方法文章

测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物:评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型

DOI：

10.3791/62809

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2021年8月16日

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1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

本文内容

摘要

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从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，使研究人员能够以各种实验方式对线粒体进行功能和分析评估。这项研究展示了如何从冷冻的心脏组织制备富含线粒体的制剂，并对线粒体进行分析评估。

摘要

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线粒体电子转移复合物（ETC）谱在运动母猪所生后代的心脏组织中被修改。提出并测试的假设是，在怀孕期间母猪的定期母体运动将增加后代心脏生物能量的线粒体效率。通过使用轻度分离程序分离线粒体来评估线粒体ETC和超复合物谱，以测试该假设。这里描述的程序允许处理先前冷冻的存档心脏组织，并消除了新鲜线粒体制备评估线粒体ETC复合物，超复合物和ETC复合物活性谱的必要性。该协议描述了使用蓝天然凝胶电泳进行基于多重抗体的免疫印迹和超复杂评估中的最佳ETC蛋白复合物测量。

引言

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该协议的目标是提供详细的步骤，通过一种低能机械破坏组织的新技术从先前冷冻的心脏组织中获得富含线粒体的制剂，从而改善组织裂解和线粒体的提取。通过这种方法，可以在不产生高剪切应力或高温的情况下提高提取效率，并且均质时间短（10-12秒）可实现1。

从存档的冷冻组织中获得线粒体是进行功能2 和生化研究3的宝贵资产， 否则在确切的实验条件下不容易重复。经典的Potter-Elvehjem特氟龙杵玻璃均质机或Dounce均质机已被使用，并且仍在研究实验室中使用，以均质化肝脏，肾脏和大脑等软组织。然而，肌肉和心脏等硬组织均质化需要更多的均质时间，酶处理，高速均质和丰富的用户体验。这对于从肌肉和心脏等硬组织中提取完整的细胞器（如线粒体）是不利的。该方案中描述的方法用于获得高产量的富含线粒体的制剂，以分析线粒体电子传递链（ETC）蛋白质复合物及其在从运动和久坐不动的母猪出生的后代收获的心脏组织中的超复合物形成，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。该方法允许用户从先前冷冻的存档组织中分离出富含线粒体的制剂。

外界纳米材料暴露于妊娠期啮齿动物会对后代的心脏功能、线粒体呼吸和生物能量产生负面影响4。然而，有氧运动诱导的妊娠期胎儿肌细胞生物能....

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方案

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冷冻的后代心脏组织从Sean Newcomer博士那里收到了机构IACUC的批准函。心脏组织来自长期纵向研究，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。所有关于后代心脏组织处理的协议都遵循堪萨斯城大学IBC和IACUC委员会的指导方针。

1. 缓冲液和试剂的制备

注:按照制造商的指南准备所有样品。在所有配方和实验步骤中使用超纯水或等效水。在此过程中，请佩戴个人防护装备（实验室手套、口罩、手套和护目镜/面罩）。缓冲液体积适用于处理六个组织样品。

  1. 通过组合154.035g蔗糖（0.3 M最终），3.904gHEPES（10mM最终），0.111gEDTA（0.2mM最终）来制备1.5L组织洗涤缓冲液。在搅拌板上将配料加入1.0L水中，用稀释的HCl将pH值调节至7.2，并将化妆品至最终体积至1.5L。
    注意:每个样品大约需要200 mL洗涤缓冲液（50-300mg）。一天可以处理六个组织样本。使用剩余的洗涤缓冲液制成隔离缓冲液。
  2. 通过在210 mL洗涤缓冲液中加入210mg BSA，从先前在步骤1.1中描述的洗涤缓冲液中制备分离缓冲液。用稀释的NaOH溶液调节pH值至7.4。
    注意:每个组织样品需要约35 mL分离缓冲液;因此，6个样品需要210 mL分离缓冲液。通过在制备当天加入新鲜的BSA溶液（1mg / mL最终）来制备该缓冲液。BSA用于分离线粒体，因为它通....

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结果

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按照方案，从心脏组织制备了富含线粒体的蛋白质混合物的良好产量。从母猪后代收获的平均1.2g冷冻心脏组织中获得约15mg / mL富含线粒体的蛋白质混合物。观察表明，少于0.5g的冷冻心脏组织没有产生足够量的富含线粒体的蛋白质混合物以进行BN-PAGE测定。线粒体制剂的量足以进行（i）用于评估单个电子转移复合物（ETC）（即复合物-I，II，III，IV和复合物-V）的标准免疫印迹分析，（ii）通过BN-PAGE和免疫印迹分析进行线粒体超复合物评估，以及（iii）对所选复合物进行有限的酶测定。针对单个ETC蛋白复合物产生的抗体混合物提供了技术可行性，即每种抗体将在一次单一免疫印迹测定中识别其自身的靶蛋白。

富含线粒体的蛋白质是从心脏的左心室制备的，从母猪的后代中获得。后代出生于两组母猪:（1）一组在怀孕期间运动，（2）一组久坐不动。两组的心脏组织在出生后的不同时间点（48小时，3个月，6个月和9个月）收获。母亲运动是否对妊娠期后代的线粒体ETC有积极影响是本研究中测试的假设。由于漫长的线粒体富集分离过程，在任何一天都可以轻松处理四个心脏组织。

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讨论

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此处指明了此协议的关键步骤。首先，应仔细处理组织均质化，以便在组织均质过程中不会施加过多的纯粹效应。应使用组织粉碎机，这是用于初始组织均质的压力循环技术（PCT）的一部分9。该步骤将减少玻璃对玻璃均质机的过度中风周期（图1B），由于冷冻组织条件，可能会进一步破坏已经脆弱的线粒体。其次，冷冻组织重量对于获得足够量的富含线粒体的制剂非常重要。推荐的起始组织量将大于0.8g，具体取决于组织的来源。心脏组织中线粒体非常丰富10，11;因此，推荐量将足以获得富含线粒体的制剂。第三，所有程序都应在冷藏室中进行。如果没有冷藏室，大型冰浴就足够了。

本研究已经证明了从先前冷冻的心脏组织中获得富含线粒体的制剂的可行性。该协议对于提供对存档冷冻组织的访问至关重要，从中可以分离线粒体，并从中可以评估线粒体ETC酶复合物。最近的一项研究表明，以前冷冻的组织和细胞的线粒体呼吸也是可以测.......

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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这项工作得到了堪萨斯城大学对Abdulbaki Agbas的校内资助和Daniel Barrera的暑期研究奖学金的财政支持。作者感谢Jan Talley博士的编辑工作。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨基己酸Sigma/AldrichA2504-100G
抗 胡 总 OxPhos 复合物试剂盒Invitrogen458199
抗 VDAC 抗体abcamab15895使用 1 µg/mL
考马斯 G-250ThermoSientific20279
考马斯 GelCode BlueThermoScientific24592
洋地黄黄蜂Cabiochem300410
玻璃-玻璃杵均质器VWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-染料偶联抗兔抗体LICORLC0725
多孔板检测仪BioTekSynergy HT
非变性分子量标准品ThermoFisherBN2001
尼龙网单丝小部件 IncCMN-74
轨道摇床ThermoScientfic
PCT 碎纸机Pressure Bioscience Inc
SEABLOCK 封闭缓冲液ThermoScienctific37527
Shredder PULSE TubePressure Bioscience IncFT500-PS
台式离心机Eppendorf5418
胰蛋白酶AmrescoM150-1G
胰蛋白酶抑制剂AmrescoM191-1G需要新鲜的制备

参考文献

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  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al.

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