使用活体显微镜和开源软件对Aspergillus nidulans生长速率进行定量分析

摘要

我们介绍一种无需标记的活体成像方案，利用透射光显微技术对丝状真菌A. nidulans在液体培养和固体培养基中的生长动力学进行图像采集、分析与定量。该方案可与荧光显微镜技术联合使用。

摘要

众所周知，丝状真菌的菌落生长主要依赖于菌丝/菌丝体顶端生长速率的变化，通常通过比较固体培养基上菌落的大小来宏观估算。然而，对遗传背景不同的真菌菌株，或在不同环境/生长条件（如pH、温度、碳源和氮源、抗生素等）下的菌株，其生长速率进行定量测量仍具挑战性。因此，为了更深入理解真菌细胞的生长机制，迫切需要采用互补的方法来定量分析生长动力学。此外，已有充分研究表明，包括曲霉属（Aspergillus spp.）在内的丝状真菌，在固体培养基上的气生条件或液体 submerged 培养条件下，具有显著不同的生长与分化模式。本文详细描述了一种用于分析丝状真菌生长动力学的定量显微镜方法 模式真菌 Aspergillus nidulans，利用浸没培养和固体培养基中的活体成像技术。我们采用开源免费的生物图像分析软件（例如 Fiji），以可重复且可靠的方式捕获图像，并对不同真菌菌株的生长速率进行分析与定量，该方法无需用户具备任何前期图像分析经验。

引言

丝状真菌具有重要的社会经济和生态价值，在工业和农业中作为酶和抗生素生产的关键工具^1,2 以及作为农作物病原体³，害虫⁴ 和人类³此外，丝状真菌如 曲霉属 nidulans 被广泛用作基础研究的模式生物，例如遗传学、细胞生物学和进化生物学研究，以及菌丝延伸的研究⁵丝状真菌是一类高度极性的生物体，通过持续供应膜脂质/蛋白质以及 从头合成 细胞延伸尖端的细胞壁合成⁶在菌丝顶端生长和极性维持中起核心作用的是一种称为“Spitzenkörper”（SPK）的特殊结构，该结构高度有序，主要由细胞骨架组分构成，并含有高尔基体的极性分布^6,7,8.

环境刺激/信号，如水-空气界面、光照、CO₂浓度以及营养状态，是决定这些霉菌发育命运的关键因素

方案

1. 接种体制备

注意：所有步骤均应在超净工作台内进行。

1. 从甘油保存液（-80 ℃）中划线接种目标真菌菌株 °C）使用无菌接种环，将菌种接种至添加了与所检菌株相应的适当营养成分的最小培养基（MM）平板上 [MM：10.0 g/L 葡萄糖，20 mL/L 盐溶液（盐溶液：26 g/L KCl，26 g/L MgSO₄·7H₂O，52 g/L NaNO₃，170 g/L 蔗糖），1 mL/L 微量元素溶液（微量元素溶液：4.4 g/L FeSO₄·7H₂O，1.1 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.7 g/L H₃BO₃，0.5 g/L MnCl₂·4H₂O，0.5 g/L CuSO₄·5H₂O，0.2 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.1 g/L CoCl₂·6H₂O，50 g/L EDTA 二钠），pH 6.5]₄·7H₂O, 76 g/L KH₂PO₄，2.0 mL/L 氯仿）和 1 mL/L 微量元素（微量元素：40 mg/L Na₂B₄O₇·H₂O，400 mg/L CuSO₄₄，8 g/L ZnSO₄₄，800 mg/L MnSO₄₄，800 mg/L ....

结果

按照本实验方案，我们采集并分析了丝状真菌A. nidulans在不同生长/发育阶段的多种图像。本研究中呈现的数据使用Fiji软件进行处理和分析。测量结果以csv文件格式保存，并使用商业统计软件和/或Python编程语言（借助pandas、numpy、statsmodels、matplotlib和seaborn等软件库）进行统计分析并绘制成图表。更多细节可参见所引用的原始出版物。

为了阐释种群的响应机制，确定种群内关键参数的异质性，并有效识别生理学上不同的亚群至关重要²⁸。图5展示了azhAΔ ngnAΔ双突变菌株的生长情况，该菌株缺失了两个基因，其编码产物参与有毒植物代谢产物L-氮杂环丁烷-2-羧酸解毒与同化过程²⁹，并与野生型（WT）菌株进行了比较。通过测定其在液体深层培养中的生长速率，我们发现双突变菌株的生长速率显著低于野生型菌株（t(715) = 20.61，p = &.......

讨论

通过延时显微镜监测真菌细胞生长和表型，是一种强大的方法，可用于实时评估细胞行为，并定量、准确地确定特定药物处理和/或遗传干预是否随时间产生可检测的细胞生长或表型差异。

本研究描述了一种可靠的活细胞成像方法，用于测量和定量分析真菌的发育过程，包括 A. nidulans中芽管和菌丝尖端生长的动态变化。利用透射光显微镜技术对形态变化进行时间序列监测，有助于识别处于应激、濒死或死亡状态的细胞。在单细胞水平上深入了解这些动态过程，不仅能够评估混合细胞群体内的异质性，而且从长期角度来看，还有助于揭示细胞响应内源性和环境信号的通路及详细机制。

该方法的一个优势在于其基于无标记成像技术（但也可轻松结合荧光显微镜使用），利用细胞固有的光折射特性产生图像对比度，无需引入染料或标记物，从而避免对实验结果造成干扰。尽管荧光标记可用于标记细胞区室和蛋白质，并显著促进细胞的分割与追踪，但透射光显微镜避免了对细胞进行基因工程改造的需要，使研究人员能够省去染料/标记物优化过程中所需的成本和耗时，同时规避可能由光毒性引起的效应 来.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-载玻片 8 孔	Ibidi	80826	成像载玻片
4-氨基苯甲酸	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			基因型：zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / 参考文献：实验室保藏，Athanasopoulos 等，2013
蛋白胨氨基酸	Gibco	223030
生物素	Merck	B4639
氯仿	Merck	67-66-3
硫酸铜五水合物	Merck	C8027
葡萄糖	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		统计分析软件
ImageJ	NIH		图像处理与分析软件
接种环	Merck	I8263-500EA
磷酸铁(III)	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		显微镜软件
七水合硫酸镁	Merck	63138
一水合硫酸锰(II)	Merck	M7899
Leica TCS SP8 共聚焦显微镜	Leica Microsystems
烟酰胺（尼克酰胺）	Supelco	47865-U
蛋白胨	Millipore	68971
微生物培养用培养皿	KISKER	G090
氯化钾	Merck	P4504
磷酸二氢钾	Merck	P5655
盐酸吡哆醇	Merck	P6280
Quali - 微量离心管，1.7 mL，无 DNase、RNase 和热原，无菌	KISKER	G052-S
Quali - 微量离心管，2.0 mL，无菌	KISKER	G053-S
Quali - 标准吸头，斜面，100–1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - 标准吸头，斜面，1–200 µL	KISKER	VL700G
Quali 微量吸头，无 DNase、RNase，0.1–10 µL/透明	KISKER	GC.TIPS.B
核黄素（B2）	Supelco	47861
11 号手术刀片	OdontoMed2011	S2771
氯化钠	Merck	S7653
氢氧化钠	Merck	S8045
十水合四硼酸钠	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP 和 H1-mRFP)			基因型：pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / 参考文献：实验室保藏，Biratsi 等，2021
野生型（WT）			基因型：nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / 参考文献：TN02A3 -FGSC A1149
酵母提取物	Millipore	70161
ZnSO4