方法文章

使用实时显微镜和开源软件对 阿斯珀吉卢斯尼杜兰 生长速度的定量分析

DOI：

10.3791/62778

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2021年7月24日

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1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

本文内容

摘要

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我们使用传输的光显微镜技术呈现一个无标签的实时成像协议，以捕获图像，分析和量化在水下培养物和固体介质中长丝真菌 A.尼杜兰的 生长动力学。此协议可与荧光显微镜配合使用。

摘要

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众所周知，通过比较菌落大小，在凝固介质上对长丝真菌的菌落生长进行宏观估计，主要取决于海眠/肌皮生长速度的变化。然而，在不同的环境/生长条件下（pH值、温度、碳和氮源、抗生素等）定量测量基因不同真菌株或菌株的生长速度是具有挑战性的。因此，为了更好地了解真菌细胞的生长，必须采用补充方法来量化生长动力学。此外，众所周知，丝状真菌，包括阿斯珀吉卢斯花，在固体介质或水下文化的亚空中条件下具有独特的生长和分化模式。在这里，我们详细介绍了一个定量的微观方法，用于分析模型真菌 阿斯珀吉卢斯尼杜兰的生长动力学，使用实时成像在水下文化和固体介质。我们使用开放源、免费的生物图像软件（例如斐济）以可重复和可靠的方式捕获不同真菌菌株的增长率，分析和量化其增长率，无需用户提供任何事先的图像分析专业知识。

引言

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丝状真菌具有重要的社会经济和生态重要性，作为工业/农业工具，酶和抗生素生产1，2和作物植物的病原体3，害虫昆虫4和人类3。此外，像阿斯珀吉卢斯尼杜兰这样的丝状真菌被广泛用作基础研究的模型生物体，如遗传学、细胞和进化生物学的研究，以及连字符延伸5的研究。纤维真菌是高度两极分化的生物体，通过膜脂质/蛋白质的连续供应和细胞壁在延伸尖端6的脱光合成而拉长。在直写尖端生长和极性维护中的核心作用是名为"斯皮琴科珀"（SPK）的专门结构，这是一种高度有序的结构，主要由细胞骨骼成分和Golgi6、7、8的极化分布组成。

环境刺激/信号，如水-空气接口，光，CO2 浓度和营养状况负责这些模具9的发展决定。在水下（液体）培养物中 ....

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方案

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1. 接种准备

注:所有步骤应在层压流柜下执行。

  1. 摆脱感兴趣的真菌菌株， 从使用无菌接种环的甘油库存 （-80 °C） 到最小介质 （MM） 板，辅以与所检查的菌株相关的适当营养要求 [MM: 10.0 g/L 葡萄糖，20 mL/L 盐溶液（盐溶液:26 克/升 KCl，26 克/升 MgSO4+7H2O， 76 克/升 KH2PO4， 2.0 mL/L 氯仿） 和 1 mL/L 微量元素 （微量元素: 40 毫克/L Na2B4O7•H2O， 400 毫克/升 CuSO4， 8 g/L ZnSO4， 800 毫克/升 MnSO4， 800 毫克/升 FEPO4）， 调整 pH 到 6.8 与 1 M NaOH， 添加 1 % （w/v） agar 和所需的补充， 如在 16和高压灭菌器中描述 ） （图 1）.
    注:盐溶液、微量元素溶液和补充剂是自动封条的。
  2. 在 37 °C 下孵育 2-3 天。
  3. 使用无菌牙签（或接种环），转移少量针叶， 通过轻....

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结果

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按照这个协议，我们捕获并分析了各种图像对应于不同生长/发育阶段的长丝真菌 A.尼杜兰。本研究中提供的数据是使用斐济软件进行处理和分析的。测量保存为 csv 文件，使用商业统计软件进行统计分析并准备为图形和/或 Python 编程语言使用软件库，如熊猫、笨重、统计模型、马图利布和海出生。更多详情可在引用的原始出版物中找到。

为了解释人口的反应，重要的是确定人口内关键参数的异质性，并有效地识别生理上不同的亚群28。图5显示了阿扎+ngnA+突变菌株的生长，在两个基因中带有缺失，其产物与WT菌株相比，与有毒植物产品L-azetidine-2-碳酸29的解毒和同化有关。测量它们在水下液体培养物中的生长速度，我们检测到双突变体的统计学显著较低增长率相比，WT菌株 （t （715） = 20.61， p = <0，0001） （图 5A-B.......

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讨论

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通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型是实时、定量和准确地评估细胞行为的有力方法，它能够确定特定的药物治疗和/或基因干预是否导致可检测到的细胞生长或表型差异。

在这项研究中，描述了一个可靠的活细胞成像方法来测量和定量分析真菌的发展，包括细菌管的动态和直肠尖生长在 A.尼杜兰。使用传输的光显微镜技术监测随着时间推移的形态变化，对于识别有压力、死亡或死亡的细胞非常有帮助。在单细胞一级详细了解这种动态过程，可以评估细胞混合种群中的异质性，从长远来看，可以确定细胞对内源和环境信号作出反应的途径和详细机制。

这种方法的一个优点是，它基于无标签成像方法（尽管如此，它很容易与荧光显微镜相结合），它使用细胞固有的光折射特性来创建图像对比度，而不引入染料/标签，这可能会混淆结果。虽然荧光标记可用于标记细胞室和蛋白质，并显著促进细胞的分割和跟踪，但传输的光显微镜规避了基因工程细胞的需求，使研究人员能够避免成本和耗时的染料/标签优化，并避免荧光成像13，34

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作部分得到了"希腊可视化和监测基本生物过程研究基础设施"项目（MIS 5002755）的支持，该项目是在"加强研究和创新基础设施"行动下实施的，该项目由"竞争力、创业和创新"业务方案（NSRF 2014-2020）资助，由希腊和欧盟共同资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-载玻片 8 孔Ibidi80826成像载玻片
4-氨基苯甲酸MerckA9878
azhAΔ ngnAΔ基因型： zhAΔ：:p yrGAf; ngnAΔ：:p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / 参考资料：实验室收藏，Athanasopoulos 等人，2013
Bacto 酪蛋白氨基酸Gibco223030
生物素MerckB4639
氯仿Merck67-66-3
硫酸铜 （II） 五水合MerckC8027
葡萄糖默克G8270
GraphPad 棱镜 8.0GraphPad 软件统计软件
ImageJNIH图像处理和分析软件
接种环默克I8263-500EA
磷酸铁默克1.03935
徕卡应用套件 X徕卡显微系统显微镜软件
七水硫酸镁默克63138
水硫酸锰默克M7899
显微镜 徕卡 TCS SP8徕卡显微系统
烟酰胺（烟酰胺）Supelco47865-U
蛋白胨Millipore68971
培养培养KISKERG090
氯化钾MerckP4504
磷酸二氢钾MerckP5655
盐酸吡哆MerckP6280
Quali - 微量离心管，1.7 mL，不含 DNase、RNase 和热原，无菌KISKERG052-S
Quali - 微量离心管，2.0 mL，无菌型 KISKERG053-SQuali
- 标准吸头，斜面，100-1000 和微量;LKISKERVL004G
Quali - 标准喷嘴，斜面，1-200 和微型;LKISKERVL700G
Quali 微量吸头，不含 DNase、RNase，0,1-10 µL/透明KISKERGC。技巧。B
核黄素 （B2）Supelco47861
手术刀刀片 NO. 11OdontoMed2011S2771
氯化钠默克S7653
氢氧化钠默克S8045
十水合四硼酸钠默克S9640
VS151（PilA-GFP 和 H1-mRFP）基因型： pyrG89;pilA：：sgfp：：AfpyrG+ argB2 nkuAΔ：：argB+ pyroA4 hhoA：：mrfp：：Afribo+ riboB2 / 参考资料：实验室收藏，Biratsi 等人，2021
WT基因型：nkuAΔ：：argB; pyrG89;pyroA4;pyrG89 / 参考资料：TN02A3 -FGSC A1149
酵母提取物Millipore70161
ZnSO4
物 一微生物皿 醇

参考文献

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  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.

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