我们介绍一种无需标记的活体成像方案，利用透射光显微技术对丝状真菌A. nidulans在液体培养和固体培养基中的生长动力学进行图像采集、分析与定量。该方案可与荧光显微镜技术联合使用。
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本文内容
摘要
摘要
众所周知，丝状真菌的菌落生长主要依赖于菌丝/菌丝体顶端生长速率的变化，通常通过比较固体培养基上菌落的大小来宏观估算。然而，对遗传背景不同的真菌菌株，或在不同环境/生长条件（如pH、温度、碳源和氮源、抗生素等）下的菌株，其生长速率进行定量测量仍具挑战性。因此，为了更深入理解真菌细胞的生长机制，迫切需要采用互补的方法来定量分析生长动力学。此外，已有充分研究表明，包括曲霉属（Aspergillus spp.）在内的丝状真菌，在固体培养基上的气生条件或液体 submerged 培养条件下，具有显著不同的生长与分化模式。本文详细描述了一种用于分析丝状真菌生长动力学的定量显微镜方法 模式真菌 Aspergillus nidulans，利用浸没培养和固体培养基中的活体成像技术。我们采用开源免费的生物图像分析软件（例如 Fiji），以可重复且可靠的方式捕获图像，并对不同真菌菌株的生长速率进行分析与定量，该方法无需用户具备任何前期图像分析经验。
引言
丝状真菌具有重要的社会经济和生态价值，在工业和农业中作为酶和抗生素生产的关键工具1,2 以及作为农作物病原体3，害虫4 和人类3此外，丝状真菌如 曲霉属 nidulans 被广泛用作基础研究的模式生物，例如遗传学、细胞生物学和进化生物学研究，以及菌丝延伸的研究5丝状真菌是一类高度极性的生物体，通过持续供应膜脂质/蛋白质以及 从头合成 细胞延伸尖端的细胞壁合成6在菌丝顶端生长和极性维持中起核心作用的是一种称为“Spitzenkörper”（SPK）的特殊结构，该结构高度有序，主要由细胞骨架组分构成，并含有高尔基体的极性分布6,7,8.
环境刺激/信号，如水-空气界面、光照、CO2浓度以及营养状态，是决定这些霉菌发育命运的关键因素9。在液体培养条件下，A. nidulans的分化受到抑制，菌体通过菌丝顶端延伸进行生长6。在营养生长期，无性孢子（分生孢子）通过顶端伸长萌发，形成相互连接的菌丝细胞网络，即菌丝体；只要营养和空间充足，菌丝体可无限生长。相反，在固体培养基上，菌丝顶端延伸，并在经历一段特定的营养生长期（发育能力期）后，启动无性繁殖过程，菌丝体的特化足细胞会向上延伸出气生的分生孢子梗 stalk6。这些结构进一步发育为称为分生孢子梗的特化多细胞发育结构，产生大量成串的单倍体分生孢子10，在适宜的环境条件下可重新启动生长。
测量丝状真菌生长的一种常用方法是将孢子接种于培养皿中的营养琼脂上，数天后通过肉眼测量菌落的直径11。菌落的直径或面积主要取决于菌丝生长速率的变化，而较少受分生孢子梗密度的影响12，因此常被用作生长的量化指标。尽管测量固体表面真菌群体（菌落）大小的方法已较为充分，但它绝非最精确的生长测定手段。与群体水平的平均值（即真菌菌落大小的平均值）相比，单细胞 测量能够捕捉细胞群体的异质性，并有助于识别新的细胞亚群、细胞状态13、动态变化、通路以及细胞响应内源性和环境变化的生物学机制14,15。通过延时显微镜监测真菌细胞的生长与表型，可以说是目前应用最广泛的定量单细胞观察方法。
本文详细介绍了一种无需标记的活体成像方案，利用透射光显微镜技术（如相差显微镜、微分干涉差显微镜（DIC）和偏光显微镜）进行图像采集。该方法无需结合荧光显微镜，即可用于分析和定量测定A. nidulans菌株在液体培养和固体培养基中的极性生长情况。
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方案
1. 接种体制备
注意：所有步骤均应在超净工作台内进行。
- 从甘油保存液（-80 ℃）中划线接种目标真菌菌株 °C）使用无菌接种环，将菌种接种至添加了与所检菌株相应的适当营养成分的最小培养基（MM）平板上 [MM：10.0 g/L 葡萄糖，20 mL/L 盐溶液（盐溶液：26 g/L KCl，26 g/L MgSO₄·7H₂O，52 g/L NaNO₃，170 g/L 蔗糖），1 mL/L 微量元素溶液（微量元素溶液：4.4 g/L FeSO₄·7H₂O，1.1 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.7 g/L H₃BO₃，0.5 g/L MnCl₂·4H₂O，0.5 g/L CuSO₄·5H₂O，0.2 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.1 g/L CoCl₂·6H₂O，50 g/L EDTA 二钠），pH 6.5]4·7H2O, 76 g/L KH2PO4，2.0 mL/L 氯仿）和 1 mL/L 微量元素（微量元素：40 mg/L Na2B4O7·H2O，400 mg/L CuSO₄4，8 g/L ZnSO₄4，800 mg/L MnSO₄4，800 mg/L FePO4），用 1 M NaOH 将 pH 调至 6.8，加入 1 %（w/v）琼脂及所需补充成分，具体如所述16 和高压灭菌] (图1).
注意：盐溶液、微量元素溶液和添加剂需进行高压灭菌。 - 在37℃下孵育2-3天 °C.
- 使用无菌牙签（或接种环），轻轻接触单个菌落，转移少量分生孢子至完全培养基（CM）平板中（CM：10.0 g/L 葡萄糖，2.0 g/L 胰蛋白胨，1.0 g/L 酵母提取物，1.0 g/L 酪蛋白氨基酸，20 mL/L 盐溶液，1 mL/L 微量元素溶液，5 mL/L 维生素溶液（维生素溶液：0.1 g/L 核黄素，0.1 g/L 烟酰胺，0.01 g/L 对氨基苯甲酸，0.05 g/L 盐酸吡哆醇，1.0 mg/L 生物素），用 1 M NaOH 调节 pH 至 6.8，加入 1% (w/v) 琼脂及所需补充成分，具体如所述16 和高压灭菌]。将维生素溶液高压灭菌后，置于暗瓶中，4 ℃保存 °C.
注意：若真菌生长过于密集而无法识别和分离单个菌落，需重新划线接种至新的琼脂平板以获得单菌落。 - 在37℃下孵育3-4天 °C.
- 获得约 2 x 106 细胞/mL，使用无菌牙签刮取 CM 琼脂平板上培养的产孢真菌菌落表面 1 cm 范围内的孢子图 S1).
注意：必要时，使用血细胞计数板对分生孢子进行计数。 - 收集分生孢子 A. nidulans 在无菌的1.5 mL离心管中，加入含有0.05%（v/v）Tween 80的1.0 mL高压灭菌蒸馏水，以减少分生孢子团块的数量。
注意：分生孢子可在 4 ℃ 保存长达 2–3 周 °C，且无明显活力损失（A. Athanasopoulos 和 V. Sophianopoulou，未发表数据）。然而，建议过滤和/或洗涤分生孢子悬液以去除菌丝片段和营养物质，从而防止分生孢子膨胀。
2. 准备用于成像在琼脂（固体）培养基上生长的丝状真菌
注意：采用“倒置琼脂法”的改良版本17,18。
- 最初，点样10 µ剧烈涡旋后的分生孢子悬液（约 2 x 104 细胞/mL）分装至多个培养皿中（Ø9 cm）含1%（w/v）琼脂的MM培养基15 mL图2).
注意：使用改良版“倒置琼脂法”，可在对生长中的菌丝无明显不利影响的情况下，对真菌样品进行长达数小时的成像。 - 根据拟研究的发育阶段孵育实验培养物。
- 切下一块 ≈0.8 mm2 使用无菌手术刀切取含有菌落的琼脂块。
注意：所切琼脂块的尺寸取决于后续放置设备的尺寸。在本研究中，采用8孔 µ-使用载玻片（见下文）。 - 倒置并将琼脂块放入孔板的一个孔中 µ- 适用于活体成像的八孔盖玻片或类似的带盖玻片的载玻片
注意：如果透射光显微镜将与荧光（标记）显微镜结合使用，可在成像前将琼脂块倒置在含有活细胞染色染料的液体培养基液滴上。
3. 液体培养基中丝状真菌成像前的准备
- 取10 µL充分涡旋振荡的分生孢子悬液（约2 x 104 个细胞/mL），加入含有200 µL适当添加物（见上文）的液体MM培养基的8孔µ载玻片孔中。
- 在所需温度下孵育至所需时间（图3）。
注意：若需将透射光显微镜与荧光（标记）显微镜结合使用，液体培养具有显著优势，可在实验过程中的任意时间点加入荧光染料19。
4. 采集图像
注意：显微镜的选择取决于可用的设备。无论何种情况，显微镜装置都应包含倒置载物台、环境控制室，或至少配备精确控制空气温度的房间。
- 将恒温显微镜腔室预热至 37 °C（除非另有说明或根据所用真菌种类的需要进行调整），以在开始前稳定温度。该腔室可在延时实验期间调节显微镜光学系统和样品载物台的温度。需注意，当在 37 °C 或更高温度下使用常规浸油（设计用于 23 °C）时，会引入光学像差20。
注意：若预算有限，可使用纸板和隔热包装材料21 或 3D 打印机22 自制培养腔室。 - 打开显微镜、扫描仪电源、激光电源和计算机，启动成像软件。将先前制备的 µ载片放入显微镜载物台并调焦。
- 选择包含孤立且不重叠（或至少不过于密集）细胞的视野，以便在图像分析过程中便于测量生长情况。每个样品至少采集 50 个正在生长的细胞 ，以确保统计分析的可靠性。
- 选择所需的透射光显微成像方式。为尽量减少真菌细胞的光漂白，应降低曝光时间或激光功率、像素驻留时间，和/或增大针孔直径，具体方法如其他文献所述23,24。
- 设置显微镜以按所需时间间隔采集图像，并开始时间序列图像采集。
注意：为校正随时间发生的焦平面漂移（尤其在长时间实验中），由于热漂移、细胞大小差异及细胞运动，若显微镜软件支持，应采用自动对焦策略 。
5. 图像分析
注意：本节介绍处理延时显微镜图像以测量构巢曲霉（A. nidulans）生长速率的关键步骤。图像的打开、可视化和处理均使用开源软件 ImageJ/Fiji25 完成。
- 使用 Fiji 导入图像 插件 | Bio-Formats | Bio-Formats 导入器 从 Fiji 菜单中使用默认设置（图4A).
注意：检查 Bio-Formats Importer 是否正确识别图像标定。图像窗口上方信息栏中显示的图像尺寸必须与原始图像尺寸一致图4B）。按压 Shift + P 在 ImageJ/Fiji 软件中显示和更改图像属性。 - 在需要时，使用直方图匹配26 用于不同帧之间的照明校正（图像 | 调整 | 漂白校正 | 直方图匹配) (图4C).
- 在需要时，使用 SIFT 算法（插件 | 配准 | 使用 SIFT 进行线性堆栈对齐用于对齐或匹配图像堆栈的）图 4D）。选择 "众所周知，丝状真菌的菌落生长主要依赖于菌丝/菌丝体顶端生长速率的变化，通常通过比较固体培养基上菌落的大小来宏观估算。然而，对遗传背景不同的真菌菌株或在不同环境/生长条件（如pH、温度、碳源和氮源、抗生素等）下的菌株进行生长速率的定量测量仍具挑战性。因此，为了更深入理解真菌细胞的生长机制，迫切需要开发互补的方法来量化生长动力学。此外，已有研究明确指出，包括曲霉属（Aspergillus spp.）在内的丝状真菌在固体培养基上的气生条件或液体培养中表现出截然不同的生长与分化模式。本文详细描述了一种定量显微分析方法，用于研究模式真菌构巢曲霉（Aspergillus nidulans）在液体培养和固体培养条件下的生长动力学，结合活体成像技术进行分析。我们利用开源免费的生物图像分析软件（如Fiji），以可重复且可靠的方式采集图像，并对不同真菌菌株的生长速率进行分析与量化，该方法无需使用者具备图像分析的专业背景。" 从预期的变换菜单中进行校正应足以消除任何x-y方向的漂移。
注意：也可使用其他插件对图像切片序列进行对齐，例如 Image Stabilizer（https://imagej.net/Image_Stabilizer） 或 StackReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）。 - 选择与盖玻片平行生长的菌丝，避免倾斜的菌丝。务必选择通过极性延伸方式生长的菌丝，避免存在侧向和/或顶端分枝的菌丝。
- 使用 MTrackJ（插件 | MTrackJ）插件追踪生长中的菌丝尖端（图 4E)27. 添加轨迹，请选择 添加 在工具栏中点击按钮，使用鼠标左键在菌丝尖端放置第一个点。时间序列将自动跳转到下一帧。要完成追踪过程，请在最后一个点处双击鼠标（或按下 Esc 键）图4F). 移动到初始时间帧中的另一个感兴趣区域（即正在生长的菌丝尖端），并通过测量另一根菌丝的生长速率重新开始该操作流程。
注意：要安装 MTrackJ，请遵循 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 上提供的说明 - 点击 测量 MTrackJ 对话框中的按钮图 4G）以打开输出表格。保存轨迹测量值（文件 | 另存为）为所需的文件格式（例如，csv），进行分析并绘图（图4H).
注意：通过选择 视频 按钮，可生成显示图像和轨迹进展的视频。
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结果
按照本实验方案，我们采集并分析了丝状真菌A. nidulans在不同生长/发育阶段的多种图像。本研究中呈现的数据使用Fiji软件进行处理和分析。测量结果以csv文件格式保存，并使用商业统计软件和/或Python编程语言（借助pandas、numpy、statsmodels、matplotlib和seaborn等软件库）进行统计分析并绘制成图表。更多细节可参见所引用的原始出版物。
为了阐释种群的响应机制，确定种群内关键参数的异质性，并有效识别生理学上不同的亚群至关重要28。图5展示了azhAΔ ngnAΔ双突变菌株的生长情况，该菌株缺失了两个基因，其编码产物参与有毒植物代谢产物L-氮杂环丁烷-2-羧酸解毒与同化过程29，并与野生型（WT）菌株进行了比较。通过测定其在液体深层培养中的生长速率，我们发现双突变菌株的生长速率显著低于野生型菌株（t(715) = 20.61，p = &...
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讨论
通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型，是一种强大的方法，可用于实时评估细胞行为，并定量、准确地确定特定药物处理和/或遗传干预是否随时间产生可检测的细胞生长或表型差异。
本研究描述了一种可靠的活细胞成像方法，用于测量和定量分析真菌的发育过程，包括 A. nidulans中芽管和菌丝尖端生长的动态变化。利用透射光显微镜技术对形态变化进行时间序列监测，有助于识别处于应激、濒死或死亡状态的细胞。在单细胞水平上深入了解这些动态过程，不仅能够评估混合细胞群体内的异质性，而且从长期角度来看，还有助于揭示细胞响应内源性和环境信号的通路及详细机制。
该方法的一个优势在于其基于无标记成像技术（但也可轻松结合荧光显微镜使用），利用细胞固有的光折射特性产生图像对比度，无需引入染料或标记物，从而避免对实验结果造成干扰。尽管荧光标记可用于标记细胞区室和蛋白质，并显著促进细胞的分割与追踪，但透射光显微镜避免了对细胞进行基因工程改造的需要，使研究人员能够省去染料/标记物优化过程中所需的成本和耗时，同时规避可能由光毒性引起的效应 来...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由以下项目资助 "一个用于可视化和监测基本生物过程的希腊研究基础设施（BioImaging-GR）" （MIS 5002755）在行动下实施 "加强研究与创新基础设施"，由运营计划资助 "竞争力、创业与创新" （2014–2020 年国家研究与创新基金）由希腊和欧盟共同资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-载玻片 8 孔 | Ibidi | 80826 | 成像载玻片 |
| 4-氨基苯甲酸 | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | 基因型：zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / 参考文献：实验室保藏，Athanasopoulos 等，2013 | ||
| 蛋白胨氨基酸 | Gibco | 223030 | |
| 生物素 | Merck | B4639 | |
| 氯仿 | Merck | 67-66-3 | |
| 硫酸铜五水合物 | Merck | C8027 | |
| 葡萄糖 | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | 统计分析软件 | |
| ImageJ | NIH | 图像处理与分析软件 | |
| 接种环 | Merck | I8263-500EA | |
| 磷酸铁(III) | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | 显微镜软件 | |
| 七水合硫酸镁 | Merck | 63138 | |
| 一水合硫酸锰(II) | Merck | M7899 | |
| Leica TCS SP8 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | ||
| 烟酰胺（尼克酰胺） | Supelco | 47865-U | |
| 蛋白胨 | Millipore | 68971 | |
| 微生物培养用培养皿 | KISKER | G090 | |
| 氯化钾 | Merck | P4504 | |
| 磷酸二氢钾 | Merck | P5655 | |
| 盐酸吡哆醇 | Merck | P6280 | |
| Quali - 微量离心管，1.7 mL，无 DNase、RNase 和热原，无菌 | KISKER | G052-S | |
| Quali - 微量离心管，2.0 mL，无菌 | KISKER | G053-S | |
| Quali - 标准吸头，斜面，100–1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - 标准吸头，斜面，1–200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali 微量吸头，无 DNase、RNase，0.1–10 µL/透明 | KISKER | GC.TIPS.B | |
| 核黄素（B2） | Supelco | 47861 | |
| 11 号手术刀片 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| 氯化钠 | Merck | S7653 | |
| 氢氧化钠 | Merck | S8045 | |
| 十水合四硼酸钠 | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP 和 H1-mRFP) | 基因型：pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / 参考文献：实验室保藏，Biratsi 等，2021 | ||
| 野生型（WT） | 基因型：nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / 参考文献：TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| 酵母提取物 | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
参考文献
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