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适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

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DOI：

10.3791/62832

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2021年7月29日

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

本文内容

摘要

单颗粒冷冻电子显微镜技术需要合适的软件包和用户友好的流程，以实现高通量的自动数据采集。本文介绍了完全自动化的图像采集软件包Latitude-S及其在低剂量条件下收集玻璃态生物大分子数据的实际操作流程。

摘要

近年来，单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）在技术和方法学上的进步为生物大分子的高分辨率结构解析开辟了新的途径。尽管冷冻电镜技术取得了显著进展，单颗粒分析流程的各个方面仍有改进空间。单颗粒分析需要一个合适的软件包来实现高通量的自动数据采集。在过去八年中，已开发出多种用于单颗粒冷冻电镜自动成像的自动数据采集软件。本文介绍了一种在低剂量条件下对玻璃态生物分子进行全自动图像采集流程的应用。

该软件包能够全自动且精确地采集冷冻电镜数据。此外，该软件包可轻松控制多种显微镜参数。本实验方案展示了该软件包在配备直接电子探测器（DED）的200 keV冷冻透射电子显微镜上，对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白进行自动化成像的应用潜力。在一次连续48小时的数据采集过程中，共获得了约3,000张冷冻电镜电影图像，最终解析出SARS-CoV-2刺突蛋白的原子分辨率结构。进一步的结构分析表明，该刺突蛋白主要存在两种构象：一种是单个受体结合域（1-RBD）朝上的开放构象，另一种是所有受体结合域（RBD）朝下的闭合构象。

引言

单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）已成为解析生物大分子高分辨率结构的主流结构生物学技术1。单颗粒重构依赖于获取大量玻璃态样品的显微图像，从中提取二维（2D）颗粒图像，并进一步用于重构生物大分子的三维（3D）结构2,3。在直接电子探测器（DED）出现之前，单颗粒重构所达到的分辨率通常在4至30 Å之间4,5。近年来，单颗粒冷冻电镜的分辨率已突破1.8 Å6。直接电子探测器（DED）和自动化数据采集软件是推动这一分辨率革命的主要因素7，使得数据采集过程中的人工干预降至最低。通常，冷冻电镜成像采用较低的电子剂量率（20–100 e/Å2），以尽量减少电子束对生物样品的辐射损伤，但这也会导致图像信噪比（SNR）较低。这种低信噪比限制了利用单颗粒分析方法解析生物大分子高分辨率结构的能力。

新一代电子探测器是基于CMOS（互补金属氧化物半导体）的探测器，能够克服这些与低信噪比相关的障碍。这类直接探测CMOS相机由于具备快速信号读出能力，因而具有更优的点扩散函数、适宜的信噪比以及优异的探测量子效率....

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方案

注意：冷冻电镜数据采集需要三个重要步骤：1. 冷冻电镜载网制备，2. 显微镜的校准与对中，3. 自动化数据采集（图1）。此外，自动化数据采集又可分为以下子步骤：a. 选择合适区域，b. 优化Latitude-S参数，c. 启动自动孔区选择，d. 启动自动数据采集（图1）。

1. 自动数据采集的冷冻电镜载网制备与样品加载

  1. 使用电晕放电器清洁载网，并根据实验需求调整电晕放电参数（此处为 20 mA 下放电 60 秒）。
  2. 将新鲜制备的蛋白质样品（3 µL）加入经电晕放电处理的载网上，孵育 10 秒。
  3. 在 100% 湿度条件下 blot 3–5 秒，然后使用冷冻载网投入装置迅速将载网浸入液态乙烷中。
  4. 通过弹性 C 型夹环手动将载网夹紧到夹环上，形成弹匣结构。
  5. 将冷冻固定的载网装入自动进样器样品盒中，并通过纳米帽将样品盒转移至预冷的显微镜自动进样器中，以进行数据采集。

2. 自动数据采集前的显微镜调谐与基本校准

  1. 电子束偏移
    1. 在直接校准选项卡中点击电子束偏移。
    2. 降....

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结果

在当前的疫情形势下，冷冻电镜技术在解析SARS-CoV-2多种蛋白质结构方面发挥着关键作用26,27,28,29，这有助于开发针对该病毒的疫苗和药物。面对2019冠状病毒病，亟需在有限的人力资源条件下加快科研进程。单颗粒冷冻电镜中的数据采集是大分子结构解析中耗时但至关重要的步骤。近年来，冷冻电镜自动数据采集技术的发展已实现数据收集过程中的人为干预最小化。Latitude-S软件是一种重要的自动数据采集软件包，本研究中用于纯化的SARS-CoV-2刺突蛋白的自动化数据采集。

使用配备K2 Summit DED的200 keV冷冻电镜对SARS-CoV-2刺突蛋白进行冷冻电镜数据采集。在网格上具有理想冰层厚度和颗粒分布的区域由人工手动标记。这些位置的标记与后台进行的数据采集同步完成。在已标记的位置，Latitude-S软件以42,2.......

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讨论

Latitude-S 是一种直观的用户界面，可在两天内自动设置并采集数千张高分辨率显微图像或视频文件。它提供在载网上的便捷导航功能，并在从低倍率切换到高倍率时保持显微镜载物台的位置不变。使用 Latitude-S 进行数据采集的每一步都具有高时间效率，具备诸如简洁的用户界面、高达 4.5 GB/s 的快速数据流传输，以及在采集过程中同步显示数据等功能。此外，预先校准的剂量分率、剂量率、聚焦和放大倍率参数可轻松重新加载，从而快速启动新一轮的自动数据采集，节省时间。

在缺乏持续监控且不降低数据集质量的情况下自动获取数据，是一项具有挑战性且耗时的任务。当时间和资源受到重大限制时，尤其是疫情期间，使用 Latitude-S 软件进行自动化数据采集非常便捷。然而，在过去几个月中，已有多种 SARS-CoV-2 蛋白的冷冻电镜结构被解析，这将有助于制药公司开发疫苗。不同的实验室使用不同类型的自动数据采集软件包来收集数据。我们在有孔碳膜载网或自制的氧化石墨烯（GO）包被载网上，采用 K2 Summit DED 搭配 Latitude-S 进行冷冻电镜的自动数据采集

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披露

作者声明无任何竞争性或经济利益冲突。

致谢

我们感谢印度生物技术部、科学技术部（DST）以及人力资源发展部（MHRD）的资助，以及印度科学理工学院（IISc）班加罗尔校区的冷冻电镜设施。我们感谢DBT-BUILDER项目（BT/INF/22/SP22844/2017）和DST-FIST（SR/FST/LSII-039/2015）对IISc班加罗尔国家冷冻电镜设施的支持。我们感谢科学与工程研究委员会（SERB）提供的经费支持（项目编号：SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608 和 SERB-IPA/2020/000094）以及DBT（项目编号：BT/PR25580/BRB/10/1619/2017）。我们感谢Ishika Pramanick女士在制备冷冻电镜载网、冷冻电镜数据采集以及准备材料表方面所做的工作。我们还感谢Suman Mishra先生在冷冻电镜图像处理以及协助我们制备图示方面提供的帮助。我们感谢Raghavan Varadarajan教授协助我们获得本研究所用的纯化刺突蛋白样品。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸水纸Ted Pella, INC.47000-100电镜样品制备用品
样品胶囊Thermo Fisher Scientific9432 909 97591电镜样品制备单元
样品盒Thermo Fisher Scientific1020863电镜样品制备单元
C型夹Thermo Fisher Scientific1036171电镜样品制备用品
C型夹插入工具Thermo Fisher Scientific9432 909 97571电镜样品制备工具
C型夹环Thermo Fisher Scientific1036173电镜样品制备用品
电镜载网（Quantifoil）Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300目，金
辉光放电仪QuorumN/AQuorum GlowQube 辉光放电仪
K2 DEDGatan Inc.N/A冷冻电镜数据采集设备（相机）
Latitude S 软件Gatan Inc.成像软件
上样站Thermo Fisher Scientific1130698电镜样品制备单元
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/A冷冻电子显微镜
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/A电镜样品制备单元

参考文献

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from ....

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