnoria 全球范围内13,14,15，英国常见的有三个物种， 木虱属船蛆（Limnoria lignorum），三斑木虱（Limnoria tripunctata） 和 Limnoria quadripunctata16. 它们在浸没于海水中的木材表面钻凿隧道，常造成具有重要经济影响的破坏。蛀木水虱（gribbles）在英国沿海水域中数量丰富，且易于在实验室条件下培养，是研究海洋钻木无脊椎动物木材生物降解的理想生物。通过评估蛀木水虱在不同木材种类及木材防腐处理方法下的摄食速率与活力，可判断木材抗生物降解能力的有效性。以下方案基于Borges及其同事所描述的方法，建立了一种测定蛀木水虱摄食速率的标准方法。12,17此外，还简化了图像分析的引入过程，使非专业实验室也能操作。图像分析还可用于克服人工计数大量样本时的实际限制。根据英国标准 EN350-1:1994，长期海洋测试中的耐久性按以下等级评定 Pinus sylvestris 边材18在本文所述的短期实验室测试中，我们使用了欧洲赤松（Pinus sylvestris L）边材作为测试ekki心材的对照Lophira alata 山毛榉（Banks ex C.F Gaertn）Fagus sylvatica L），甜栗（欧洲栗 磨粉机）和松节油（Syngarpia glomulifera （Sm.）Nied）。以每种木材的八个重复样本中平均粪粒产量和活力作为耐久性的指标。我们提供了来自典型评估的示例数据，所用蛀木水虱物种为 Limnoria quadripunctata 以及一系列天然耐久的木材树种。 Limnoria quadripunctata，根据Menzies（1951）提供的检索表鉴定，被选为降解试验的最优物种，因为它是该科中研究最为充分的物种，并已被广泛确立为降解试验的模式物种。本方案也适用于测试经不同处理的木材，但对照组应采用同种木材的未处理重复样本。
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方案
1. 准备测试棒
- 完成所有处理步骤后，将干燥木材切割成尺寸为 2 mm × 4 mm × 20 mm 的测试小条（图 1）。在实验室条件下将小条风干至恒重。每种待测木材至少使用 5 个重复样本。
图1：用于短期实验室测试以评估蛀木水虱取食速率的试验木条。试验木条尺寸为 2 mm × 4 mm × 20 mm。从左至右：蚁木、松香、甜栗木和山毛榉心材以及苏格兰松边材。比例尺为 4 mm。请点击此处查看此图的放大版本。
- 真空浸渍
- 完成木材预处理（即切割和处理，如适用）后，将木条置于真空干燥器内的食品级塑料容器中，并放置于筛网下方，盖上盖子，确保通过涂抹真空脂实现严密密封（图2）。
- 在连接干燥器与泵的管路之间安装一个三通阀，并使第三条管路通向开放空气（图2）。确保三通阀与空气隔绝，启动泵，使真空干燥器内的真空度达到 -0.75 至 -1.0 bar，并维持该真空状态 45 分钟至 1 小时。
- 将第三条管路的开口端浸入盛有海水的容器中。关闭泵，并关闭通向泵的阀门，然后缓慢打开阀门，使海水在真空作用下被吸入干燥器内。让海水持续流入，直至充满塑料容器并高于筛网水平。
- 随后将管路从海水容器中抽出，使空气进入，直至干燥器恢复至大气压。保持木条在筛网下方浸没状态，直至其沉入塑料容器底部。
图2：在实验室取食实验中，用于将海水真空浸渍到木条中以供蛀木水虱取食的设备。 A）真空干燥器；B）泵；C）真空干燥器的压力表；D）通向真空干燥器、泵以及通向空气或海水（橙色管）的三通阀。请点击此处查看该图的放大版本。
- 木材浸提
- 将吸饱海水的试样棒浸没于盛装在50 mL离心管中的海水中（图3）。持续20天，定期更换海水。
注意：该浸提过程适用于所有受试实验木材，包括经处理或天然木材。
- 将吸饱海水的试样棒浸没于盛装在50 mL离心管中的海水中（图3）。持续20天，定期更换海水。
图3：实验室饲喂实验中用于喂食船蛆的木条浸出液制备。 将木条完全浸没于盛有海水的50 ml Falcon离心管中，并定期换水（1-3天），可产生明显着色的浸出液。从左至右分别为：栗木心材、松香、埃基木、山毛榉及欧洲赤松边材的浸出液。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 提取船蛆
- 从被侵染的木块中提取单个蛀木水虱标本。使用精细镊子和细小（000号/0.4 mm或更小）的画笔，用镊子小心掀开覆盖在蛀木水虱洞穴上的木屑。
注意：洞穴位于木头表面，可通过小孔识别（图4）。 - 暴露蛀木水虱后，用画笔从其下方轻轻挑起个体，并转移至盛有海水的培养皿中。在显微镜下检查蛀木水虱，以鉴定物种并确认提取过程中未造成损伤。
注意： pleopods（腹肢）的搏动是生命力的标志。- 弃去携带卵囊的雌性个体，因为怀卵雌性的摄食能力较弱。
图 4：蛀木水虱钻孔及两个典型通气孔的图像。 L. quadripunctata 在辐射松木条（尺寸为 2 mm × 4 mm × 20 mm）上形成的钻孔，钻孔入口旁可见两个较小的通气孔。比例尺为 2 mm。请点击此处查看此图的放大版本。
- 鉴定Limnoria quadripunctata
- 在体视显微镜下，通过观察动物尾节上呈方形排列的四个明显结节，以及第五腹节上呈X形的龙骨突，来鉴定Limnoria quadripunctata19（图5）。
图 5：Limnoria quadripunctata 的鉴别特征。在体视显微镜下以 20 倍放大倍率拍摄的 Limnoria quadripunctata 背面图像。红色箭头所示为 X 形脊线，蓝色箭头所示为尾节上的四个结节。比例尺为 1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
3. 准备孔板
- 在孔径为 20 mm 的多孔板中，每孔放置一根测试棒和 5 mL 未过滤的海水（盐度介于 32–35 PSU 之间）（图 6）。
- 将不同处理/木材种类在多孔板中系统化分布，确保每种类型的木材在每块板中至少出现一次。每孔加入一只蛀木水虱。
注意：对于 L. quadripunctata 物种，应将培养箱温度保持在 20 °C ± 2 °C 的稳定状态；若使用其他 Limnoria 物种，可相应调整温度以适应特定物种。 - 将多孔板置于持续黑暗条件下培养，因为光照周期对蛀木水虱的摄食速率无影响15。
图 6：船蛆取食实验的实验设置。 实验室测试船蛆取食速率所用12孔多孔板的示例。每个孔中包含5 ml海水和一根测试木条（20 mm × 4 mm × 2 mm），木材种类分别为苏格兰松边材、埃基硬木、山毛榉、甜栗木和松节油树心材。比例尺为20 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 收集和计数粪便颗粒并评估活力。
- 每周两次，将测试木条及每孔中的蛀船蛤（每个孔一只）从孔板中取出，转移至新准备的孔板中（每孔含5 mL海水 [32-35 PSU, 18-22 °C]）。
- 使用画笔轻轻刷去木条上的粪粒，再进行转移，并将刷下的粪粒保留在原孔中。
注意：在将蛀船蛤转移至新孔板前，可对其活力进行1-5级评估；1=死亡，2=无活性，不在木头上，3=活跃游动或胸肢摆动，但不在木头上，4=在木头表面爬行，5=已钻入木头内部。 - 图像处理
- 使用细画笔将粪粒团块分开，使单个粪粒清晰可见，并将粪粒从孔边缘轻轻刷离。在体视显微镜下以4倍放大倍数拍摄清晰照片，并上传至计算机（图7）。
注意：确保粪粒处于焦点范围内，背景均匀，水面无阴影或光线反射。
- 使用细画笔将粪粒团块分开，使单个粪粒清晰可见，并将粪粒从孔边缘轻轻刷离。在体视显微镜下以4倍放大倍数拍摄清晰照片，并上传至计算机（图7）。
图7：船蛆粪粒图像。 L. quadripunctata 在多孔板的一个孔中取食辐射松木材后产生的粪粒（细小、圆柱形、棕色颗粒）。放大倍数为4倍。图像未经处理，用于图像分析（见图7）。A）适用于在ImageJ中进行自动计数的图像示例。粪粒分布足够分散，且远离孔边缘。孔居中，无遮挡或反光。B）不适用于图像分析的图像示例。孔偏离中心，下半部分被截断。蓝色（虚线）圆圈显示水面反光。橙色（实线）圆圈显示粪粒聚集过密且过于靠近孔边缘。红色（虚线）圆圈显示未被移除的木屑。比例尺为10 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
- 使用 ImageJ 生成粪便颗粒计数的处理步骤。
- 从 https://imagej.nih.gov/ij/download.html 下载 ImageJ（截至 2021 年 8 月 3 日的最新版本为 1.8.0_172），或直接在计算机浏览器中运行。
- 通过拖放方式上传图像序列，或选择 文件 | 导入 | 图像序列 | 浏览。不更改任何参数，然后选择 确定。
- 接下来，使用圆形工具选中孔板底部含有粪便颗粒的区域。去除孔板边缘，选择 编辑 | 清除外部。将图像转换为二值图像，选择 处理 | 转为二值图。
- 通过选择 分析 | 设置尺度 进行校准，并根据图像设定每毫米对应的像素数（例如 10 像素 = 1 mm）。计数颗粒时选择 分析 | 分析颗粒。
- 在 大小（单位2） 旁边的输入框中，使用先前设定的单位尺度，选择与最小颗粒大小相同的下限阈值（例如，若 10 像素 = 1 mm，最小颗粒为 0.5 mm，则选择 5-无穷大）。
- 在 显示 下拉菜单中选择 轮廓，然后勾选 汇总 并点击 确定（图 8）。
注意：更多详细信息请参见 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
图8：在 ImageJ 中用于计数粪粒的流程示意图。A) 在 ImageJ 的文件选项卡中导入图像序列。B) “导入图像序列”对话框中的浏览按钮，用于从本地设备导入一系列图像。C) 使用圆形工具选择包含粪粒的区域。D) 编辑选项卡区域中的“清除外部”按钮，用于移除选定区域外的内容。E) 处理选项卡中的“转为二值”按钮。F) 分析选项卡中的“设定标尺”按钮。像素距离等于每单位测量长度（mm）所对应的像素数。G) 分析选项卡中的“分析粒子”按钮。大小（单位²）设置为粪粒大小的下限阈值（以像素为单位）至无穷大。选择“显示轮廓”和“汇总”。请点击此处查看该图的高清版本。
- 数据分析
- 将粪球数量转换为每日粪球数，以此作为摄食率的间接衡量指标。在蜕皮发生的当天，剔除所有蜕皮个体的数据（图9）。
注意：蜕皮过程持续1–3天，当观察到外骨骼完全蜕下时即可识别。
- 将粪球数量转换为每日粪球数，以此作为摄食率的间接衡量指标。在蜕皮发生的当天，剔除所有蜕皮个体的数据（图9）。
图9：船蛆蜕皮示例。在尺寸为 20 mm × 4 mm × 2 mm 的辐射松木材测试样条上观察到的船蛆（L. quadripunctata）蜕皮过程。蜕下的皮由红色圆圈标出。比例尺为 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
2020年11月开展了一项为期20天的L.quadripunctata摄食实验，使用了五种不同类型的木材（欧洲赤松（Pinus sylvestris L）边材，以及山毛榉（Fagus sylvatica L）、埃基木（Lophira alata Banks ex C. F Gaertn）、甜栗（Castanea sativa Mil）和亮果木（Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid）的心材）（见材料表）。每种木材设置八个重复样本，每根木棒上饲养一只Limnoria quadripunctata个体。所有蛀木水虱均来自英国朴茨茅斯大学海洋科学研究所水族馆中长期维持的种群，该种群定期从英格兰南海岸采集野生个体进行补充。实验前，动物已充分适应稳定且一致的培养条件。木材样本（20 mm × 4 mm × 2 mm）在实验开始前用海水浸泡两周。每个12孔板的孔中放入一只蛀木水虱、一根测试木棒和5 mL海水，并置于恒温培养箱中，保持20 °C（± ...
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讨论
在选择用于摄食实验的船蛆样本之前，应先对个体进行筛选以评估其适用性。由于个体大小差异，其摄食速率可能存在一定变异，因此应仅选择完全成熟的成体样本。 Borges 等人在 2009 年的研究中未检测到体长在 1.5 mm 至 3 mm 之间的个体在摄食速率上存在显著差异17。雌性 Limnoria 会孵育其卵，在此期间摄食速率降低，因此在筛选样本时应检查并剔除所有正在孵育的雌性个体。同样，处于蜕皮期的个体摄食速率也会降低21，因此在个体蜕皮当天的粪粒计数数据应予以剔除17。由于蜕皮过程持续超过一天，仅当在粪粒收集日观察到完整的外骨骼蜕皮时，才将其记为一次蜕皮事件。Limnoria 在挖掘洞道时会产生更多的粪粒，同时也会产生更多木屑（未被纳入粪粒的细小木质碎屑）。大量木屑的存在可能干扰粪粒的识别，但在自动计数前，可通过体视显微镜观察，使用移液器或细毛刷小心将其去除。 Alternatively, pellets can be counted manual...
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披露
作者与本研究无利益冲突。
致谢
感谢挪威研究理事会（奥斯陆地区基金，Alcofur rffofjor 269707）和朴茨茅斯大学（理学院博士研究奖学金）为露西·马丁的研究提供资金支持。同时感谢Gervais S. Sawyer提供了用于获得代表性结果的木材。松节油由不列颠哥伦比亚大学的Philip Evans教授提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔细胞培养板 | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50 ml Falcon管 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 可调体积移液器 | Fisher Scientific | FBE10000 | 1–10 ml |
| 山毛榉 | G. Sawyer（木材技术顾问） | Fagus sylvatica | 分类学权威：L |
| 非洲铁木（Ekki） | G. Sawyer（木材技术顾问） | Lophira alata | 分类学权威：Banks ex C. F. Gaertn. |
| 镊子 | Fisher Scientific | 10098140 | |
| 培养箱 | LMS LTD | INC5009 | |
| 微孔样品胶囊 | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 苏格兰松 | G. Sawyer（木材技术顾问） | Pinus sylvestris | 分类学权威：L. |
| 00000号画笔 | Hobby Craft | 5674331001 | 000号或0000号也可接受 |
| 甜栗木 | G. Sawyer（木材技术顾问） | Castanea sativa | 分类学权威：Mill |
| 松节油来源树种 | P. Evans（教授，不列颠哥伦比亚大学木材科学系） | Syncarpia glomulifera | 分类学权威：(Sm.) Nied. |
| 真空干燥器 | Fisher Scientific | 15544635 |
参考文献
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