本文介绍一种利用荧光标记蛋白结合基于BiFC的FRET-FLIM检测技术，可视化三种蛋白质伙伴之间三元复合物形成的方法。该方法对于研究蛋白质-蛋白质相互作用复合物具有重要价值。 体内.
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方法文章
通过BiFC-FRET-FLIM检测法测定MADS-box转录因子两个单体与钙感受蛋白之间的三元相互作用
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
蛋白质-蛋白质相互作用是细胞中所有生物过程的重要组成部分，因其在调控、维持和修复细胞功能方面发挥着关键作用。这些相互作用参与多种生物学现象，包括信号转导、病原体响应、细胞间相互作用以及代谢和发育过程。对于转录因子而言，此类相互作用可能导致亚基的寡聚化，或在特定亚细胞环境（如细胞核、细胞质等）中的隔离，进而对下游基因的表达产生更深远的影响。本文展示了一种用于可视化 体内 基于双分子荧光互补（BiFC）的荧光共振能量转移（FRET）结合荧光寿命成像（FLIM）的三元相互作用分析。本演示中选取的两种蛋白质作为BiFC配对伙伴相互作用，其重构的荧光信号用于检测与第三种蛋白之间的FRET-FLIM。实验采用生长室培养4至5周龄的植株 Nicotiana benthamiana 植物被用作本演示的模式植物系统。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）通过调控多种代谢和发育过程，构成了真核细胞正常功能的基础。某些PPI是稳定的，而另一些则具有瞬时性。根据相互作用中成员的数量和类型，可将这些相互作用分为二聚体、三聚体、四聚体同源多聚体以及异源多聚体1。对蛋白质相互作用的鉴定与表征有助于更深入地理解蛋白质功能及其调控网络。
转录因子是一类参与调控功能的蛋白质，通过与DNA结合来调节其下游基因的转录速率。有时，蛋白质的寡聚化或形成高级复合物是其发挥功能的前提条件2。植物MADS-box转录因子属于同源异型基因，可调控多种生物学过程，包括花转变、花器官发育、受精、种子发育、衰老以及营养生长。已知这些转录因子能够形成高级复合物并与DNA结合3,4。研究转录因子及其相互作用蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，有助于揭示转录调控背后的复杂机制。
瞬时蛋白表达在 Nicotiana benthamiana 已成为研究蛋白质定位或蛋白质-蛋白质相互作用的常用方法 在体5双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移（FRET）是研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法 体内 使用荧光报告系统6这两种技术的结合已被证明可揭示三种蛋白质之间的相互作用7FRET 通过受体光漂白、敏化发射和荧光寿命成像（FLIM）技术进行测量。基于荧光寿命的 FLIM-FRET 检测方法已成为一种能够提供精确量化以及分子间能量转移时空特异性的工具。8荧光寿命成像（FLIM）通过测量荧光分子在发射光子前处于激发态的时间来实现检测，其性能优于仅依赖荧光强度测量的技术。9,10. 除了诸如异源系统 Nicotiana benthamiana 以及洋葱表皮剥离物，最近的报道已证明其应用 拟南芥 根部和水稻幼苗等 体内 天然条件下蛋白质-蛋白质相互作用的分析11,12.
除了合适的表达系统外，双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移（FRET）实验中相互作用伙伴的选择也对实验成功至关重要。在将用于BiFC构型的蛋白对作为共轭伙伴应用于FRET实验之前，应使用适当的对照验证这些伙伴之间的蛋白质相互作用（PPI）13。BiFC技术依赖于荧光蛋白N端和C端片段的结构互补。大多数（即使不是全部）用于BiFC实验的荧光蛋白存在一个常见局限性，即两个无荧光的衍生片段之间可能发生自组装，导致假阳性荧光信号，并降低信噪比（S/N）14。近年来的发展，包括引入点突变或优化荧光蛋白的切割位置，已产生了一系列具有更高荧光强度、更强特异性和更高信噪比的BiFC配对系统15,16。这些荧光蛋白也可根据实验的具体需求用于开展BiFC实验。
传统上，CFP 和 YFP 已被用作 FRET 实验中的供体和受体组合17然而，研究发现YFP或m-Citrine作为FRET供体（与RFP作为受体联用时）效果更佳，因其在目标蛋白的天然表达过程中具有较高的量子产率（QY） 拟南芥 根系。在设计成功的BiFC-FRET-FLIM实验时，启动子（组成型与天然/内源型）和荧光蛋白的选择也起着关键作用。需要注意的是，FRET供体的效率以及FRET荧光对的适用性会随着所用启动子和表达生物系统的不同而发生变化。荧光蛋白的量子产率（QY）与其亮度相关，其值受pH、温度及所用生物系统的影响。我们建议在为FRET实验选择荧光蛋白对之前，充分考虑上述各项因素。本实验方案所使用的生物系统、启动子及蛋白与CFP-YFP荧光蛋白对配合良好，适用于BiFC FRET-FLIM实验。
在本研究中，我们结合荧光寿命成像技术（FLIM）的特性，利用基于双分子荧光互补的荧光共振能量转移（BiFC-based FRET）来可视化三种蛋白质分子之间的相互作用。该技术中，两种蛋白质分别与分裂的黄色荧光蛋白（YFP）片段融合，第三种蛋白质则与青色荧光蛋白（CFP）融合。由于我们关注的是MADS-box蛋白（M）同源二聚体与钙感应蛋白（C）之间的相互作用，因此将这些蛋白质分别标记荧光蛋白并克隆至pSITE-1CA和pSITE-3CA载体中。18在该实验中，两个相互作用的蛋白分别与pSPYNE-35S和pSPYCE-35S载体中的YFP的N端和C端片段融合标记19，它们的相互作用会重建出具有功能的YFP，后者作为FRET受体，与第三个相互作用伙伴（带有CFP标签，作为FRET供体）发生能量转移（图1）。在本案例中，通过在三种不同系统中进行双分子荧光互补（BiFC）实验，并结合酵母双杂交系统，已验证了两个M单体之间以及M与C之间的蛋白质相互作用。这些载体被转入 Agrobacterium tumifaciens 通过电穿孔将GV3101菌株转化。GV3101菌株含有一种缺失T-DNA的Ti质粒pMP90（pTiC58DT-DNA），具有庆大霉素抗性20p19蛋白 农杆菌 菌株随所有侵染过程一同加入，以防止转基因沉默21建议将这三种蛋白质也以相反的构型进行使用，以验证三者之间的相互作用。
在本技术中，我们采用了荧光寿命成像显微技术（FLIM），首先在无受体存在的情况下测量供体的荧光寿命（未淬灭的供体寿命）。随后，在受体存在的情况下测量其荧光寿命（淬灭的供体寿命）。利用供体荧光寿命的这一差异可计算FRET效率，该效率取决于表现出荧光寿命缩短的光子数量。下文详述了一种通过在Nicotiana benthamiana中瞬时表达荧光标记蛋白，并利用BiFC-FRET-FLIM检测其相互作用，以确定任意三种蛋白之间形成三元复合物的实验方案。
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方案
1. 基因在入门载体和目的载体中的克隆（图2）
- 通过 PCR 扩增目的基因（本研究中为 M 和 C 基因）的编码序列（CDS），并将其克隆至合适的入门载体中（例如 pENTR/D-TOPO 载体）； 见 表1 用于本实验的载体）。
- 在含有抗生素的平板上培养克隆。通过限制性酶切和DNA测序验证经抗生素筛选的克隆22,23.
- 将重组的CDS从入门克隆转移至目的载体（pSPYNE-35S、pSPYCE-35S、pSITE-1CA和pSITE-3CA），并通过限制性酶切验证序列从入门载体向目的载体的正确转移。
注意：本实验中使用的所有载体均列于 表1. - 最后，转化 农杆菌 GV3101 (pMP90 (GentR)) 细胞与目的载体通过电穿孔进行转化（图3)24.
2. Nicotiana benthamiana 植物的生长条件
注意：培养 烟草属 在对照条件下培养植物至4-6叶期。
- 培养 烟草属 植物，通过将市售的土壤混合物与椰糠和堆肥按2:1:1的比例混合来配制栽培基质。
- 在塑料托盘中铺上一层约2.5厘米厚的该土壤混合物以形成苗床，并用去离子水充分浸润。将约200粒种子均匀撒播于该苗床中。
- 将其转移至一个装有1 cm深静水的较大托盘中。用塑料薄膜覆盖该托盘，以形成一个保湿环境。
- 将此装置转移至设定好的生长室中 23 °C 16小时光照和8小时黑暗循环，光照强度为150-170 µmol/m2光照强度。
- 两周后，将幼苗移栽至盛有饱和水土壤混合物的小型花盆（3-4英寸）中。
- 将这些花盆放入塑料托盘中，并转移至生长室继续培养四周。
3. 准备用于农杆菌浸润的菌株
注意：进行农杆菌浸润时，需要将农杆菌菌株新鲜转接培养，并按适当比例与p19菌株混合使用。
- 制备含利福平的2xYT琼脂平板100 µg/mL），庆大霉素（25 µg/mL）和卡那霉素（kanamycin）50 µg/mL）用于含有 pSPYNE-35S 和 pSPYCE-35S 载体的农杆菌。对于含有 pSITE 载体的菌株，使用利福平（rifampicin）100 µg/mL），庆大霉素（25 µg/mL）和壮观霉素（50 µg/mL).
- 在超净工作台中，使用无菌接种环将含有质粒的农杆菌菌株划线接种到这些平板上。
- 孵育这些样本于 28 °C 在黑暗中孵育 48 小时。
- 从接种开始此操作步骤 农杆菌 携带BiFC和FRET载体（构建于pSPYNE-35S、pSPYCE-35S和pSITE载体中）的GV3101菌株，从划线平板中挑取单菌落，接种于10 mL含适当抗生素（利福平（Rifampicin）100 µg/mL），庆大霉素（gentamicin）25 µg/mL），卡那霉素（50 µg/mL）或壮观霉素（50 µg/mL)).
- 此外，通过将含有利福平的10 mL 2xYT液体培养基接种p19菌株的农杆菌来启动培养100 µg/mL）和卡那霉素（50 µg/mL).
注意：添加p19菌株以防止转基因沉默。 - 用铝箔覆盖烧瓶，并将其置于设定好的摇床培养箱中 28 °C 并在黑暗中以170 rpm转速振荡培养16小时。
- 过夜培养后，取1 mL该培养物转移至一次性比色皿中，使用分光光度计在600 nm处测定培养物的光密度（O.D.）。
- 将含有适当BiFC和FRET配对组分的菌株培养物混合，使每种培养物的终浓度O.D.为0.5，p19的O.D.为0.3，总体积为2 mL。
- 为达到这些比例，请使用以下公式：
OD获得 在 600 nm 处测定的培养物光密度
V培养 所需培养物体积
光密度最终 构建体为 0.5，p19 为 0.3
V最终 = 渗透的最终体积，即 2 mL
注意：本研究中所使用的载体组合详见于 表2. - 将混合的农杆菌培养物在 3,000 x g 室温下孵育5分钟，小心弃去上清液。将沉淀重悬于2 mL新配制的浸润缓冲液（10 mM MES， 100 µM 乙酸松脂醇和 10 mM MgCl2使用涡旋混合器制备均匀的细胞悬液。
- 将含有重悬细胞的试管置于室温避光条件下孵育3 h。
- 同时，用将要进行侵润的构建体混合物标记每个植物花盆。每种侵润混合物使用两株植物。
- 用1 mL无针注射器吸取农杆菌混合液。将叶片背面朝上，一手从叶片正面支撑，另一手将注射器轻轻但牢固地压在完全展开的叶片的下表皮表面。缓慢推动推杆，直至溶液渗入叶面区域，扩散范围相当于注射器尖端面积的2-3倍。
- 在每株植物的叶片上浸润最多四个位点，每株植物处理3-4片叶片，如图所示 图4.
注意：在处理不同样品之间应更换手套或用70%酒精擦拭手套，以防止交叉污染。 - 将所有花盆转移至托盘中，并在生长室中按照步骤2所述相同条件进行培养。
- 在不同时间点取少量农杆菌浸润的叶片，使用荧光显微镜进行观察。当细胞中可检测到YFP和CFP的荧光信号时，进行共聚焦显微镜下的BiFC-FRET FLIM分析。本实验在农杆菌浸润后第3天进行检测。
注意：针对每种启动子与基因组合，应单独设定农杆菌浸润后的孵育时间，以避免BiFC-FRET FLIM检测中使用的融合蛋白过度表达。伴侣蛋白的过度表达可能导致假阳性相互作用。
4. 准备用于荧光观察的载玻片
- 当植物样本准备好进行观察时，从侵染伤口处向外切割5-8 mm的方形叶片样本，并将样本置于洁净载玻片上的蒸馏水中制片。
注意：为尽量减少背景荧光，需先用80%乙醇清洗载玻片，再用蒸馏水冲洗3-4次，晾干后置于吸水纸上备用。 - 用洁净的盖玻片覆盖叶片样本，并用指甲油封片。
- 将样本置于共聚焦激光扫描显微镜下进行观察。
5. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行FRET-FLIM分析
注意：本实验中，检测和量化两种蛋白质间相互作用的基础是当FRET供体与受体相互作用时，其荧光寿命的减少，该减少程度可用于计算FRET效率。在三元相互作用的情况下，复杂性进一步增加，因为此处的FRET受体并非单一分子，而是一对分裂的YFP-BiFC蛋白，必须首先完成重组 体内 成为功能性FRET-受体荧光团。进行FRET-FLIM实验时，需要首先测定供体分子在无FRET伴侣存在时的荧光寿命，然后测定其在FRET伴侣存在下的荧光寿命。
- 在共聚焦激光扫描显微镜中打开FLIM应用程序，启动控制台，并使用模式识别光子计数法测量荧光寿命。选择标准的“全光子计数”测量模式。
- 分析两种农杆菌浸润植物的样品：一种仅含有供体（C-CFP），另一种同时含有供体和受体（C-CFP 与 M-YFP）。
注意：由于M蛋白与C蛋白的相互作用已通过BiFC和Y2H验证，因此预期该相互作用对将表现出良好的FRET效率。 - 接下来，扫描经C-CFP农杆菌浸润的叶片，选择一个CFP荧光良好的细胞进行观察。启动激光扫描模式，并将系统设置为CFP成像和荧光寿命成像测量（λex 440 nm 脉冲激光，λem 480-520 nm（使用混合探测器，扫描速度为512 × 512像素，400 Hz）
- 调整焦距、变焦和智能增益，以聚焦需要捕获的区域。
- 以足够的激光功率激发样品，使每脉冲捕获约0.1个光子。对于荧光强度可变的样品，采集50帧以获得寿命测量所需的足够光子数。由于CFP存在构象适应，表现出两种荧光寿命；因此，采用n指数重卷积模型对数据进行拟合，其中n值固定为2。
- 在这些设置下，CFP 显示出 1.0 和 3.2 ns 的两个寿命。此处，所有后续计算均采用较长的 3.2 ns 寿命。25,26.
- 为了利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）计算FRET效率（即两种蛋白质间相互作用程度的度量），取一个共浸润了C-CFP和M-YFP的叶片样本。寻找同时表达C-CFP和M-YFP的细胞，并通过使用λ激发来确认它们各自的发射模式ex 440 nm 脉冲激光，λem 480-520 nm 和 λex 514 nm 白光激光器，配备 λem 526-550 nm。依次扫描并鉴定同时显示 CFP 和 YFP 荧光的细胞。
- 在确认两种蛋白质的荧光信号后，切换至FLIM控制台，使用此前测量C-CFP寿命时的相同设置（步骤5.5）来测量CFP的寿命。
注意：该细胞还表达可能与C-CFP相互作用并导致C-CFP荧光寿命缩短的M-YFP。 - 使用双指数重卷积模型（n = 2）对获得的曲线进行拟合。观察到CFP的荧光寿命从3.2 ns减少至2.6 ns，表明CFP与YFP之间发生了弗斯特共振能量转移（Förster resonance energy transfer图5A).
- 现在在软件中启动FRET控制台，并通过在软件提供的公式中手动输入未淬灭供体寿命来计算FRET效率。测得的FRET效率为：56%。
- 三元相互作用
- 最后，为了可视化三个组分之间的相互作用，取用共浸润了 C-CFP、M-YFPn 和 M-YFPc 的植物叶片样本。
- 扫描叶片外植体，寻找同时显示CFP荧光和由两个M蛋白之间BiFC相互作用产生的重组YFP荧光的细胞。使用与之前相同的激光和发射波长。
- 随后，关闭 514 nm 激光器并进入 FLIM 控制台。
注意：如果 M-YFP 二聚体与 C-CFP 发生相互作用，应观察到 C-CFP 的荧光寿命缩短，如同其与 M-YFP 相互作用时所观察到的现象。然而，如果 C-CFP 未能与 M-YFP 二聚体发生相互作用，其荧光寿命应保持在 3.2 ns。 - 采用与上述相似的设置，测量在存在重建的YFP时CFP的荧光寿命。使用双指数重卷积模型（n = 2）对获得的曲线进行拟合，然后转入FRET分析界面。
注意：CFP 的荧光寿命从 3.2 ns 下降至 2.3 ns。按照上述方法计算 FRET 效率，计算得到的 FRET 效率为 55%。供体荧光寿命的减少以及 55% 的良好 FRET 效率证实了两个 M 蛋白与 C 蛋白之间存在三元相互作用。 体内 （参见 图 5B).
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结果
本方案提供了一种优化的方法，用于研究植物体内三元蛋白质-蛋白质相互作用。in vivo 实验的基本原理是结合两种荧光标记的蛋白质相互作用技术，即双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移（FRET），以建立检测三个蛋白质组分之间形成三元复合物的分析方法。在此，我们采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）来测量在有或无FRET受体存在时FRET供体组分的荧光寿命。若两个蛋白质之间存在正向相互作用，则预期供体的荧光寿命会降低。我们首先测量了供体（即C-CFP蛋白）的荧光寿命。实验中采用了“全光子计数”测量模式，该模式利用感兴趣区域（ROI）内的所有光子生成荧光衰减曲线，所得寿命值的误差小于传统的符合单光子计数法。高速FLIM滤光片可确保脉冲之间仅使用单光子事件。随后选择合适的数学模型，对衰减曲线进行逐像素计算与拟合27。
此处使用的 CFP 变体（也是最常用的变体）具有构象适应性，会导致两种荧光寿命。因此，我们选择采用多指数供体模型来拟合荧光衰减曲线。该方法可将 CFP 的两种寿命分离开，在本实验中测得的两种寿命分别为 1...
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讨论
本实验方案展示了如何利用基于双分子荧光互补（BiFC）的荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）检测方法，来确定MADS-box蛋白的两个单体与一种钙感应蛋白之间三元复合物的形成。该方案改编自Y. John Shyu等人发表的研究，他们曾开发了一种基于BiFC的FRET方法，通过敏化发射法可视化Fos-Jun异源二聚体与NFAT或p65之间形成的三元复合物7。此前，Galperin及其同事于2004年开发了一种三荧光团FRET系统29，但该系统需要六种滤光片，依赖复杂的显微镜装置。此外，在图像采集过程中细胞器（如内体）的快速运动也带来了实验上的困难。相比之下，基于BiFC的FRET-FLIM仅需两种荧光团的滤光片，显微镜配置更为简化。该系统可直接可视化三元复合物，而三荧光团FRET系统则无法实现这一点。与BiFC-FRET系统相比，该方法在定量性和稳健性方面更具优势，优于依赖敏化发射的FRET测量7。在本检测中，通过测量单个光子的荧光寿命来计算FRET效率，而非依赖供体与受体分子相对...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
NB、GG、SB、KC 衷心感谢大学拨款委员会（UGC）、UGC-BSR、DBT-INSPIRE 以及科学与工业研究委员会（CSIR）提供的研究奖学金。我们谨此感谢印度政府生物技术部（DBT）和印度政府科学技术部（DST-FIST）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 无针注射器 | Dispovan | - | |
| 乙酰丁香酮 | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Gateway LR Clonase II 酶混合物 | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | 本研究中使用的载体基于 Gateway 系统 |
| 硫酸庆大霉素 | Himedia | CMS461 | |
| 硫酸卡那霉素 | Himedia | MB105 | |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| MgCl₂ | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | K240020 | 本研究中使用的载体基于 Gateway 系统 |
| Phusion 高保真 Taq DNA 聚合酶 | Thermo Fischer Scientific | F530-S | 任何高保真聚合酶均可使用 |
| 利福平 | Himedia | CMS1889 | |
| SP8 FALCON 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | SP8 FALCON | 任何具备荧光寿命成像（FLIM）功能的共聚焦激光扫描显微镜均可用于此分析 |
| 盐酸双氢链霉素五水合物 | Himedia | TC034 |
参考文献
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