通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

摘要

本方案介绍了一种在结构保持完整的染色质中对复制位点进行高分辨率定位的技术 原位 采用预包埋EdU-链霉亲和素-纳米金标记与ChromEMT相结合的方法。

摘要

细胞核内DNA折叠的基本原理及其在执行基本遗传功能（转录、复制、分离等）过程中发生的动态变化仍知之甚少，部分原因在于缺乏能够在结构完整保存的细胞核中以高分辨率可视化特定染色质位点的实验方法。本文介绍了一种用于在单层细胞培养中可视化复制结构域的实验方案 原位, 通过结合EdU标记新合成的DNA，随后利用纳米金颗粒的银增强法检测标记，并结合染色质的ChromEM染色。该方案实现了高对比度、高效率的包埋前标记，适用于传统的戊二醛固定，可在室温样本处理中实现染色质结构的最佳保存。包埋前标记的另一优势在于可预先选择目标细胞进行切片。这对于异质性细胞群体的分析尤为重要，同时兼容电子断层成像技术，可用于复制位点染色质结构的高分辨率三维分析，以及间期复制后染色质重排和姐妹染色单体分离的分析。

引言

DNA复制是细胞分裂过程中忠实拷贝和传递遗传信息所必需的基本生物学过程。在高等真核生物中，DNA复制受到严格的时空调控，表现为复制起始位点的有序激活¹。相邻且同步激活的复制起始位点形成复制子簇²。在光学显微镜水平上，正在进行DNA复制的位点表现为数量和大小各异的复制灶。复制灶在细胞核内的空间分布呈现特定模式，该模式取决于被标记DNA的复制时间^3,4，而复制时间又与其基因活性密切相关。由于DNA复制具有明确定义的时空有序序列，因此复制标记是一种精确标记DNA的有力方法，不仅可用于研究复制过程本身，还可用于区分具有特定转录活性和压缩程度的DNA亚组分。复制染色质的可视化通常通过检测DNA复制机器的主要蛋白质组分（免疫染色或表达荧光蛋白标签^5,6）或通过掺入修饰的DNA合成前体^7,8,9,10来实现。其中，只有基于将修饰核苷酸掺入新复制DNA的方法能够捕捉复....

方案

该方案针对贴壁细胞进行了优化，并已在HeLa、HT1080和CHO细胞系上进行测试。

1. 细胞标记与固定

1. 将细胞接种于经酸处理的盖玻片上，置于3 cm培养皿中。使用推荐的培养基将细胞培养至70%汇合度。
2. 从10 mM储存液中加入EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）至终浓度为10 µM，并将细胞放入培养箱中孵育10分钟或更长时间（根据实验目的而定）。对于较短的脉冲标记（不超过2分钟），应预先准备含有10 µM EdU的预温新鲜培养基的培养皿，然后将盖玻片转移至其中，而不是直接向细胞中添加EdU。
   注意：除非另有说明，后续所有步骤均在室温下进行。
3. 用2.5%戊二醛固定标记的细胞，该溶液由25%储存液用100 mM卡可基二酸缓冲液新鲜稀释而成，固定1小时。
   注意：后续的EdU检测步骤对固定时间敏感。过长的固定时间可能对EdU标记产生不利影响，导致信噪比降低。
4. 用含5 mM MgCl₂的PBS（此后简称PBS*）洗涤样品以去除戊二醛。每次洗涤孵育10分钟，共洗涤三次。
5. 用含1% Triton X-100的PBS*（此后简称PBS*T）对细胞膜进行通透处理。每次孵育5分钟，共洗涤两次。
6. 用PBS*对样品进行充分洗涤。更换溶液五次，每次孵育5分钟。
7. 用含20 m....

结果

哺乳动物细胞核中的复制灶在细胞核内的分布模式随着S期的进程而呈现不同的特征。这些模式与正在复制的基因座的转录活性相关。由于本文所介绍的方法采用了较强的固定程序，因此即使在室温化学固定以获得最佳染色质结构保存的条件下，也能够较为简便地利用复制性脉冲标记来特异性检测处于不同转录状态的染色质位点。

质量控制步骤旨在确保本方案中关键操作的成功完成。首先，应通过与荧光标记的叠氮化物进行点击反应来确认EdU标记是否成功，若使用异质细胞群体，则应显示出典型的复制模式（图2）。第二个重要步骤是链霉亲和素标记，该步骤可能受到戊二醛固定的显著影响。为评估链霉亲和素结合效率，可在与链霉亲和素-纳米金相同条件下使用AlexaFluor-488标记的链霉亲和素（图3）。此时，可能会出现一定程度的背景信号，主要源于戊二醛的自发荧光以及链霉亲和素未完全洗脱。如果信噪比不可接受，可尝试在步骤2.6中增加洗涤次数和洗涤时间。或者，在步骤1.5之后增加使用NaBH₄淬灭戊二醛的.......

讨论

本文所述方法相较于先前发表的方案具有多项优势。首先，利用点击化学法标记复制的DNA，避免了使用抗体检测BrdU前必需的DNA变性步骤，从而更好地保持了染色质的超微结构。

其次，利用生物素作为交联剂戊二醛固定后并适当淬灭未结合的醛基所生成的第二配体，可最大限度减少对靶标的化学修饰，从而在提高标记效率的同时降低内源性生物素导致的背景信号。生物素-链霉亲和素系统还具有良好的通用性，使用荧光标记的链霉亲和素可在实验早期阶段方便地进行质量控制。通过引入荧光纳米金标记的链霉亲和素可进一步简化实验流程，但在我们的实验中，这类试剂相比纳米金标记链霉亲和素会产生略高的背景信号，可能与探针分子尺寸较大有关。

第三，使用多种小型探针，其中链霉亲和素-纳米金的尺寸最大，约为5 nm，能够很好地穿透即使经过戊二醛交联的细胞。这使得该技术适用于超微结构保存良好的细胞的包埋前标记，并且可轻松兼容多种三维电子显微镜技术，包括连续切片重建、阵列断层成像、电子断层扫描、连续块面成像以及聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-吗啉基)乙磺酸 (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-叠氮化物	Termo Fisher	A20012
生物素-叠氮化物	Lumiprobe	C3730
牛血清白蛋白	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
环氧树脂单体	SPI-CHEM	90529-77-4
戊二醛（25%，电镜级）	TED PELLA, INC	18426
阿拉伯树胶	ACROS Organics	258850010
氯化镁	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-丙基没食子酸酯	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
乳酸银	ALDRICH	359750-5G
链霉亲和素-AlexaFluor 488 偶联物	Termo Fisher	S11223
链霉亲和素-纳米金偶联物	Nanoprobes	2016
四氯金酸	SIGMA-ALDRICH	HT1004
三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)	CHEM-IMPEX INT'L	298
吐温 X-100	Fluka Chemica	93420
仪器
碳镀膜仪	Hitachi
单槽铜网	Ted Pella	1GC10H
Cy5 荧光滤光片组 (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	替代产品：Zeiss、Leica、Olympus
45o 湿用超薄金刚石刀	Diatome	DU	替代产品：Ted Pella
荧光显微镜	Nikon	Ti-E	替代产品：Zeiss、Leica、Olympus
高倾角样品台	Jeol
旋转仪	Biosan	Multi Bio RS-24
在EFTEM模式下以200 kV运行、配备高倾角测角仪的透射电子显微镜	Jeol	JEM-2100	替代产品：FEI、Hitachi
镊子	Ted Pella	523
超薄切片机	Leica	UltraCut-E	替代产品：RMC
软件
图像采集	开源	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
图像处理	开源	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)