通过流式细胞术进行质量控制痰液分析

Summary

该协议描述了一种将痰液解离为单细胞悬浮液的有效方法，以及随后在标准流式细胞术平台上对细胞亚群的表征。

Abstract

痰液广泛用于研究细胞含量和其他微环境特征，以了解肺部的健康，传统上使用基于细胞学的方法进行分析。它的效用有限，因为阅读幻灯片非常耗时，需要高度专业化的人员。此外，广泛的碎片和过多的鳞状上皮细胞（SEC）或脸颊细胞的存在往往使样本不足以诊断。相比之式细胞术允许对细胞群进行高通量表型分析，同时排除碎片和 SEC 。

这里介绍的方案描述了一种将痰液解离成单细胞悬浮液，抗体染色和固定细胞群以及在流式细胞术平台上获取样品的有效方法。这里介绍了一种门控策略，描述了排除碎片，死细胞（包括SEC）和细胞二倍体。此外，这项工作还解释了如何基于分化簇（CD）45阳性和阴性群体分析活的单个痰细胞，以表征造血和上皮谱系亚群。通过识别肺部特异性巨噬细胞作为样本来自肺部而不是唾液的证据，还可以提供质量控制措施。最后，已经证明该方法可以通过提供在三个流式细胞仪上分析的同一患者的痰液图谱应用于不同的细胞术平台;Navios EX，LSR II和Lyric。此外，可以修改该协议以包括感兴趣的其他细胞标记物。这里提出了一种在流式细胞术平台上分析整个痰液样本的方法，该方法使痰液适合于开发肺病的高通量诊断。

Introduction

流式细胞仪硬件和软件的技术进步使得同时识别许多不同的细胞群成为可能^1，2，^3，4。例如，流式细胞仪在造血细胞研究中的应用使人们对免疫系统²和造血系统的细胞层次结构⁵有了更好的了解，并区分了多种不同血癌的诊断方法^6，7，8。虽然大多数痰细胞起源于造血^9，10，11，但流式细胞术尚未广泛应用于用于诊断目的的痰液分析。然而，一些研究表明，评估痰液（最重要的细胞亚群）中的免疫细胞群可能对诊断和/或监测哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等疾病有很大帮助^{12，13，14，15}。此外，可用于流式细胞术的上皮特异性标志物的存在允许询问痰液中以下最重要的细胞亚群，肺上皮细胞。

除了能够分析不同组织起源的许多不同细胞群之外，流式细胞仪还可以在相对较短的时间内评估大量细胞。相比之下，基于载玻片的细胞学分析类型通常需要高度专业的人员和/或设备。这些分析可能是劳动密集型的，这导致只有一部分痰液样本被分析¹⁶。

三个关键问题限制了痰液在流式细胞术中的广泛使用。第一个问题涉及痰液的收集。痰液通过喘息咳嗽收集，将粘液从肺部排出到口腔中，然后吐入收集杯中。由于粘液穿过口腔，因此SEC污染的可能性很高。这种污染使标本分析复杂化，但如本研究所示，该问题在流式细胞仪平台上很容易纠正。

不是每个人都能自发产生痰液;因此，已经开发了几种设备来帮助以非侵入性方式收集痰^液17。雾化器就是这样一种装置，已被证明可以产生可靠的痰液样本^18，19，20。虽然雾化器是一种非常有效的非侵入性收集痰液的方法，但其使用仍然需要在有专业人员的医疗机构进行设置²¹。相比之下，手持设备，如肺笛^22，23，24 和无伴奏合唱^16，25 ，可以在家中使用，因为它们非常人性化。这些辅助设备既安全又经济高效。

对于我们来说，阿卡贝拉的效果一直比肺笛¹⁶更好，因此，阿卡贝拉装置已被选择用于痰液收集。决定使用3天的收集样本，因为使用痰液的主要目的是开发肺癌检测测试¹⁶。已经表明，与1天或2天的样本相比，3天的样本增加了肺癌检测的可能性^26，27，28。然而，对于不同的目的，其他的痰液收集方法可能更可取。如果使用与此处描述的方法不同的痰液收集方法，建议仔细滴定用于流式细胞术分析的每种抗体或染料;关于不同的痰液收集方法如何影响流式细胞术的靶向蛋白质的数据很少。

抑制使用痰液进行诊断的热情的第二个问题是细胞数量，主要与流式细胞术有关。问题是收集足够的活细胞进行可靠的分析。两项研究表明，在辅助装置的帮助下，通过非侵入性方法收集的痰液样本含有足够的活细胞，可用于临床诊断或研究^{研究16，24}。然而，这两项研究都没有解决流式细胞术的细胞数量问题。

对于构成该方案基础的研究，根据每个研究地点批准的机构指南，从患肺癌高风险的参与者中收集痰液样本。高危参与者被定义为55-75岁之间，吸烟30包年，过去15年内没有戒烟。向患者展示了如何根据制造商的说明使用阿卡贝拉装置²⁹ ，并在家中连续三天收集痰液。样品保存在冰箱中，直到最后一次收集。在最后一个收集日，样品与冷冻冷藏袋一起连夜运往实验室。样品在收到当天被加工成单细胞悬浮液。使用这种痰液收集方法，可以获得足够的活细胞，以进行可靠的流式细胞术分析。

最后，与之前的细胞数问题相关的是如何将痰细胞从其粘液环境中释放出来的问题。如何保持细胞存活并产生不会堵塞流式细胞仪的单细胞悬浮液？基于Pizzichini等人³⁰ 和Miller等人的初步^{工作，该协议}描述了一种简单可靠的方法，用于将痰液加工成适合流式细胞术分析的单细胞悬浮液。该方法在流式细胞术中使用了完善的指南^32，33，34 来开发有效的抗体标记策略，以识别痰液中的造血细胞和上皮细胞，并提供仪器设置，质量控制措施和分析指南，在流式细胞术平台上标准化痰液分析。

Protocol

痰液处理的所有步骤都在带有适当个人防护设备的生物安全柜中进行。

1. 开始痰液解离前的试剂制备

1. 在冰上解冻1%多聚甲醛（PFA），每个样品25 mL，并保持冷藏直至使用。
   注意:PFA通过吸入和皮肤接触而有毒。根据制造商的说明准备固定剂，并在-20°C下冷冻在25 mL等分试样中直至使用。
2. 近似样品的重量并解冻足够的0.1%二硫磷脂醇（DTT）用于步骤2.2，并将其降至37°C。 （DTT等分试样应在使用前储存在-20°C。
3. 携带足够的0.5%N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）至37°C进行步骤2.2。（NAC应每周新鲜一次，并在使用前储存在4°C。

2. 痰液解离

1. 称量痰液样本以确定解离试剂的体积。
   注:如果初始重量为≤3克，则认为样品较小;如果>3克但≤8克，则认为样品为中等;如果>8但≤16克，则样品量大;如果样品重量>16克，则样品量大。小，中，大和超大的适应症将在整个协议中使用。解离和标记所需的试剂量根据痰液样本的大小而不同。
2. 将小样品转移到干净的50 mL锥形管中，将中等样品转移到干净的250 mL塑料一次性瓶中，或将大样品和超大样品转移到干净的500 mL塑料一次性瓶中。加入 1 mL/g 样品重量为 0.5% NAC 和 4 mL/g 样品重量为 0.1% DTT。
3. 以最大速度（15秒）涡旋，然后在室温（以最大速度）下摇摆15分钟。
4. 用四体积的Hank's平衡盐溶液（HBSS）稀释样品（基于样品+试剂的总体积）以中和NAC和DTT;以最大速度快速涡旋，以最大速度在室温下摇摆5分钟。
5. 通过100μm尼龙网状细胞过滤器过滤细胞悬浮液到一个或多个50 mL锥形离心管中，以产生单细胞悬浮液。
6. 在4°C下以800× g 离心细胞10分钟。 吸出上清液，将所有微丸混合在一个15 mL锥形管中，然后使用相同的条件用HBSS洗涤微丸。
7. 将细胞沉淀重悬于由痰液样品的初始重量确定的缓冲液体积中。
   注:将小样品重悬于250μL HBSS中。将培养基样品重悬于760μL HBSS中。将大样品和超大样品重悬于1460 μL HBSS中。
8. 使用台盼蓝取细胞悬浮液的等分试样进行活/死细胞计数。
   注意:对于小样品，使用5μL。对于中等、大或超大样品，使用10μL，用HBSS以1:10稀释。
   1. 将10μL痰液稀释液与30μL0.4%台盼蓝混合，以达到1:40的最终样品稀释度。装入血细胞计数器的计数室进行细胞计数。
      注意:如果细胞数太低或太高而无法实现准确的计数，则可能需要调整最终稀释度。强烈建议您咨询Guiot等人²⁰ ，以正确区分痰细胞与SEC和碎片。这对于准确的细胞计数至关重要。
9. 从超大样品中，从总数中取出50×10 ⁶ 个细胞，并加入到具有足够添加的HBSS的新管中，以产生1700μL的总体积。
   注意:将此视为协议其余部分的大样本。剩余的样品可以丢弃或用于其他目的。

3. 抗体和活力染料染色

1. 抗体和染色染料的选择
   注: 表1 显示了该方案中使用的抗体和活力染料以及它们所鉴定的细胞群。
   1. 标记含有痰细胞的管子（参见 表2 的标记）。
   2. 使用5 mL流式细胞术管（与所用流式细胞仪兼容）用于具有未染色细胞的样品管和具有同种型对照的试管。使用15 mL锥形管进行血液和上皮管样品。
      注意:这些样品将在抗体染色和固定后转移到流式细胞术管中。
2. 标记补偿管（表3）。
   注:使用与所用流式细胞仪兼容的 5 mL 流式细胞术管。
3. 将HBSS，抗体和/或染料的量分别添加到每个痰细胞管和补偿管中，如 表2 和 表3所示。
   注意:在添加细胞或补偿珠之前，将缓冲液（HBBS），抗体和染料添加到所有试管中，以确保所有试管的染色时间一致。
4. 将 表2 中列出的痰细胞体积的量加入测定管中。
5. 将补偿珠添加到补偿管中，如 表3所示。
6. 将所有试管（测定和补偿管）在冰上孵育，避光，35分钟。然后，用冰冷的HBSS填充管子，并在4°C下以800× g离心10分钟。
7. 对于补偿管，吸出上清液尽可能靠近颗粒，然后轻拂颗粒以松动。
8. 向补偿管中加入0.5 mL冷HBSS，将其储存在4°C的冰上，并保护它们免受光照，直到需要流式细胞术分析。
9. 离心后（抗体染色部分的步骤3.6）从未染色的同种型，血液和上皮管中吸出上清液，并通过轻拂管子松开沉淀。

4. 用1%多聚甲醛（PFA）固定

1. 将冷的1%PFA（现在应该解冻）添加到未染色的同种型，血液和上皮管中;2 mL 至未染色和同种型试管，10 mL 至血液和上皮管。
2. 将管子在冰上孵育，避光1小时。30分钟后以最大速度快速涡旋。
3. 用冰冷的哈佛商学院填充管子。然后，在4°C下离心管10分钟，以1600× g。
4. 在不干扰细胞沉淀的情况下吸出尽可能多的上清液，并用手指轻拂管以松动细胞。
5. 将200μL冷HBSS加入未染色的同种型管中。
6. 根据总细胞计数计算用于血液和上皮管重悬的HBSS体积。
   注意:重悬体积= 0.15 x [总细胞计数（痰液解离步骤8）/ ¹⁰⁶]。使用50 x ¹⁰⁶ 作为超大样品的细胞计数。
7. 储存所有样品和补偿管，在4°C下保护冰上避光，直到进行流式细胞术分析。
   注意:此协议未经测试存储超过 24 小时。

5. 流式细胞仪上的数据采集

1. 对正在使用的流式细胞仪应用适当的启动程序。
   注意:该协议的这一部分假设操作流式细胞仪的人员接受过使用可用仪器的培训，特别是关于日常程序，包括检查光学和流体系统的稳定性，标准化光散射和荧光强度的技术，以及计算和应用正确的补偿矩阵。
2. 使用美国国家标准与技术研究院 （NIST） 磁珠的混合物，确保将正向散射和侧向散射电压设置为将 NIST 磁珠放置在跨整个图中，而不会将磁珠放置在离轴太近的位置。
   注:此步骤对于确保通过采集后分析门控消除小于5 μm的碎屑至关重要。根据所使用的流式细胞仪，请注意，最小的磁珠不会被阈值（使用LSR II或Lyric时）或高鉴别器（使用Navios EX流式细胞仪）排除。对于Navios EX，正向和侧向散射的增益为2，正向散射的电压为236，侧向散射的电压为250。对于LSR II，使用了165的正向散射电压和190的侧散射电压。
3. 将流速设置为中等 （LSR II） 或高 （Navios EX）。
   注意:大多数仪器的中高流速可用于获取痰管。重要的是要注意，使用太慢的流速或太稀的样品可能导致细胞沉降，从而导致涡旋增加，这是不希望的。因此，坚持步骤4.6中计算的重悬体积应导致可以快速获得但不堵塞机器的细胞密度。
4. 调整用于散射和荧光参数的每个参数的电压，以将细胞群放置在刻度上。使用带有门控策略的数字作为如何相应地调整电压的指导。
   注意:确保在采集之前在参数选择窗口中选择了所需的所有参数，否则不会获取数据。
5. 首先获取未染色的痰液样本的数据，然后采集同种型染色的样本，然后是血管和上皮管。
   注意:如果细胞悬浮液浓度过高，无法使流式细胞仪运行样品而不会堵塞，则可以用HBSS进一步稀释样品。

Results

该协议是在考虑临床实验室环境的情况下制定的。在协议开发过程中，重点是简单性，效率和可重复性。研究发现，处理痰液中最耗时的步骤是计数细胞。因此，该协议的设置方式使得痰液处理和细胞标记可以独立于细胞计数进行而不会浪费时间。然后，可以在抗体标记孵育期间获得准确的细胞计数，这对于适当稀释样品以进行无障碍运行仍然是必需的。

该协议使用痰液重量测量而不是细胞计数来指示使用多少抗体/染料进行最佳细胞标记。然而，痰液样本的重量有很大程度的变化;在分析的126个样品中，重量范围为0.57 g至38.30 g， 图1A 显示痰重与细胞产量的相关性不强。因此，样本分为四类;小样本的中位重量为2.1 g，中型样品为5.0 g，大样品为11.2 g，超大样品为22.0 g（图1B）。然而，仍然有一些样品产生的细胞远远超过其重量的预期（图1C），大多数样品都聚集在一起。对于小样品，中位细胞产量为8.0 x ¹⁰⁶

Discussion

痰液的细胞含量包括种类繁多的宽范围细胞，往往伴有大量碎片³⁷。此外，痰液分析需要质量控制，以确认样本是从肺部而不是口腔收集的³⁸。因此，通过流式细胞术分析痰液并不像血液那样简单，例如，血液释放出更清洁和均匀的细胞悬浮液。该协议已经解决了所有这些问题:提供使用特定尺寸的微球的仪器设置，以确保可以检测到最小和最大的细胞群，门控策略以消除碎片，细胞团块，污染SEC和其他死细胞，最后，质量控制措施，以确保痰液样本来自肺部而不是大部分是唾液。

在处理痰液时，方案中有一些关键步骤值得指出。首先，细胞产量可能受到方案中痰液解离部分的步骤2.5中使用的尼龙细胞过滤器数量的急剧影响。可能需要多个过滤器，以避免由于过滤器堵塞而丢失太多细胞。当通过过滤器的流量明显减慢时，应使用新的过滤器。其次，痰液样本的细胞沉淀可能非常松散，特别是如果SEC污染程度很高。因此，在离心样品后除去上清液时，必须不要吸出太靠近沉淀。吸气太靠近沉淀可能导致细胞损失，如果不是整个沉淀的损失。第三，该协议需要固定步骤。这可以保留细胞及其...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% 多聚甲醛 Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM 尼龙细胞过滤器，Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL 锥形猎鹰管	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 抗人 CD19	BioLegend	302219
Alexa488 抗人 CD3	BioLegend	300415
Alexa488 抗人细胞角蛋白	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK、CD3 和 CD19 同种型	BioLegend	400129
BV510 抗人 CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC 同种型	BD Biosciences	555748
CompBead Plus 补偿微珠	BD Biosciences 560497
康宁聚苯乙烯一次性无菌瓶 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
康宁聚苯乙烯一次性无菌瓶 500 mLFisher	Scientific	09-761-10
CS&T 珠	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC 抗人 CD66b	GeneTex	GTX75907
可固定活力染色剂	BD Biosciences	564406
FlowCheck	贝克曼库尔特	A69183
FlowSet	贝克曼库尔特	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST 珠子，05 &μ;M	Polysciences	64080
NIST 微珠，20 &μ;M	Polysciences	64160
NIST 微珠，30 &μ;M	Polysciences	64170
PE 抗人 CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 抗人 EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM 同种型	BD Biosciences	562292
PE-CR594 抗人 CD206	BD Biosciences	564063
柠檬酸钠二水合	物 EMD	SX0445-1
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061