小鼠烧伤损伤诱导的疼痛与抑郁样行为

摘要

单侧后肢足垫短暂烫伤（65 °C ± 0.5 °C，持续3秒）可降低同侧von Frey纤维刺激的痛觉阈值（g），并改变步态模式。此外，烧伤还会在强迫游泳实验中诱发类似抑郁的行为。

摘要

烫伤是老年人群和年轻人群烧伤损伤最常见的原因。由于在中低收入国家具有较高的死亡率和后遗症，烧伤是主要的临床挑战之一。烧伤常引起剧烈的自发性疼痛、持续性异常性疼痛以及危及生命的问题。更重要的是，过度疼痛常伴随抑郁症状，可能显著降低生活质量。本文介绍如何建立动物模型以研究烧伤引起的疼痛及类抑郁行为。在麻醉后，将小鼠的一只后肢足掌浸入热水（65 °C ± 0.5 °C）中持续 3 秒，以诱导烧伤损伤。烧伤后每 2 天进行一次 von Frey 试验和自动步态分析。此外，采用强迫游泳试验评估类抑郁行为，并通过转棒试验区分烧伤后是否存在运动功能异常。本研究的主要目的是描述一种用于研究小鼠烧伤损伤所致疼痛及类抑郁行为的动物模型的建立方法。

引言

组织损伤（如烧伤和创伤）通常伴随急性疼痛的发生。据估计，烧伤每年导致约18万人死亡，其中绝大多数发生在中低收入国家，且由不同类型的烧伤引起¹。根据一项全球性报告，烧伤在儿童中较为常见，占住院患者总数的约40%–60%^2,3。这类损伤尤其严重，因为它们可能在日常生活中发生，例如因沸水或洗澡水烫伤^4,5。尽管在大多数情况下，急性疼痛会随着组织损伤的恢复而自行缓解，但由于神经系统发生异常变化，仍有可能转变为慢性疼痛^6,7。

最近有研究表明，急性疼痛可诱发情绪低落，而慢性疼痛则可能导致焦虑和抑郁^8,9,10,11。疼痛与抑郁共存使得患者治疗更加困难。抑郁还往往增加疼痛敏感性，这可能进一步引发更严重的抑郁和疼痛

方案

所有实验方案均经韩国忠南国立大学机构动物护理和使用委员会审查批准，并依据国际疼痛研究协会的伦理指南进行¹⁸。

1. 在后肢足部诱导烫伤损伤

1. 将体重为20-25 g的雄性ICR小鼠饲养在光照和温度受控的房间内（12/12小时明暗循环，22.5 °C ± 2.5 °C），相对湿度为40%-60%。
   注：本实验方案可使用雄性或雌性小鼠。
2. 让动物自由摄取食物和水，并在实验开始前至少适应环境1周。
   注：所有动物均采用群养方式，以排除隔离应激等干扰因素。
3. 将小鼠随机分配至实验组或对照组，并使用动物编号作为代码进行盲法实验。
4. 在烧伤造模当天，通过腹腔（i.p.）注射300 µL阿法沙龙（剂量为100 mg/kg）对小鼠进行麻醉。进行烧伤造模操作时，需穿戴手术服、手套和口罩。
5. 在小鼠深度麻醉后，用70%乙醇对右后足进行消毒。
   注：通过夹捏后肢脚趾或尾部检查无反应，以确认小鼠处于深度麻醉状态。
6. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉后角膜干燥。
7. 将深度麻醉的小鼠右后足浸入65 °C ± 0.5 °C的热水中持续3秒。在将后足浸入热水前，先在每只小鼠的踝部做标记，以确保烧伤面积的一致性。
8. 完成烧伤造模后，将小鼠转移至清....

结果

为了遵循“3R原则”（替代、减少和优化），最大限度地减少动物痛苦并降低实验所需的动物数量，本研究通过预实验确定了获取显著数据所需的最少动物数量，并据此设计实验方案。本研究的行为学实验独立重复进行了两次，具体分组如下：步态分析、机械性异常性疼痛以及抑郁样行为测试分别设置了对照组（n = 5）、烧伤组（n = 7；溶剂对照；生理盐水）和烧伤+对乙酰氨基酚组（n = 7）。在转棒实验中，设置了对照组（n = 3）、烧伤组（n = 4；溶剂对照；生理盐水）、烧伤+对乙酰氨基酚组（n = 4）以及阳性对照组（n = 4；Alfaxalone）。Alfaxalone 是一种神经活性类固醇类麻醉剂，目前在兽医学中用作注射型全身麻醉诱导剂。本研究中，Alfaxalone 用于烧伤造模过程中的动物麻醉，并在转棒实验中作为运动功能障碍的阳性对照药物。

数据以均值 ± 标准误（S.E.M.）表示。此外，不同时点获得的实验数据被独立分析。疼痛行为反应计算为曲线下面积（AUC）。采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）评估机械性异常疼痛、步态分析和转棒实验数据随时间变化的差异。事后分析采用 Dunnett .......

讨论

烫伤是一种由高温液体引起的热力烧伤。大多数情况下为一度或二度烧伤，但长时间接触热源可导致三度烧伤²⁶。在本研究中，通过将小鼠右后足置于65 °C热水中3秒以诱导烧伤损伤^4,26。在烧伤的足部可观察到组织损伤，表现为红肿、皮肤脱皮和肿胀等典型的烧伤症状（补充图1）⁴。

机械性异常性疼痛测量是动物疼痛模型中常用的一种疼痛反应识别方法，本研究采用von-Frey细丝进行测量。使用von Frey细丝的上升刺激法可确定引起动物足爪回缩反应所需的机械阈值^19,20。实验从刺激强度最小的细丝开始，记录细丝在设定次数（本方案中为三次）引起反应时的弯曲力，作为足爪回缩阈值。

在自由行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	BD	307809
1.5 mL 离心管	Axygen	MCT-150-C
50 mL 离心管	SPL	50050
对乙酰氨基酚 BioXtra，≥99.0%	Sigma-Aldrich	A7085-100G	该镇痛剂用作阳性对照。
Alfaxan 多剂量（Alfaxalone）	JUROX Pty.Limited		本实验中，该材料用于动物麻醉，并在转棒实验中作为实验处理药物的阳性对照。
CatWalk 自动步态分析系统	Noldus	CatWalk XT	自由行走啮齿类动物的步态分析用于研究感觉运动功能障碍模型中肢体运动和位置的变化
OPTISHIELD（环孢素眼膏）	Ashish Life Science		该材料用作眼膏，以防止麻醉诱导后角膜干燥。
有机玻璃圆筒	SCITECH KOREA	定制产品	用于强迫游泳实验
转棒系统	SCITECH KOREA	加速转棒	用于正常运动功能的测定
von Frey 纤维丝	North Coast Medical	NC12775	用于机械性异常性疼痛的测定
水浴锅	CHANGSHIN SCIENCE	C-WBE	用于烧伤损伤的诱导