用于研究人类神经退行性疾病中核孔蛋白改变的细胞核分离与超分辨率结构光照明显微镜技术

Alyssa N. Coyne; Jeffrey D. Rothstein

doi:10.3791/62789

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方法文章

用于研究人类神经退行性疾病中核孔蛋白改变的细胞核分离与超分辨率结构光照明显微镜技术

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DOI：

10.3791/62789

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2021年9月10日

Alyssa N. Coyne¹^,² , Jeffrey D. Rothstein¹^,²

¹Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种优化的工作流程，用于从诱导多能干细胞分化的神经元和人死后组织中分离细胞核，并通过超分辨率结构照明显微镜对核质内及核孔复合体中的单个核孔蛋白进行评估。

摘要

核孔复合体（NPC）是一种复杂的大型分子结构，由约30种不同的核孔蛋白（Nups）各自多个拷贝组成。这些Nups共同参与调控基因组结构、基因表达以及核质运输（NCT）。近年来，研究发现NCT功能障碍及特定Nups的异常是多种神经退行性疾病早期且显著的病理特征，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）/额颞叶痴呆（FTD）以及亨廷顿病（HD）。光学显微镜和电子显微镜技术的进步使得对亚细胞结构（包括NPC及其Nup组分）的观察达到了更高的精确度和分辨率。在常用技术中，超分辨率结构照明显微镜（SIM）为利用常规抗体标记策略研究单个Nups的定位与表达提供了独特优势。在进行SIM前分离细胞核，可实现对NPC及核质中单个Nup蛋白在完整且精确重建的三维空间中的可视化。本方案描述了一种用于分离细胞核并结合SIM技术，以评估人诱导多能干细胞来源的中枢神经系统细胞及死后组织中Nup表达与分布的实验流程。

引言

随着人口老龄化，年龄相关性神经退行性疾病的患病率正在上升¹。尽管这些疾病的遗传基础和病理特征已被充分阐明，但导致神经元损伤的精确分子事件仍不清楚²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²。最近，C9orf72基因第一个内含子中的G₄C₂六核苷酸重复扩增被确定为相关神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆症（FTD）最常见的遗传病因¹³^,¹⁴。目前多项研究支持核转运机制（包括....

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方案

用于iPSC生成和尸检组织采集的所有血液样本均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会（IRB）批准，并接受约翰斯·霍普金斯大学伦理监督。所有患者信息均符合《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）规定。以下方案遵循约翰斯·霍普金斯大学的所有生物安全操作规程。

1. 免疫染色和成像用载玻片的制备

将带正电荷的玻璃显微镜载玻片放入空的细胞计数漏斗中，并使用疏水屏障笔在载玻片上画一个圆圈，以界定细胞核的沉积区域。
向第1.1步所画圆圈的中心加入50 μL浓度为1 mg/mL的胶原蛋白溶液（用1×PBS稀释），并在室温下孵育5分钟。
吸除胶原蛋白溶液，并将载玻片在室温下静置晾干约1小时。

2. 裂解缓冲液和蔗糖梯度的制备

根据细胞核分离试剂盒说明书配制裂解缓冲液和蔗糖梯度溶液。
1. 每个样本使用一个50 mL锥形管，通过混合11 mL提供的裂解缓冲液、110 μL提供的10% Triton X-100溶液以及11 μL新鲜配制或解冻的1 M DTT（二硫苏糖醇），配制裂解缓冲液。
2. 每个样本使用一个50 mL锥形管，通过混合27.75 mL提供的2 M蔗糖缓冲液、2.25 mL提供的蔗糖缓冲液以及30 μL新鲜配制或解冻的1 M DTT，配制1.85 M蔗糖垫层溶液。
  注意：....

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结果

为研究POM121在人神经元细胞核中的核孔复合体（NPC）及核质分布与表达情况，按照先前所述方法¹⁵对对照组和C9orf72 iPSN进行诱导分化。获取死后人运动皮层组织及第32天的iPSN样本，裂解后按上述方法进行细胞核分离与免疫染色。通过超高分辨率结构照明显微镜（SIM）（Zeiss）对NeuN阳性的分离细胞核进行成像，并如前所述¹⁵采用默认的结构照明去卷积参数进行图像处理（工作流程见图1）。图像采集使用63倍油镜物镜、1倍放大倍数、HR Diode 448激光器（功率1%）、曝光时间100 ms、BP495-550/LP750发射滤光片、z轴层厚110 nm，以及5次光栅旋转。如图2中的三维最大强度投影所示，在iPSN及死后神经元细胞核中均可分辨出单个POM121信号点。随后使用FIJI或Imaris软件中的3D插件对这些图像进行信号点检测，方法如前所述¹⁵。与先前分析结.......

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讨论

鉴于近期研究已将核质转运（NCT）功能障碍确定为多种神经退行性疾病中一种早期且显著的现象¹⁶^,²⁷^,²⁸^,³⁰^,³¹，迫切需要深入探究该病理过程的发生机制。由于核孔复合体（NPC）及其各个核孔蛋白（Nup）对功能性NCT具有关键调控作用³⁹^,⁴¹，因此在神经退行性疾病模型中研究NPC的组成至关重要。然而，传统的宽场显微镜和共聚焦显微镜技术不足以分辨单个NPC⁴⁰^,⁴⁸^,⁴⁹^,

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

尸检人中枢神经系统组织由约翰斯·霍普金斯大学ALS尸检库和靶向ALS尸检组织中心提供。本研究工作得到了美国肌萎缩侧索硬化症协会（ALSA）米尔顿·萨芬诺维茨博士后奖学金（ANC）、美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）、美国国防部、肌萎缩侧索硬化症协会、肌肉萎缩症协会、F Prime基金、罗伯特·帕卡德肌萎缩侧索硬化症研究中心Answer ALS项目以及陈-扎克伯格倡议基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 锥形管	Fisher Scientific	14-959-49A
Beckman 超速离心机	Beckman Coulter
细胞刮刀	Sarstedt	83.183
胶原蛋白	Advanced Biomatrix	5005
盖玻片	MatTek	PCS-170-1818
细胞沉降装置（Cytofunnel）	Thermo Fisher Scientific	A78710020
Cytospin 4 细胞离心涂片机	Fisher Scientific	A78300003
Dounce 匀浆器	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma Aldrich	D0632
Eppendorf 管	Fisher Scientific	05-408-129
山羊抗鸡 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21449
山羊抗小鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029
山羊抗小鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11031
山羊抗小鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21236
山羊抗兔 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
山羊抗兔 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036
山羊抗兔 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21245
山羊抗大鼠 Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11006
山羊抗大鼠 Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11077
山羊抗大鼠 Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21247
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
正常山羊血清	Vector Labs	S-1000
Nuclei PURE Prep 核分离试剂盒	Sigma Aldrich	NUC201	包含裂解缓冲液、10% Triton X-100、2 M 蔗糖梯度液、蔗糖垫溶液和核储存缓冲液；在实验方案中引用为 "nuclei isolation kit"
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
PFA	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	在实验方案中引用为 "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti 超速离心转子	Beckman Coulter	369694	在实验方案中引用为 "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	15-250-061
超速离心管	Beckman Coulter	344058
核孔蛋白一抗			可用于免疫荧光检测单个核孔蛋白的一抗由多家公司提供

参考文献

Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron

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