通过流式细胞术进行质量控制的痰液分析

摘要

本方案描述了一种将痰液高效解离为单细胞悬液的方法，以及在标准流式细胞术平台上对细胞亚群进行后续表征的技术。

摘要

痰液常用于研究肺部细胞成分及其他微环境特征，以评估肺部健康状况，传统上采用基于细胞学的方法进行分析。这种方法的应用受到限制，因为读片过程耗时较长，且需要高度专业化的人员。此外，样本中常含有大量碎片以及过多的鳞状上皮细胞（SECs）或口腔颊细胞，导致许多样本不适合用于诊断。相比之下，流式细胞术能够高通量地对细胞群体进行表型分析，同时有效排除碎片和鳞状上皮细胞。

本文介绍了一种高效的方法，用于将痰液解离为单细胞悬液，对细胞群体进行抗体染色和固定，并在流式细胞术平台上获取样本。文中提供了一种设门策略，用于排除碎片、死细胞（包括唾液上皮细胞，SECs）以及细胞双联体。此外，本研究还解释了如何基于分化簇（CD）45阳性与阴性细胞群，对存活的单个痰液细胞进行分析，以鉴定造血系和上皮系细胞亚群。通过鉴定肺特异性巨噬细胞作为样本来源于肺部而非唾液的证据，本文还提供了质量控制的评估方法。最后，本文通过在同一患者样本上使用三种不同的流式细胞仪——Navios EX、LSR II 和 Lyric——获得的痰液分析图谱，证明该方法可适用于多种细胞计量平台。此外，该方案还可根据需要进行修改，以纳入其他感兴趣的细胞标志物。本文所提出的在流式细胞术平台上分析完整痰液样本的方法，使痰液样本更适用于开发肺部疾病的高通量诊断技术。

引言

流式细胞仪在硬件和软件方面的技术进步使得同时鉴定多种不同细胞群体成为可能^1,2,3,4。例如，在造血细胞研究中应用流式细胞仪，极大地促进了人们对免疫系统²以及造血系统细胞层级结构⁵的理解，并有助于多种不同类型血液肿瘤的诊断鉴别^6,7,8。尽管大多数痰液细胞来源于造血系统^9,10,11，但流式细胞术尚未被广泛应用于痰液分析以实现诊断目的。然而，已有若干研究表明，对痰液中免疫细胞群体（最主要的细胞亚群）进行评估，可能在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病的诊断和/或监测中具有重要价值^12,13,14,15。此外，由于存在可用于流式细胞术的上皮特异性标志物，使得研究痰液中另一主要细胞亚群——肺上皮细胞——成为可能。

除了能够分析来自不同组织来源的多种不同细胞群体外，流式细胞仪还能在相对较短的时间内评估大量细胞。相比之下，基于载玻片的细胞学分析通常需要高度专业化的人员和/或设备，且这类分析劳动强度较大，导致仅能对痰液样本的一部分进行分析¹⁶。

痰液在流式细胞术中的广泛应用受到三个关键问题的限制。第一个问题是痰液的采集。痰液通过用力咳嗽的方式从肺部排出黏液至口腔，随后吐入采集杯中。由于黏液经过口腔，因此存在较高的口腔上皮细胞（SEC）污染风险。这种污染会增加样本分析的复杂性，但如本研究所示，该问题在流式细胞术平台上可轻易得到纠正。

并非所有人都能自然咳出痰液，因此已开发出多种设备以无创方式辅助痰液采集¹⁷。雾化器就是其中一种设备，已被证明可产生可靠的痰液样本^18,19,20。尽管雾化器是一种非常有效的无创痰液采集方法，但其使用仍需在配备专业人员的医疗机构环境中进行²¹。相比之下，手持式设备如肺笛^22,23,24和Acapella^16,25由于操作简便，可在家中使用。这些辅助设备均具有良好的安全性和成本效益。

对我们而言，Acapella 装置的效果始终优于肺笛（lung flute）¹⁶，因此选择使用 Acapella 装置进行痰液采集。采集时长定为连续3天，因为使用痰液的主要目的是开发肺癌检测方法¹⁶。已有研究表明，与1天或2天的样本相比，3天样本可提高肺癌检出的可能性^26,27,28。然而，针对不同研究目的，其他痰液采集方法可能更为合适。若采用与本文所述不同的痰液采集方法，建议仔细优化流式细胞术分析中所用的每种抗体或染料的浓度；目前关于不同痰液采集方法如何影响流式细胞术靶向蛋白的数据仍十分有限。

第二个抑制痰液用于诊断（主要与流式细胞术相关）热情的问题是细胞数量。其难点在于收集到足够数量的活细胞，以进行可靠的分析。两项研究表明，通过无创方法并在辅助装置帮助下收集的痰液样本含有足够数量的活细胞，可用于临床诊断或科研研究^16,24。然而，这两项研究均未涉及流式细胞术对细胞数量的具体要求问题。

本方案所依据的研究中，根据各研究地点批准的机构指南，从肺癌高风险人群参与者中收集痰液样本。高风险参与者定义为年龄在55至75岁之间，吸烟史达30包年，且在过去15年内未戒烟者。研究人员按照制造商说明²⁹指导患者如何使用acapella装置，并在家中连续三天收集痰液样本。样本在最后一次收集前需保存在冰箱中。在最后一天收集后，样本连同冷冻冰袋通过隔夜快递运送至实验室。样本在收到当日即被处理为单细胞悬液。采用此种痰液采集方法，可获得足够数量的活细胞，用于可靠的流式细胞术分析。

最后，与前述细胞数量问题相关的是如何将痰液中的细胞从其黏液环境中释放出来。如何保持细胞活性，并制备出不会堵塞流式细胞仪的单细胞悬液？本方案基于Pizzichini等³⁰和Miller等³¹的初步研究，描述了一种简便且可靠的痰液处理方法，可将痰液制备成适用于流式细胞术分析的单细胞悬液。该方法依据流式细胞术中已确立的指南^32,33,34，建立了高效的抗体标记策略，用于鉴定痰液中的造血细胞和上皮细胞，并提供了仪器设置、质量控制措施以及数据分析指南，从而在流式细胞术平台上实现痰液分析的标准化。

方案

痰液处理的所有步骤均须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

1. 开始痰液解离前的试剂准备

1. 将1%多聚甲醛（PFA）按每份样品25 mL在冰上解冻，并保持低温直至使用。
   注意：PFA经吸入或皮肤接触具有毒性。请按照制造商说明配制固定液，并分装为25 mL后于-20 °C保存，直至使用。
2. 估算样品重量，并解冻足量的0.1%二硫苏糖醇（DTT）用于步骤2.2，将其升温至37 °C。（DTT分装液应在使用前于-20 °C保存。）
3. 将足量的0.5% N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）升温至37 °C，用于步骤2.2。（NAC应每周新鲜配制，并在使用前于4 °C保存。）

2. 痰液解离

1. 称取痰液样本的重量，以确定解离试剂的体积。
   注意：若初始重量 ≤3 g，则视为小样本；若 >3 g 但 ≤8 g，则视为中等样本；若 >8 g 但 ≤16 g，则视为大样本；若样本重量 >16 g，则视为超大样本。在整个实验方案中，将使用“小”、“中等”、“大”和“超大”来指代样本大小。解离和标记所需的试剂量根据痰液样本的大小而有所不同。
2. 将小样本转移至洁净的 50 mL 圆锥形管中，中等样本转移至洁净的 250 mL 塑料一次性瓶中，大或超大样本转移至洁净的 500 mL 塑料一次性瓶中。每克样本重量加入 1 mL 的 0.5% NAC 和 4 mL 的 0.1% DTT。
3. 以最大速度涡旋振荡 15 秒，然后在室温下以最大速度摇动 15 分钟。
4. 用四倍体积的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）（基于样本 + 试剂的总体积）稀释样本，以中和 NAC 和 DTT；以最大速度快速涡旋振荡，然后在室温下以最大速度摇动 5 分钟。
5. 将细胞悬液通过 100 µm 尼龙网细胞滤器过滤至一个或多个 50 mL 圆锥形离心管中，以制备单细胞悬液。
6. 在 4 °C 下以 800 x g 离心 10 分钟。吸除上清液，将所有沉淀合并至一个 15 mL 圆锥形管中，然后使用相同条件用 HBSS 洗涤沉淀。
7. 根据痰液样本的初始重量，将细胞沉淀重悬于相应体积的缓冲液中。
   注意：小样本用 250 µL HBSS 重悬；中等样本用 760 µL HBSS 重悬；大和超大样本用 1460 µL HBSS 重悬。
8. 取部分细胞悬液，使用台盼蓝进行活/死细胞计数。
   注意：对于小样本，取 5 µL；对于中等、大或超大样本，取 10 µL。用 HBSS 按 1:10 稀释。
   1. 将 10 µL 痰液稀释液与 30 µL 0.4% 台盼蓝混合，使最终样本稀释度为 1:40。将混合液加入血细胞计数板的计数室中进行细胞计数。
      注意：若细胞数量过低或过高而无法获得准确计数，可能需要调整最终稀释度。强烈建议参考 Guiot 等人²⁰ 的方法，以正确区分痰液细胞与上皮细胞（SECs）及碎片。这对于获得准确的细胞计数至关重要。
9. 从超大样本中取出 50 x 10⁶ 个细胞，转移至新管中，并加入足够的 HBSS，使总体积达到 1700 µL。
   ​注意：在后续实验步骤中，将此样本视为大样本。剩余样本可丢弃或用于其他用途。

3. 抗体与活率染料染色

1. 抗体和染色染料的选择
   注意：表1 列出了本实验方案中使用的抗体和活力染料，以及它们所识别的细胞群体。
   1. 对含有痰液细胞的管子进行标记（参见 表2 中的标签说明）。
   2. 使用5 mL流式细胞术管（需与所用流式细胞仪兼容）用于未染色细胞样本管和同型对照管；使用15 mL锥形管用于血液和上皮细胞样本管。
      注意：这些样本在完成抗体染色和固定后，将转移至流式细胞术管中。
2. 标记补偿管（表3）。
   注意：使用与所用流式细胞仪兼容的5 mL流式细胞术管。
3. 根据 表2 和 表3 的指示，分别向各痰液细胞管和补偿管中加入相应体积的HBSS、抗体和/或染料。
   注意：在加入细胞或补偿微珠之前，先向所有管中加入缓冲液（HBSS）、抗体和染料，以确保各管的染色时间一致。
4. 按照 表2 所列体积，将相应量的痰液细胞加入检测管中。
5. 按照 表3 所列，向补偿管中加入补偿微珠。
6. 将所有管子（检测管和补偿管）置于冰上避光孵育35分钟。随后用预冷的HBSS充满各管，并在4 °C、800 × g 条件下离心10分钟。
7. 对于补偿管，尽可能吸除上清液至接近沉淀，轻弹管底使沉淀松散。
8. 向补偿管中加入0.5 mL预冷的HBSS，置于冰上（4 °C）保存并避光，待流式细胞分析时使用。
9. 在离心后（抗体染色部分的步骤3.6），吸除未染色对照、同型对照、血液和上皮细胞管中的上清液，并通过轻弹管壁使沉淀松散。

4. 使用1%多聚甲醛（PFA）固定

1. 向未染色管、同型对照管、血液管和上皮细胞管中加入已解冻的冷1% PFA：未染色管和同型对照管各加2 mL，血液管和上皮细胞管各加10 mL。
2. 将各管置于冰上避光孵育1小时；孵育30分钟后，以最大速度短暂涡旋振荡。
3. 用预冷的HBSS充满各管，然后在4 °C、1600 × g 条件下离心10分钟。
4. 尽可能吸除上清液，不要扰动细胞沉淀，用手指轻弹管壁以松散细胞沉淀。
5. 向未染色管和同型对照管中各加入200 µL冷HBSS。
6. 根据总细胞数计算血液管和上皮细胞管的HBSS重悬体积。
   注：重悬体积 = 0.15 × [总细胞数（痰液解离步骤8）/ 10⁶]；对于超大样本，细胞数按50 × 10⁶计算。
7. 所有样本管和补偿管均需避光保存于冰上（4 °C），直至进行流式细胞术分析。
   ​注：本方案未验证超过24小时的保存效果。

5. 流式细胞仪上的数据采集

1. 启动所使用的流式细胞仪，并执行相应的开机程序。
   注意：本方案的此部分假设操作流式细胞仪的人员已接受过该仪器使用的培训，尤其包括日常操作，如检查光学和流体系统的稳定性、标准化光散射和荧光强度的技术，以及计算并应用正确的补偿矩阵。
2. 使用美国国家标准与技术研究院（NIST）微球混合物，调整前向散射和侧向散射电压，使NIST微球在图谱中横跨整个坐标范围，同时避免微球过于靠近坐标轴。
   注意：此步骤至关重要，以确保在采集后的分析中可通过设门排除小于5 µm的碎片。根据所使用的流式细胞仪，需注意最小的微球未被阈值（使用LSR II或Lyric时）或高判别器（使用Navios EX流式细胞仪时）排除。对于Navios EX，前向散射和侧向散射的增益均设为2，前向散射电压为236，侧向散射电压为250。对于LSR II，前向散射电压设为165，侧向散射电压设为190。
3. 将流速设置为中等（LSR II）或高（Navios EX）。
   注意：大多数仪器可使用中等或高流速采集痰样本管。需注意，若流速过慢或样本过于稀释，可能导致细胞沉降，从而引起不必要的涡旋增加。因此，应严格按照步骤4.6中计算的重悬体积进行操作，以获得适合快速采集且不会堵塞仪器的细胞密度。
4. 调整用于散射和荧光参数的每个参数的电压，使细胞群落在坐标尺度上合理分布。可参考设门策略图示，指导如何相应地调整电压。
   注意：在数据采集前，务必确保在参数选择窗口中已选中所有需要的参数，否则将无法采集相关数据。
5. 首先采集未染色的痰样本数据，随后依次采集同型对照染色样本、血液管和上皮细胞管的数据。
   注意：若细胞悬液浓度过高，导致流式细胞仪运行时发生堵塞，可用HBSS进一步稀释样本。

结果

本方案的开发以临床实验室环境为背景，重点考虑了操作的简便性、高效性和可重复性。在方案开发过程中发现，痰液处理中最耗时的步骤是细胞计数。因此，本方案的设计使得痰液处理和细胞标记可以独立于细胞计数步骤进行，从而避免时间浪费。准确的细胞计数对于将样本适当稀释以确保无阻碍地完成后续操作仍然必要，而这一计数可在抗体标记孵育期间完成，从而节省整体操作时间。

本方案采用痰液重量而非细胞计数作为确定最佳细胞标记所需抗体/染料用量的依据。然而，痰液样本的重量存在较大差异；在分析的126个样本中，重量范围从0.57 g到38.30 g。图1A显示，痰液重量与细胞收获量之间的相关性较弱。因此，将样本分为四类；小样本、中等样本、大样本和超大样本的中位重量分别为2.1 g、5.0 g、11.2 g和22.0 g（图1B）。然而，仍有一些样本的细胞收获量远高于其重量所预期的水平（图1C），但大多数样本的分布较为集中。小样本的中位细胞...

讨论

痰液的细胞成分包含多种多样的细胞，通常伴有大量碎片³⁷。此外，痰液分析需要进行质量控制，以确认样本来源于肺部而非口腔³⁸。因此，与血液等样本相比，痰液的流式细胞术分析并不简单，因为血液能够释放出更纯净且均一的细胞悬液。本方案已解决上述所有问题：通过使用特定尺寸的微球设定仪器参数，确保能够检测到最小和最大的细胞群体；采用设门策略去除碎片、细胞团块、污染的上皮细胞（SECs）及其他死细胞；最后，通过质量控制措施确保痰液样本来源于肺部，而非主要为唾液。

在处理痰液样本的实验方案中，有几个关键步骤值得特别指出。首先，在痰液解离步骤的第2.5步中，所使用的尼龙细胞筛数量会显著影响细胞得率。可能需要使用多个细胞筛，以避免因筛孔堵塞而导致大量细胞丢失。当液体通过细胞筛的速度明显减慢时，应更换新的细胞筛。其次，痰液样本的细胞沉淀通常非常疏松，尤其是当样本中含有大量鳞状上皮细胞（SECs）污染时。因此，在离心后去除上清液时，务必避免将移液头过于靠近沉淀，否则可能导致细胞丢失，甚至完全丢失整个沉淀。第三，本...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 多聚甲醛流式固定液	Polysciences	25037
100 µM 尼龙细胞滤网，Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M 氢氧化钠	EMD	SX0593-1
50 mL 圆锥形 Falcon 管	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 抗人 CD19 抗体	BioLegend	302219
Alexa488 抗人 CD3 抗体	BioLegend	300415
Alexa488 抗人细胞角蛋白抗体	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK、CD3 和 CD19 同型对照	BioLegend	400129
BV510 抗人 CD45 抗体	BioLegend	304036
CD66b FITC 同型对照	BD Biosciences	555748
CompBead Plus 补偿微珠	BD Biosciences	560497
Corning 聚苯乙烯一次性无菌瓶，250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning 聚苯乙烯一次性无菌瓶，500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T 微珠	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC 抗人 CD66b 抗体	GeneTex	GTX75907
可固定的活力染料	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST 微珠，05 μM	Polysciences	64080
NIST 微珠，20 μM	Polysciences	64160
NIST 微珠，30 μM	Polysciences	64170
PE 抗人 CD45 抗体	BioLegend	304039
PE-CF594 抗人 EpCAM 抗体	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM 同型对照	BD Biosciences	562292
PE-CR594 抗人 CD206 抗体	BD Biosciences	564063
柠檬酸钠二水合物	EMD	SX0445-1
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061