从先前冷冻保存的实体组织样本中制备线粒体富集样品，使研究者能够在多种实验条件下对线粒体进行功能性和分析性评估。本研究展示了如何从冷冻的心脏组织中制备线粒体富集样本，并对线粒体进行分析性评估。
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摘要
摘要
母猪妊娠期间规律运动可提高其子代心脏生物能量学的线粒体效率，该假说已被提出并验证。研究发现，运动母猪所产子代的心脏组织中线粒体电子传递链（ETC）复合物谱发生改变。为验证该假说，采用温和的线粒体分离方法分离线粒体，以评估线粒体ETC复合物及超复合物谱。本文所述方法可用于处理先前冷冻保存的心脏组织样本，从而无需新鲜制备线粒体即可完成对线粒体ETC复合物、超复合物及ETC复合物活性谱的分析。本方案详细描述了基于多重抗体免疫印迹法对ETC蛋白复合物进行最佳检测，以及利用蓝色天然凝胶电泳进行超复合物评估的技术流程。
引言
本实验方案的目的是提供详细的步骤，利用一种新型的低能量机械破碎技术，从先前冷冻的心脏组织中获得线粒体富集的制备物，该技术可改善组织裂解和线粒体提取效果。采用该方法，可在不产生高剪切力或高温的条件下，实现更高的提取效率，并将匀浆时间缩短至10–12秒1。
从存档的冷冻组织中获取线粒体是一种宝贵的资源，可用于开展功能性2和生物化学研究3，而这些研究在完全相同的实验条件下通常难以重复进行。经典的 Potter-Elvehjem 聚四氟乙烯研杵玻璃匀浆器或 Dounce 匀浆器已被广泛使用，并仍在科研实验室中用于匀浆肝脏、肾脏和脑等软组织。然而，对于肌肉和心脏等较硬组织的匀浆，则需要更长的匀浆时间、酶处理、高速匀浆以及丰富的操作经验。这使得从肌肉和心脏等硬组织中提取完整细胞器（如线粒体）变得不利。本方案所述的方法可用于获得高产量的线粒体富集样品，以分析从运动母猪和久坐母猪所产子代心脏组织中提取的线粒体电子传递链（ETC）蛋白复合物及其超复合物的形成情况。这些心脏组织经液氮速冻后于 -80 °C 保存，以备后续使用。该方法使研究者能够从先前冷冻保存的存档组织中分离出富含线粒体的组分。
妊娠期啮齿类动物暴露于外源性纳米材料可能对胎鼠在妊娠期间的心脏功能以及线粒体呼吸和生物能量学产生不利影响<....
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方案
来自肖恩·纽科默博士的冷冻子代心脏组织样本，连同机构的IACUC批准函一同接收。这些心脏组织样本取自一项长期纵向研究，经液氮速冻后，于-80 °C保存以备后续使用。所有涉及子代心脏组织处理的操作规程均遵循堪萨斯城大学IBC和IACUC委员会的指导原则。
1. 缓冲液与试剂的准备
注意：所有样本的制备均需遵循制造商的使用说明。在所有试剂配方和实验步骤中使用超纯水或同等纯度的水。操作过程中需佩戴个人防护装备（实验室外套、口罩、手套和护目镜/面罩）。缓冲液体积适用于处理六个组织样本。
- 通过将154.035 g蔗糖（终浓度0.3 M）、3.904 g HEPES（终浓度10 mM）和0.111 g EDTA（终浓度0.2 mM）加入1.0 L水中（置于搅拌器上搅拌），用稀盐酸调节pH至7.2，最后定容至1.5 L，配制1.5 L组织洗涤缓冲液。
注意：每个样品（50–300 mg）约需200 mL洗涤缓冲液。每天可处理六个组织样品。剩余的洗涤缓冲液可用于配制分离缓冲液。 - 取步骤1.1中已配制的洗涤缓冲液210 mL，加入210 mg牛血清白蛋白（BSA），配制分离缓冲液。用稀NaOH溶液调节pH至7.4。
注意：每个组织样品约需35 mL分离缓冲液，因此六个样品共需210 mL。应在当天加入新鲜的BSA溶液（终浓度1 mg/mL）进行配制。BSA用于线粒体分离，可通....
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结果
按照该方案，从心脏组织中成功制备出产量良好的线粒体富集蛋白混合物。平均每1.2 g来自母猪后代的心脏冷冻组织可获得约15 mg/mL的线粒体富集蛋白混合物。观察发现，少于0.5 g的冷冻心脏组织无法获得足量的线粒体富集蛋白混合物，因而不足以进行BN-PAGE检测。所获得的线粒体样品量足以用于以下实验：（i）通过标准免疫印迹分析评估各电子传递链复合物（ETC）（即复合物I、II、III、IV和复合物V）；（ii）通过BN-PAGE结合免疫印迹分析评估线粒体超复合物；（iii）对特定复合物进行有限的酶活性检测。针对各个ETC蛋白复合物制备的抗体混合物在技术上具有可行性，可在单次免疫印迹实验中确保每种抗体特异性识别其对应的目标蛋白。
从母猪后代的心脏左心室中制备线粒体富集蛋白。这些后代来自两组母猪：（1）一组在妊娠期间进行运动，（2）另一组保持久坐状态。在出生后的不同时间点（48小时、3个月、6个月和9个月）采集两组后代的心脏组织。本研究旨在验证母体运动是否在妊娠期间对后代线粒体电子传递链（ETC）产生积极影响。由于线粒体富集分离过程耗时较长，每天可顺利处理四份心脏组织样本。
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讨论
本方案的关键步骤如下。首先，组织匀浆过程需谨慎操作，避免在匀浆过程中施加过强的剪切力。应使用组织剪切器进行初步匀浆，该装置是压力循环技术（PCT）的一部分9。此步骤可减少玻璃-玻璃匀浆器（图1B）过度的往复运动，从而避免因组织处于冷冻状态而本就脆弱的线粒体受到进一步破坏。其次，冷冻组织的重量至关重要，以确保获得足量的线粒体富集样品。建议起始组织用量应大于0.8 g，具体用量取决于组织来源。心脏组织富含线粒体10,11，因此该推荐用量足以获得线粒体富集样品。第三，所有操作均应在低温环境（冷室）中进行。若无冷室，使用大容量冰浴亦可满足要求。
本研究证实了从先前冷冻的心脏组织中获取线粒体富集样品的可行性。该方案对于利用存档的冷冻组织进行线粒体分离及线粒体电子传递链（ETC）酶复合体评估至关重要。最近一项研究表明，先前冷冻的组织和细胞中的线粒体呼吸功能亦可被检测
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了堪萨斯城大学向Abdulbaki Agbas提供的校内资助以及向Daniel Barrera提供的暑期研究奖学金。作者感谢Jan Talley博士在编辑方面的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨基己酸 | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| 抗-Hu 总氧化磷酸化复合物试剂盒 | Invitrogen | 458199 | |
| 抗-VDAC 抗体 | abcam | ab15895 | 使用 1 µg/mL |
| 考马斯亮蓝 G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| 考马斯亮蓝 GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| 皂苷 | Cabiochem | 300410 | |
| 玻璃-玻璃研杵匀浆器 | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio 软件 | LICOR | ||
| IR-Dye 标记的抗兔抗体 | LICOR | LC0725 | |
| 多功能酶标仪 | BioTek | Synergy HT | |
| 天然状态分子量标准蛋白 | ThermoFisher | BN2001 | |
| 尼龙单丝筛网 | Small Part Inc | CMN-74 | |
| 旋转摇床 | ThermoScientfic | ||
| PCT 匀浆器 | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK 封闭缓冲液 | ThermoScienctific | 37527 | |
| 匀浆器 PULSE 管 | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5418 | |
| 胰蛋白酶 | Amresco | M150-1G | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Amresco | M191-1G | 需新鲜配制 |
参考文献
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
- Osto, C., et al.
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