通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

摘要

本方案介绍了一种在结构保持完整的染色质中对复制位点进行高分辨率定位的技术 原位 采用预包埋EdU-链霉亲和素-纳米金标记与ChromEMT相结合的方法。

摘要

细胞核内DNA折叠的基本原理及其在执行基本遗传功能（转录、复制、分离等）过程中发生的动态变化仍知之甚少，部分原因在于缺乏能够在结构完整保存的细胞核中以高分辨率可视化特定染色质位点的实验方法。本文介绍了一种用于在单层细胞培养中可视化复制结构域的实验方案 原位, 通过结合EdU标记新合成的DNA，随后利用纳米金颗粒的银增强法检测标记，并结合染色质的ChromEM染色。该方案实现了高对比度、高效率的包埋前标记，适用于传统的戊二醛固定，可在室温样本处理中实现染色质结构的最佳保存。包埋前标记的另一优势在于可预先选择目标细胞进行切片。这对于异质性细胞群体的分析尤为重要，同时兼容电子断层成像技术，可用于复制位点染色质结构的高分辨率三维分析，以及间期复制后染色质重排和姐妹染色单体分离的分析。

引言

DNA复制是细胞分裂过程中忠实拷贝和传递遗传信息所必需的基本生物学过程。在高等真核生物中，DNA复制受到严格的时空调控，表现为复制起始位点的有序激活¹。相邻且同步激活的复制起始位点形成复制子簇²。在光学显微镜水平上，正在进行DNA复制的位点表现为数量和大小各异的复制灶。复制灶在细胞核内的空间分布呈现特定模式，该模式取决于被标记DNA的复制时间^3,4，而复制时间又与其基因活性密切相关。由于DNA复制具有明确定义的时空有序序列，因此复制标记是一种精确标记DNA的有力方法，不仅可用于研究复制过程本身，还可用于区分具有特定转录活性和压缩程度的DNA亚组分。复制染色质的可视化通常通过检测DNA复制机器的主要蛋白质组分（免疫染色或表达荧光蛋白标签^5,6）或通过掺入修饰的DNA合成前体^7,8,9,10来实现。其中，只有基于将修饰核苷酸掺入新复制DNA的方法能够捕捉复制过程中染色质的构象变化，并追踪复制完成后复制区域的行为。

在高等真核生物中，DNA以染色质形式进行包装，为基本遗传功能（如转录、复制、修复等）的调控增添了另一层复杂性。染色质的折叠方式影响DNA对调控转录因子的可及性，以及模板合成所必需的DNA构象变化（如双螺旋解旋）。因此，普遍认为细胞核内依赖DNA的合成过程需要染色质从高度凝缩、抑制性的状态转变为更易接近、开放的构象。从细胞学角度，这两种染色质状态被定义为异染色质和常染色质。然而，目前对于细胞核内DNA折叠模式仍无统一共识。相关假说范围从 "聚合物熔体" 模型¹¹，其中核小体纤维表现为一种随机聚合物，其堆积密度由相分离机制调控，而层次化折叠模型则假设染色质纤维样结构按顺序逐步形成且厚度逐渐增加^12,13。近期，基于分子方法并通过对分析的层级折叠模型获得了支持 原位 DNA-DNA 相互作用（染色体构象捕获，3C），揭示了染色质结构域层级的存在¹⁴值得注意的是，复制单元与这些染色质结构域具有高度相关性。¹⁵这些模型的主要批评源于样品制备过程中可能引起的人工染色质聚集，例如细胞膜的通透化处理以及非染色质组分的去除，这些操作旨在提升染色质在超微结构研究中的对比度，同时增强各类探针（如抗体）对染色质的可及性。近年来，在电子显微镜下通过DNA结合荧光染料介导的二氨基联苯胺光氧化实现选择性DNA染色的技术取得了进展（ChromEMT）⁶) 使得这一障碍得以消除。然而，对于复制中 DNA 的电子显微镜观察，同样的问题仍然存在。^17,18本文描述了一种可在完整醛交联细胞中同时实现新合成DNA与总染色质高分辨率超微结构定位的技术。该技术结合了通过点击化学反应检测EdU标记DNA的生物素化探针与链霉亲和素-纳米金标记方法，并整合了ChromEMT技术。

方案

该方案针对贴壁细胞进行了优化，并已在HeLa、HT1080和CHO细胞系上进行测试。

1. 细胞标记与固定

1. 将细胞接种于经酸处理的盖玻片上，置于3 cm培养皿中。使用推荐的培养基将细胞培养至70%汇合度。
2. 从10 mM储存液中加入EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）至终浓度为10 µM，并将细胞放入培养箱中孵育10分钟或更长时间（根据实验目的而定）。对于较短的脉冲标记（不超过2分钟），应预先准备含有10 µM EdU的预温新鲜培养基的培养皿，然后将盖玻片转移至其中，而不是直接向细胞中添加EdU。
   注意：除非另有说明，后续所有步骤均在室温下进行。
3. 用2.5%戊二醛固定标记的细胞，该溶液由25%储存液用100 mM卡可基二酸缓冲液新鲜稀释而成，固定1小时。
   注意：后续的EdU检测步骤对固定时间敏感。过长的固定时间可能对EdU标记产生不利影响，导致信噪比降低。
4. 用含5 mM MgCl₂的PBS（此后简称PBS*）洗涤样品以去除戊二醛。每次洗涤孵育10分钟，共洗涤三次。
5. 用含1% Triton X-100的PBS*（此后简称PBS*T）对细胞膜进行通透处理。每次孵育5分钟，共洗涤两次。
6. 用PBS*对样品进行充分洗涤。更换溶液五次，每次孵育5分钟。
7. 用含20 mM甘氨酸的PBS*淬灭残余游离醛基，每次10分钟，共两次。
8. 在含1% BSA的PBS*中封闭样品30分钟。

2. 点击反应

注意：本实验步骤改编自先前已发表的方案¹⁹。

1. 使用前立即配制用于 EdU 检测的 Click 反应混合液：在微量离心管中，加入 430 µL 100 mM Tris-HCl（pH = 8.5）、20 µL 100 mM CuSO₄、1.2 µL 叠氮生物素（10 mM 溶于 DMSO）和 50 µL 0.5 M 抗坏血酸。为在荧光显微镜水平对复制标记和 Click 反应步骤进行质量控制，可将叠氮生物素替换为 AlexaFluor 488-叠氮化物。
   注意：上述反应中各组分的添加顺序至关重要。
2. 在湿盒中进行 Click 反应，以尽量减少反应混合液的蒸发和浓度变化。通过在培养皿底部放置一张湿润的滤纸，并用石蜡膜覆盖来制备湿盒。将载玻片细胞面向上置于石蜡膜表面，然后在载玻片上覆盖 50–100 µL 反应混合液。反应在室温下进行 30 分钟。
3. 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS*（PBS*T）洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 5 次，以终止反应。
4. 在含 1% BSA 的 PBS*T 中封闭 30 分钟，室温进行。
5. 用含 1% BSA 的 PBS*T 配制链霉亲和素-纳米金溶液。将样品与偶联了 1.4 nm 纳米金颗粒（Nanoprobes）的链霉亲和素在 1% BSA + PBS*T 中于 +4 °C 过夜孵育，置于新制备的湿盒中。
6. 终止反应，并用 PBS*T 洗涤样品，每次 10 分钟，共洗 5 次。
7. 用含 1% 戊二醛的 PBS* 后固定 30 分钟，以稳定生物素-链霉亲和素复合物。
8. 用去离子水充分洗涤以去除戊二醛，再用 PBS* 洗涤样品，每次 20 分钟，共洗 5 次。
9. 用新鲜配制的 1 mg/mL NaBH₄ 水溶液淬灭游离醛基，每次 10 分钟，共处理两次。孵育过程中会产生 H₂ 气泡，可能导致载玻片翘起。请用镊子小心将其压回原位。
10. 用去离子水洗涤 5 次，每次 5 分钟。
    注意：为在标记步骤进行质量控制，建议使用荧光标记的链霉亲和素进行对照标记（图 2）。这可在进入后续繁琐且易产生假象的步骤之前，评估标记强度和背景水平。

3. 抗原扩增

注意：本实验步骤改编自 Gilerovitch 等人，1995 年（见 ^20,21）。

1. 将50 g阿拉伯胶粉末重悬于100 mL去离子水中。溶解3天，脱气后通过四层纱布过滤。分装至50 mL离心管中，每管5 mL，冷冻保存。使用前立即解冻。
2. 向5 mL已解冻的阿拉伯胶溶液中加入2 mL 1 M MES（pH = 6.1），配制成7 mL含0.28 M MES（pH = 6.1）的阿拉伯胶溶液。缓慢摇动离心管30分钟使其混合均匀，并用铝箔包裹避光。
3. 与步骤3.2同时进行，用洗涤缓冲液（50 mM MES，pH = 5.8，200 mM蔗糖）清洗盖玻片，每次10分钟，共洗三次。
4. 配制新鲜的没食子酸丙酯（NPG）溶液。取10 mg NPG溶于250 µL 96%乙醇中，再用去离子水定容至5 mL，置于15 mL离心管中。
5. 取36 mg乳酸银置于用铝箔包裹的15 mL离心管中。
6. 在完成步骤3.2后，向阿拉伯胶溶液中加入1.5 mL NPG溶液，再缓慢摇动3分钟。
   注意：后续所有步骤均在暗室中进行。使用非感光安全灯（黄色或红色）。
7. 用洗涤缓冲液平衡样品后进入暗室。同时，向乳酸银中加入5 mL去离子水，剧烈震荡1–2分钟使其溶解。
8. 将1.5 mL乳酸银溶液加入阿拉伯胶混合液中，缓慢摇动1分钟。避免产生气泡，因为混合液中的氧气会减缓反应速度。
9. 倒掉培养皿中的溶液，将3 mL乳酸银-阿拉伯胶混合液加入含有细胞的培养皿中。轻轻晃动数次，孵育2–5分钟。孵育时间取决于阿拉伯胶批次和温度，需通过实验确定。
   注意：孵育时间过长可能导致非特异性银染。
10. 为终止反应，倒掉反应混合液，并用去离子水彻底洗涤培养皿，更换3–5次；随后再更换三次，每次5分钟。
11. 在明场显微镜下检查染色结果。理想染色呈浅棕色至深棕色，背景呈极淡的黄色。
    ​注意：若染色未显现，可立即使用已配制的混合液重复染色（混合液在避光条件下活性约维持15分钟）。但此时染色可能发展过快。

4. 金增强

注意：为了防止银纳米颗粒在后续步骤中因四氧化锇（OsO₄）氧化而溶解，本步骤采用金浸渍法进行保护（Sawada, Esaki, 1994）²²。

1. 用去离子水冲洗盖玻片。
2. 为防止锇酸（OsO₄）氧化导致银纳米颗粒溶解，将样品在0.05%四氯金酸溶液中避光孵育2分钟。
3. 用去离子水彻底清洗10分钟。
   ​注意：此步骤可为含DNA的材料增加额外对比度。样品颜色应由棕色变为黑色。

5. ChromEM

注意：本方案修改自 Ou 等人，2017¹⁶。

1. 将盖玻片置于10 µM DRAQ5的PBS溶液中，避光孵育10分钟，使样本充分染色。
2. 在50 mM Tris或PBS中配制0.2% 四盐酸二氨基联苯胺（DAB）溶液：
   在避光条件下剧烈搅拌，将DAB溶解于最终体积90%的缓冲液中，然后用NaOH调节pH至7.0–7.4。加缓冲液至最终体积，经0.22 µM滤膜过滤后，用铝箔包裹避光保存。
3. 向细胞中加入DAB溶液（每3 cm培养皿加2 mL），孵育1分钟。
4. 将盖玻片转移至玻璃底培养皿中，并放置于倒置显微镜载物台上。使用金属卤化物光源和Cy5滤光片组（聚焦平面处波长640 nm，光强1 W/cm²），通过Plan Apo λ 40×物镜（NA = 0.95）对样本进行照射（多个视野），持续10分钟。
   ​注意：DAB光转化成功的标志是DRAQ5完全光漂白，并在受照细胞核中形成深色DAB沉淀。然而，当EdU-银-金信号较强时（尤其是使用较长EdU脉冲标记时），后者可能不易观察。
5. 用去离子水洗涤三次，每次5分钟。

6. 脱水与环氧树脂包埋

1. 在微量离心管中，将2%的K4Fe(CN)6水溶液与等体积的2% OsO4水溶液混合，配制部分还原的四氧化锇溶液。₄，使两种组分的终浓度均为1%。将盖玻片置于还原性OsO₄中孵育₄ 孵育1小时，然后用去离子水洗涤3次，每次5分钟。
   注意：在此阶段，还原的锇化合物会与DAB沉积物发生反应，从而增强DNA的对比度。
   警告：锇具有毒性，需在通风橱中操作，并根据当地安全法规处理废弃物。
2. 依次使用浓度递增的梯度乙醇溶液对样品进行脱水：50% EtOH - 3 × 10 min；70% EtOH - 3 × 10 min；80% EtOH - 3 × 10 min；96% EtOH - 3 × 10 min；100% EtOH - 3 × 10 min。
3. 用于浸润和包埋的树脂配方组分体积比为：环氧树脂单体:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23（w/w）。该配方可与乙醇混溶。
   1. 将盖玻片在乙醇-树脂混合液（3 份 100% EtOH : 1 份环氧树脂）中孵育 30 分钟。
   2. 将盖玻片在乙醇-树脂混合液（1 份 100% EtOH : 1 份环氧树脂）中孵育 2 h。
   3. 将盖玻片在乙醇-树脂混合液（1份100% EtOH : 3份环氧树脂）中孵育过夜。
   4. 将乙醇-树脂混合液更换为新配制的纯树脂。在纯树脂中孵育8小时。打开培养皿，使残留的乙醇挥发。
   5. 将盖玻片转移至含有纯树脂的新培养皿中，在37-42 °C下孵育2小时。
   6. 将新配制的树脂注入硅胶模具中。将细胞面朝下的盖玻片放置于盛有环氧树脂的适当硅胶模具上。在37 °C下固化树脂24小时，随后在60 °C下至少固化2天。
      警告：环氧树脂混合物的组分可能具有致癌性。请佩戴手套并在通风橱中操作。
4. 从模具中取出树脂块，用手术刀或剃刀清洁盖玻片表面。要移除盖玻片，先将盖玻片浸入液氮中，然后将树脂块转移至沸水中。如有必要，可重复此步骤。
5. 在体视显微镜下定位辐照区域，并使用钢锯或其他合适工具从样品块中切割出来。如有需要，可在加热板上将样品块预热至 70 °C。
6. 将切下的样品固定到超薄切片机的样品 holder 中，进行最终修块。使用刀片修成金字塔形状的样品。将带有金字塔形样品的 holder 安装到超薄切片机上，并安装刀片。
   1. 修整组织块，确保包含经EdU标记的辐照细胞。制备适合电子断层扫描的半薄切片（厚度250 nm）。
      注意：切片厚度可根据实验要求进行调整。
7. 将切片从刀刃上取下并置于单槽载网上。用于电子断层扫描时，将250 nm的切片转移至1 mm单槽载网上，干燥后可从两侧进行碳镀膜。无需额外染色。
   注意：由于切片中已含有高对比度的 Au-Ag 颗粒，无需在切片表面添加标志金颗粒。
8. 在透射电子显微镜下以低倍率（约600倍）观察载网，定位具有适当复制模式的细胞。
   ​注意：本实验方案产生的标记密度足以在低倍镜下轻松检测到复制灶。建议首先创建切片的定位图，以便后续导航及用于断层扫描的角投影采集。然后切换至高倍镜，采集高分辨率图像。

7. 电子断层扫描技术

1. 使用高倾角样品台将载网插入透射电子显微镜中。将样品装入电子显微镜并定位到目标区域。
2. 将显微镜调整至EFTEM模式，并设置为近似平行照明模式。调节能量过滤器，将20 eV的能量选择狭缝置于零损失峰位置。
3. 对断层扫描采集区域进行预辐照，剂量率为40 e/Ų/s，持续至少1.5–2分钟，总剂量至少达到3000 e/Ų。
4. 在SerialEM中使用自动任务调节同心高度。检查自动对焦任务，确保其在零倾角及-0.8 μm目标离焦值下正常工作。
5. 通过Walk-Up任务将样品台倾斜至-60°。
6. 设置从-60°到+60°的断层扫描采集，步长为2.0°。曝光时间应根据倾角进行调整，以保持相机上的平均图像强度。限制图像偏移，以防引起能量漂移从而导致狭缝错位。断层扫描数据应保存为.mrc文件。
7. 将.mrc文件导入IMOD软件进行断层重建。去除因X射线引起的异常像素值。
8. 对倾转系列图像进行对齐。先执行初始互相关对齐，然后手动标记10–12个金颗粒作为标志点。追踪标志点模型，并检查每个标志点在整个倾转系列中的追踪是否正确。生成样本断层图（切片），并手动标记超薄切片的边界，以防止重建体积内密度结构发生倾斜。精细对齐的平均残差小于1.2像素。
9. 采用滤波反投影算法重建断层图，然后裁剪输出结果，使目标区域适配至最终体积范围内。

结果

哺乳动物细胞核中的复制灶在细胞核内的分布呈现出不同的模式，这些模式随S期的进程而变化。这些分布模式与正在复制的基因座的转录活性相关。由于本文所采用的方法使用了较强的固定程序，因此即使在室温化学固定以获得最佳染色质结构保存的条件下，也能够较为简便地利用复制期脉冲标记来特异性检测处于不同转录状态的染色质区域。

质量控制步骤旨在确保本方案中关键操作的成功完成。首先，应通过与荧光标记的叠氮化物进行点击反应来确认EdU标记是否成功，若使用异质细胞群体，则应显示出典型的复制模式（图2）。第二个重要步骤是链霉亲和素标记，该步骤可能受到戊二醛固定的显著影响。为评估链霉亲和素结合效率，可在与链霉亲和素-纳米金（streptavidin-Nanogold）相同的条件下使用AlexaFluor-488标记的链霉亲和素进行检测（图3）。此时，可能会出现一定程度的背景信号，主要源于戊二醛的自发荧光以及链霉亲和素未完全洗脱。如果信噪比不可接受，可尝试在步骤2.6中增加洗涤次数和延长洗涤时间。...

讨论

本文所述方法相较于先前发表的方案具有多项优势。首先，利用点击化学法标记复制的DNA，避免了使用抗体检测BrdU前必需的DNA变性步骤，从而更好地保持了染色质的超微结构。

其次，利用生物素作为交联剂戊二醛固定后并适当淬灭未结合的醛基所生成的第二配体，可最大限度减少对靶标的化学修饰，从而在提高标记效率的同时降低内源性生物素导致的背景信号。生物素-链霉亲和素系统还具有良好的通用性，使用荧光标记的链霉亲和素可在实验早期阶段方便地进行质量控制。通过引入荧光纳米金标记的链霉亲和素可进一步简化实验流程，但在我们的实验中，这类试剂相比纳米金标记链霉亲和素会产生略高的背景信号，可能与探针分子尺寸较大有关。

第三，使用多种小型探针，其中链霉亲和素-纳米金的尺寸最大，约为5 nm，能够很好地穿透即使经过戊二醛交联的细胞。这使得该技术适用于超微结构保存良好的细胞的包埋前标记，并且可轻松兼容多种三维电子显微镜技术，包括连续切片重建、阵列断层成像、电子断层扫描、连续块面成像以及聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-吗啉基)乙磺酸 (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-叠氮化物	Termo Fisher	A20012
生物素-叠氮化物	Lumiprobe	C3730
牛血清白蛋白	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
环氧树脂单体	SPI-CHEM	90529-77-4
戊二醛（25%，电镜级）	TED PELLA, INC	18426
阿拉伯树胶	ACROS Organics	258850010
氯化镁	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-丙基没食子酸酯	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
乳酸银	ALDRICH	359750-5G
链霉亲和素-AlexaFluor 488 偶联物	Termo Fisher	S11223
链霉亲和素-纳米金偶联物	Nanoprobes	2016
四氯金酸	SIGMA-ALDRICH	HT1004
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)	CHEM-IMPEX INT'L	298
吐温 X-100	Fluka Chemica	93420
仪器
碳镀膜仪	Hitachi
单槽铜网	Ted Pella	1GC10H
Cy5 荧光滤光片组 (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	替代产品：Zeiss、Leica、Olympus
45o 湿用超薄金刚石刀	Diatome	DU	替代产品：Ted Pella
荧光显微镜	Nikon	Ti-E	替代产品：Zeiss、Leica、Olympus
高倾角样品台	Jeol
旋转仪	Biosan	Multi Bio RS-24
在EFTEM模式下以200 kV运行、配备高倾角测角仪的透射电子显微镜	Jeol	JEM-2100	替代产品：FEI、Hitachi
镊子	Ted Pella	523
超薄切片机	Leica	UltraCut-E	替代产品：RMC
软件
图像采集	开源	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
图像处理	开源	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)