细胞核分离和超分辨率结构照明显微镜检查人类神经退行性病变中核孔蛋白的改变

Summary

该方案描述了用于细胞核分离和超分辨率结构照明显微镜的优化工作流程，以评估核质内的单个核孔蛋白和诱导多能干细胞衍生神经元和死后人体组织中的 NPC。

Abstract

核孔复合体 （NPC） 是一种复杂的大分子结构，由 ~30 个不同核孔蛋白 （Nups） 的多个拷贝组成。总的来说，这些 Nups 的功能是调节基因组组织、基因表达和核质转运 （NCT）。最近，NCT 缺陷和特定 Nups 的改变已被确定为多种神经退行性疾病的早期和突出病症，包括肌萎缩侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）/额颞叶痴呆 （FTD） 和亨廷顿病 （HD）。光学和电子显微镜的进步允许以更高的精度和分辨率彻底检查亚细胞结构，包括 NPC 及其 Nup 成分。在常用的技术中，超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 为使用基于抗体的常规标记策略研究单个 Nups 的定位和表达提供了无与伦比的机会。在 SIM 之前分离细胞核，可以在完全准确地重建的 3D 空间中可视化 NPC 和核质中的单个 Nup 蛋白。该方案描述了细胞核分离和 SIM 的程序，用于评估 Nup 在人 iPSC 衍生的 CNS 细胞和死后组织中的表达和分布。

Introduction

随着人口老龄化，与年龄相关的神经退行性疾病的患病率正在增加¹.虽然遗传基础和病理特征已得到很好的表征，但导致神经元损伤的确切分子事件仍然知之甚少^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}.最近，一个 G₄C₂ C9orf72 基因第一个内含子中的六核苷酸重复扩增被确定为相关神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和额颞叶痴呆 （FTD） 的最常见遗传原因^13,<....

Protocol

所有用于 iPSC 生成和尸检组织采集的血液样本均已获得约翰霍普金斯大学 IRB 的批准，并受到约翰霍普金斯大学道德监督。所有患者信息均符合 HIPPA 标准。以下方案符合约翰霍普金斯大学的所有生物安全程序。

1. 制备用于免疫染色和成像的载玻片

1. 将带正电的玻璃显微镜载玻片放置在空的细胞漏斗中，并用疏水屏障笔画一个圆圈，以勾勒出沉积细胞核的区域。
2. 将 50 μL 的 1 mg/mL 胶原蛋白溶液（用 1x PBS 稀释）添加到步骤 1.1 中绘制的圆圈中心，并在室温下孵育 5 分钟。
3. 吸出胶原蛋白溶液，让载玻片在室温下风干约 1 小时。

2. 裂解缓冲液和蔗糖梯度的制备

1. 根据细胞核分离试剂盒方案制备裂解缓冲液和蔗糖梯度溶液。
   1. 对于每个样品，通过将 11 mL 提供的裂解缓冲液、110 μL 提供的 10% Triton X-100 溶液和 11 μL 新鲜制备或解冻的 1 M DTT（二硫苏糖醇）混合，制备 50 mL 锥形裂解缓冲液管。
   2. 对于每个样品，使用 50 mL 锥形管制备 1.85 M 蔗糖垫溶液，方法是将 27.75 mL 提供的 2 M 蔗糖垫溶液、2.25 mL 提供的蔗糖垫缓冲液和 30 μL ....

Results

为了检查 POM121 在人神经元核中的 NPC 和核质分布和表达，如前所述区分对照和 C9orf72 iPSN¹⁵。死后裂解人运动皮层和第 32 天 iPSN，并如上所述进行细胞核分离和免疫染色。使用超分辨率结构照明显微镜 （Zeiss） 通过超分辨率结构照明显微镜 （SIM） 对 NeuN 阳性分离的细胞核进行成像，并使用前面描述的默认结构照明反卷积参数进行处理¹⁵ （工作流程另见 图 1 ）。使用 63 倍油浸物镜、1 倍放大倍率、1% 功率的 HR Diode 448 激光器、100 ms 曝光时间、BP495-550/LP750 发射滤光片、110 nm 厚的 z 截面和 5 次网格旋转采集图像。如图 2 中的 3D 最大强度投影所示，iPSN 和死后神经元核中的单个 POM121 斑点都被解析出来。这些图像随后使用 FIJI 或 Imaris 中的 3D 套件插件进行点检测，如前所述

Discussion

鉴于最近发现 NCT 缺陷是多种神经退行性疾病的早期和突出现象 16,27,28,30,31，迫切需要彻底检查这种病理发生的机制。由于 NPC 及其单个 Nup 蛋白关键控制功能性 NCT^39,41，因此研究神经退行性疾病模型中的 NPC 组成至关重要。然而，标准的宽场和共聚焦显微镜技术不足以分辨单个 NPC^{40、48、49、}.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL 锥形管	Fisher Scientific	14-959-49A
Beckman 超速离心机	Beckman Coulter
细胞刮刀	Sarstedt	83.183
胶原蛋白	Advanced Biomatrix	5005
盖玻片	MatTek	PCS-170-1818
细胞漏斗	Thermo Fisher Scientific
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003
Dounce 均质器	DWK 生命科学	357542
DTT	Sigma Aldrich	D0632
Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
山羊抗鸡 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21449
山羊抗小鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029
山羊抗小鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11031
山羊抗小鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21236
山羊抗兔 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
山羊抗兔 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036
山羊抗兔 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21245
山羊抗大鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11006
山羊抗大鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11077
山羊抗大鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21247
血细胞计数器	FisherScientific	267110
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
正常山羊血清	载体 Labs	S-1000
细胞核 PURE 制备细胞核分离试剂盒	Sigma Aldrich	NUC201	包含裂解缓冲液、10% Triton X-100、2 M 蔗糖梯度、蔗糖垫溶液和细胞核储存缓冲液;在方案中引用为"细胞核分离试剂盒"
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Prolong Gold Antifade	Invitrogen	P36930	在方案中引用为"硬安装抗淬灭封固剂"
SW 32 Ti 超速离心机转子	Beckman Coulter	369694	在方案中称为"超速离心机转子"
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	15-250-061
超速离心管	Beckman Coulter	344058
核孔蛋白一抗			适用于免疫荧光检测非生物核孔蛋白的一抗可从多家公司获得