细胞核分离和超分辨率结构照明显微镜检查人类神经退行性病变中核孔蛋白的改变

Summary

该方案描述了用于细胞核分离和超分辨率结构照明显微镜的优化工作流程，以评估核质内的单个核孔蛋白和诱导多能干细胞衍生神经元和死后人体组织中的 NPC。

Abstract

核孔复合体 （NPC） 是一种复杂的大分子结构，由 ~30 个不同核孔蛋白 （Nups） 的多个拷贝组成。总的来说，这些 Nups 的功能是调节基因组组织、基因表达和核质转运 （NCT）。最近，NCT 缺陷和特定 Nups 的改变已被确定为多种神经退行性疾病的早期和突出病症，包括肌萎缩侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）/额颞叶痴呆 （FTD） 和亨廷顿病 （HD）。光学和电子显微镜的进步允许以更高的精度和分辨率彻底检查亚细胞结构，包括 NPC 及其 Nup 成分。在常用的技术中，超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 为使用基于抗体的常规标记策略研究单个 Nups 的定位和表达提供了无与伦比的机会。在 SIM 之前分离细胞核，可以在完全准确地重建的 3D 空间中可视化 NPC 和核质中的单个 Nup 蛋白。该方案描述了细胞核分离和 SIM 的程序，用于评估 Nup 在人 iPSC 衍生的 CNS 细胞和死后组织中的表达和分布。

Introduction

随着人口老龄化，与年龄相关的神经退行性疾病的患病率正在增加¹.虽然遗传基础和病理特征已得到很好的表征，但导致神经元损伤的确切分子事件仍然知之甚少^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}.最近，一个 G₄C₂ C9orf72 基因第一个内含子中的六核苷酸重复扩增被确定为相关神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和额颞叶痴呆 （FTD） 的最常见遗传原因^13,14.现在有几项研究支持核运输机制中断的核心作用，包括核孔复合体 （NPC） 和核转运受体 （NTR，核蛋白），是 C9orf72 ALS 的病因^15,16.在大鼠大脑内的非分裂细胞中，支架核孔蛋白 （Nups） 的寿命极长。因此，据报道，NPC 和 NCT 在衰老过程中发生了变化^17,18,19,20.此外，一些核孔蛋白或转运蛋白在发生突变时与特定的神经系统疾病有关^21,22.例如，Nup62 的突变与婴儿双侧纹状体坏死 （IBSN） 有关，IBSN 是一种影响尾状核和壳核的神经系统疾病²³;Gle1 突变与胎儿运动神经元病人类致死先天性挛缩综合征 1 （LCCS1） 有关²⁴;和 Aladin 突变是 Triple-A 综合征的病因²⁵.功能性 NCT 的改变在与年龄相关的神经退行性疾病中加剧，例如 ALS、亨廷顿病 （HD） 和阿尔茨海默病 （AD）^{16,26,27,28,29,30,31}.此外，据报道，特异性 Nups 和 NTR 是 C9orf72 介导的毒性的修饰因子。 Drosophila 眼睛²⁸ 或生化修饰疾病相关蛋白（如 FUS 和 tau）的聚集状态^27,32,33,34.总的来说，这些早期研究表明，改变的 NCT 可能是 ALS 和 FTD 的主要和早期病理特征。基于过表达的模型系统的研究表明，特异性 Nups 和核蛋白的错误定位可能会影响 NCT^{16,35,36,37,38}.然而，这些病理学研究实际上并没有将 NPC 蛋白的细胞质积累与 NPC 的结构或功能缺陷联系起来。例如，这种病理可能只是反映了 Nup 蛋白细胞质库的失调，对 NPC 的组成和功能影响不大。相比之下，最近一项采用超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 的研究表明，鼻咽癌本身出现了重大损伤，其特征是人类 C9orf72 ALS/FTD 神经元的核质和 NPC 内的特异性 Nup 水平降低，最终导致 NPC 功能改变，成为致病性疾病级联反应的早期起始事件¹⁵.

大分子在细胞核和细胞质之间的通过受核孔复合体 （NPC） 控制。鼻咽癌是嵌入核膜中的大分子复合物，由 30 个核孔蛋白 （Nups） 的多个拷贝组成39,40,41。尽管 Nup 化学计量学因细胞类型而异 42,43,44，^但维持整体 NPC 组成对于 NCT、基因组组织和整体细胞活力至关重要 39,41,45,46。因此，NPC 组成的改变和随后的功能运输缺陷可能会影响无数的下游细胞功能。鼻咽癌的 Nup 成分高度组织成多个亚复合物，包括细胞质环和细丝、中央通道、外环、内环、跨膜环和核篮。总的来说，内环、外膜环和跨膜环的支架 Nups 将 NPC 锚定在核膜内，并为细胞质环、中央通道和核篮的 Nups 提供锚点。虽然小分子 （<40-60 kD） 可以通过 NPC 被动扩散，但核转运受体（NTR，核蛋白）与细胞质丝、中央通道和核篮的 FG Nups 之间的相互作用促进了较大货物的主动运输 39,40,41,45。此外，少数 Nups 还可以在 NPC 之外的核质内发挥作用，以调节基因表达^46,47。

鉴于单个人类 NPC 的横向尺寸约为 100-120 nm⁴⁰，标准宽场或共聚焦显微镜不足以分辨单个 NPC⁴⁸。电子显微镜 （EM） 技术，如 TEM 或 SEM，通常用于评估 NPC^{的整体结构 39,40}。尽管这些技术在解析 NPC 超微结构方面具有优势，但它们不太常用于评估 NPC 中单个 Nup 蛋白的存在。将抗体或基于标签的标记与这些最先进的技术（TEM 和 SEM）相结合的技术限制并不总是能够准确可靠地评估 NPC 或核质中的单个 Nups 本身。此外，这些技术在技术上可能具有挑战性，并且尚未为所有研究人员广泛使用。然而，光学和荧光显微镜的最新进展增加了超分辨率成像技术的可及性。具体来说，SIM 提供了无与伦比的机会，可以以接近一个人类 NPC^{40、48、49、50、51} 的横向尺寸的分辨率对单个 Nups 进行成像。与随机光学重建显微镜 （STORM） 和受激发射耗竭 （STED） 等其他超分辨率方法相比，SIM 与传统的基于抗体的免疫染色兼容⁴⁹。因此，SIM 允许对具有特异性 Nup 抗体的所有 Nup 进行全面分析。在研究构成 NPC 的许多蛋白质时，在同一制备物中对多个不同 Nups 进行采样和成像的能力为其他成像方法提供了显著优势。以下程序详细介绍了一种优化方案，用于使用从诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生神经元 （iPSN） 和死后人类中枢神经系统 （CNS） 组织中分离的细胞核来评估 NPC 的单个 Nup 成分。

Protocol

所有用于 iPSC 生成和尸检组织采集的血液样本均已获得约翰霍普金斯大学 IRB 的批准，并受到约翰霍普金斯大学道德监督。所有患者信息均符合 HIPPA 标准。以下方案符合约翰霍普金斯大学的所有生物安全程序。

1. 制备用于免疫染色和成像的载玻片

1. 将带正电的玻璃显微镜载玻片放置在空的细胞漏斗中，并用疏水屏障笔画一个圆圈，以勾勒出沉积细胞核的区域。
2. 将 50 μL 的 1 mg/mL 胶原蛋白溶液（用 1x PBS 稀释）添加到步骤 1.1 中绘制的圆圈中心，并在室温下孵育 5 分钟。
3. 吸出胶原蛋白溶液，让载玻片在室温下风干约 1 小时。

2. 裂解缓冲液和蔗糖梯度的制备

1. 根据细胞核分离试剂盒方案制备裂解缓冲液和蔗糖梯度溶液。
   1. 对于每个样品，通过将 11 mL 提供的裂解缓冲液、110 μL 提供的 10% Triton X-100 溶液和 11 μL 新鲜制备或解冻的 1 M DTT（二硫苏糖醇）混合，制备 50 mL 锥形裂解缓冲液管。
   2. 对于每个样品，使用 50 mL 锥形管制备 1.85 M 蔗糖垫溶液，方法是将 27.75 mL 提供的 2 M 蔗糖垫溶液、2.25 mL 提供的蔗糖垫缓冲液和 30 μL 新鲜制备或解冻的 1 M DTT 混合。
      注:1.85 M 蔗糖垫溶液最适合 iPSN 和死后人 CNS 组织，但可针对其他细胞类型或组织样品进行调整。最近发表了有关 HEK293 细胞、iPSC 衍生星形胶质细胞和死后 CNS 组织中少突胶质细胞核富集的其他详细信息¹⁵。
2. 通过倒置锥形管轻轻混合裂解缓冲液和蔗糖垫溶液，并将其储存在冰上。

3. iPSN 和死后人 CNS 组织的裂解

1. 在进行裂解之前，将超速离心机转子（无样品架）放入超速离心机中，并使其预冷至 4 °C。
2. iPSN 裂解。
   注:iPSN 和死后人类 CNS 组织的裂解方案不同。遵循下面指定的样本类型的方案（步骤 3.2:iPSN，步骤 3.3:死后人 CNS 组织）。
   1. 从培养箱中取出 iPSN 并吸出培养基。用 1x PBS 短暂冲洗，并将裂解缓冲液直接加入孔或板中。
      注意:注意用足量的 1x PBS 充分冲洗 iPSN，以去除碎片和死细胞。要添加到 iPSN 板中的裂解缓冲液的体积会有所不同。请参阅 表 1。确保起始材料为 >250 万 iPSN。
   2. 用细胞刮刀刮擦 iPSN，并将其转移到 50 mL 锥形管中剩余的裂解缓冲液中。
   3. 盖上每个锥形管并涡旋样品 20 秒以促进 iPSN 裂解。
   4. 让样品在冰上静置 1-2 分钟，然后再继续。
3. 死后人 CNS 组织的裂解。
   1. 在放置在干冰床上的培养皿中用剃须刀片切割，称取 ~100 mg 冷冻的死后人 CNS 组织。确保在用一次性垫子包围的表面上工作，以避免局部组织污染。注意组织解剖时可见的特定灰质与白质夹层（例如，皮质壁炉与底层白质）。
      注:处理冷冻死后人体组织样本时，请佩戴适当的个人防护装备，包括护目镜和手套。此步骤也可以提前完成，并将组织等分试样储存在 -80 °C。50 mg 是细胞核分离的足够量。然而，超过 100 mg 的组织通常会产生不完全的细胞核分离，一些细胞核周围存在完整的细胞质就证明了这一点。
   2. 通过清洁并用蒸馏水彻底冲洗来制备 Dounce 均质器。将均质器放在冰上冷却。
   3. 将 100 mg 组织加入新鲜清洁、冲洗和冷藏（冰上）的 Dounce 匀浆器中，其中含有 2 mL 制备的裂解缓冲液。
   4. 在冰上使用标准程序在 Dounce 均质器中均质化。
      注:通常，每个研杵 10-20 次冲程足以无阻力地穿过样品。
   5. 将 2 mL 死后人脑匀浆转移到锥形管中剩余的 9 mL 裂解缓冲液中。
   6. 剧烈涡旋 30 秒，然后在冰上静置 5 分钟以促进裂解。

4. 从 iPSN 和死后人 CNS 组织中分离细胞核

1. 在超速离心管底部放置 10 mL 1.85 M 蔗糖垫溶液（在步骤 2.1.2 中制成），并向每个裂解物中加入 18 mL 1.85 M 蔗糖垫溶液。
2. 倒置 50 mL 锥形管，轻轻混合裂解物/蔗糖垫溶液（在步骤 4.1 中混合）。
3. 在超速离心管中，将 28 mL 裂解物/蔗糖垫溶液混合物缓慢加入 10 mL 1.85 M 蔗糖垫溶液的顶部（来自步骤 4.1）。
   注:50 mL 锥形管中总共有 29 mL 裂解物/蔗糖垫状溶液混合物（步骤 4.1-4.2）。在 50 mL 锥形管中保留 1 mL 这种裂解物/蔗糖垫溶液混合物。由于蔗糖垫溶液的粘度，这确保了所有样品之间的准确和一致的移液。
4. 将超速离心管放入支架中，并根据需要添加额外的 1.85 M 蔗糖垫溶液（在步骤 2.1.2 中制成）以平衡样品。
5. 将样品架放入冷冻超速离心机的转子中，以 30,000 x g 、4 °C 旋转 45 分钟。
6. 从样品架中取出超速离心管，弃去上清液。细胞核将在超速离心管的底部以颗粒的形式可见。
7. 通过涡旋将细胞核沉淀重悬于 1 mL 提供的细胞核储存缓冲液中，然后转移到微量离心管中。
8. 将微量离心管在 2,500 x g ，4 °C 下离心 5 分钟。
9. 去除上清液，并在新鲜的 1 mL 提供的细胞核储存缓冲液中涡旋，重悬细胞核。
10. 继续进行免疫染色或将细胞核储存在 -80 °C。
    注:细胞核可在 -80 °C 下储存长达 6 个月，并在结构完整性受损之前进行两次冻融循环。

5. 分离细胞核的免疫染色

1. 取 10 μL 等分试样的细胞核悬液，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行计数。
2. 将准备好的载玻片（来自步骤 1.3）组装到细胞漏斗中。
3. 对于每个细胞漏斗，将 200 μL 新鲜细胞核储存缓冲液和 ~100,000 个细胞核分层。
4. 将细胞漏斗放入细胞离心涂片中并以 100 x g 离心 3 分钟，轻轻地将细胞核旋转到载玻片上。
5. 松开细胞漏斗，立即向载玻片中加入 ~100 μL 4% PFA（多聚甲醛），并在室温下孵育 15 分钟。
   注:细胞核也可以用甲醇固定。使用适合每种抗体的固定方法。如果使用甲醇，请跳过透化步骤 （5.7）。细胞漏斗是一次性使用的;此时丢弃它们。
6. 用 1x PBS 洗涤细胞核 3 次，每次 5 分钟。
7. 在室温下用 0.1% Triton X-100 在 1x PBS 中透化细胞核 10 分钟。
8. 在室温下，在封闭溶液（1x PBS 中的 10% 山羊或驴血清）中封闭细胞核 30 分钟。
9. 将细胞核与在封闭溶液中稀释的一抗在 4 °C 下孵育过夜。
10. 用 1x PBS 洗涤细胞核 3 次，每次 5 分钟。
11. 将细胞核与在封闭溶液中稀释的二抗在室温下孵育 1 小时。
    注:首选 Alexa Fluor 488、568 和 647 二抗。
12. 用 1x PBS 洗涤细胞核 3 次，每次 5 分钟。
13. 可选:用 DAPI 或 Hoechst 孵育细胞核 5 分钟，然后用 1x PBS 再洗涤两次 5 分钟。
14. 在包含细胞核的圆圈边缘握住无绒抹布，以完全去除最后一次 PBS 洗涤液。
15. 向每张载玻片中加入 1 滴 （~10 μL） 硬质安装抗淬灭封片剂（不含 DAPI），并在每张载玻片上轻轻放置高容忍度的 18 mm x 18 mm 方形盖玻片。
    注意:使用硬装式介质时，如果在适当的时间范围内对载玻片进行成像，则无需密封载玻片。Nup 免疫反应性通常在 4 °C 下储存的未密封载玻片上保持稳定 ~6 个月。但是，如果使用湿式安装介质或长时间储存，则可以用一层薄指甲油密封盖玻片的边缘。
16. 将载玻片避光，并在室温下固化过夜。
17. 通过超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 对细胞核进行成像。
    注意:蔡司、尼康和 GE Healthcare 都生产 SIM 显微镜。遵循系统特定的协议进行图像采集和处理。使用适合每个 Nup 和荧光团的成像参数（激光功率、滤光片组、曝光时间）。成像时，避免圆的边缘（从步骤 1.1 开始），因为这些细胞核通常由于离心步骤 （5.4） 而变平并展开。完全反卷积和处理的图像可以进行多种分析，包括使用 FIJI 或 Imaris 图像分析软件中的标准 3D 分析模块进行点检测和体积测量。最近发布了有关分析方法的更多详细信息¹⁵。

Results

为了检查 POM121 在人神经元核中的 NPC 和核质分布和表达，如前所述区分对照和 C9orf72 iPSN¹⁵。死后裂解人运动皮层和第 32 天 iPSN，并如上所述进行细胞核分离和免疫染色。使用超分辨率结构照明显微镜 （Zeiss） 通过超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 对 NeuN 阳性分离的细胞核进行成像，并使用前面描述的默认结构照明反卷积参数进行处理¹⁵ （工作流程另见 图 1 ）。使用 63 倍油浸物镜、1 倍放大倍率、1% 功率的 HR Diode 448 激光器、100 ms 曝光时间、BP495-550/LP750 发射滤光片、110 nm 厚的 z 截面和 5 次网格旋转采集图像。如图 2 中的 3D 最大强度投影所示，iPSN 和死后神经元核中的单个 POM121 斑点都被解析出来。这些图像随后使用 FIJI 或 Imaris 中的 3D 套件插件进行点检测，如前所述

Discussion

鉴于最近发现 NCT 缺陷是多种神经退行性疾病的早期和突出现象 16,27,28,30,31，迫切需要彻底检查这种病理发生的机制。由于 NPC 及其单个 Nup 蛋白关键控制功能性 NCT^39,41，因此研究神经退行性疾病模型中的 NPC 组成至关重要。然而，标准的宽场和共聚焦显微镜技术不足以分辨单个 NPC^{40、48、49、}...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL 锥形管	Fisher Scientific	14-959-49A
Beckman 超速离心机	Beckman Coulter
细胞刮刀	Sarstedt	83.183
胶原蛋白	Advanced Biomatrix	5005
盖玻片	MatTek	PCS-170-1818
细胞漏斗	Thermo Fisher Scientific
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003
Dounce 均质器	DWK 生命科学	357542
DTT	Sigma Aldrich	D0632
Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
山羊抗鸡 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21449
山羊抗小鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029
山羊抗小鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11031
山羊抗小鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21236
山羊抗兔 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
山羊抗兔 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036
山羊抗兔 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21245
山羊抗大鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11006
山羊抗大鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11077
山羊抗大鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21247
血细胞计数器	FisherScientific	267110
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
正常山羊血清	载体 Labs	S-1000
细胞核 PURE 制备细胞核分离试剂盒	Sigma Aldrich	NUC201	包含裂解缓冲液、10% Triton X-100、2 M 蔗糖梯度、蔗糖垫溶液和细胞核储存缓冲液;在方案中引用为"细胞核分离试剂盒"
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Prolong Gold Antifade	Invitrogen	P36930	在方案中引用为"硬安装抗淬灭封固剂"
SW 32 Ti 超速离心机转子	Beckman Coulter	369694	在方案中称为"超速离心机转子"
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	15-250-061
超速离心管	Beckman Coulter	344058
核孔蛋白一抗			适用于免疫荧光检测非生物核孔蛋白的一抗可从多家公司获得