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用于评估缺血性心脏病基因治疗疗效的大动物模型

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DOI：

10.3791/62833

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2021年9月2日

 ,  , 
1A.I. Virtanen Institute, University of Eastern Finland

本文内容

摘要

心肌基因治疗在缺血性心脏病的未来治疗中具有广阔前景。本文介绍了一种用于评估基因治疗在缺血性心脏中疗效的大动物模型。

摘要

冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的重要原因之一。尽管现有治疗方法不断进步，仍有相当比例的冠状动脉疾病患者持续存在症状。基因治疗介导的治疗性血管生成为改善心肌灌注和缓解症状提供了一种新的治疗策略。已有少数临床试验研究了使用不同促血管生成因子的基因治疗。由于该方法较新，心肌基因治疗的发展仍处于从实验室到临床的持续探索过程。因此，需要大型动物模型来评估其安全性和有效性。大型动物模型若能更准确地模拟临床疾病特征和终点指标，则临床试验的结果将更具可预测性。本文介绍了一种用于评估缺血性猪心模型中基因治疗效果的大型动物模型。我们采用与临床相关的成像方法，如超声成像和15H2O-PET。为将基因转导靶向至目标区域，使用了电生理解剖标测技术。该方法的目的包括：（1）模拟慢性冠状动脉疾病；（2）在心脏缺氧区域诱导治疗性血管生成；（3）利用相关终点指标评估基因治疗的安全性和有效性。

引言

冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因1。目前的治疗策略包括经皮介入治疗、药物治疗和旁路手术2。然而，尽管现有治疗方法不断进步，许多患者仍遭受所谓难治性心绞痛的困扰，凸显了对新型治疗手段的迫切需求3。基因治疗介导的治疗性血管生成可能针对这一患者群体。

心肌基因治疗最常通过使用不同的病毒载体进行递送，其中最常用的是复制缺陷型腺病毒4。作为治疗性基因，目前使用了多种促血管生成生长因子。其中研究最为深入的是血管内皮生长因子（VEGFs），它们通过血管内皮生长因子受体（VEGFRs）及其共受体介导促血管生成信号传导5。多项临床试验已证实心脏基因治疗的有效性和安全性，使这种新型治疗方法成为治疗缺血性心脏病的现实选择6,7。然而，在进入临床应用之前，该策略仍需在大型动物模型中进一步优化所使用的治疗基因和病毒载体。猪因其心脏与人类心脏高度相似而被广泛用作实验动物。猪的心血管系统大小允许使用与人类相同的导管装置。所有适用于人类的影像学检查方法均可用于猪8。

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方案

本研究所涉及的实验使用约10周龄的雌性家猪进行，并已获得芬兰动物实验委员会的批准。实验开始时动物体重为30–40 kg，可使用与人类相似的操作设备和成像方式。在基因转移前14天诱导慢性缺血，基因转移后的随访时间取决于所使用的病毒载体。研究方案见图1。该方案可用于实施腺病毒或腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗注射。样本采集时间需根据外源基因表达的峰值进行调整，该峰值取决于所使用的病毒载体。例如，在进行腺病毒基因转移时，样本采集时间设定为基因转移后第6天。

1. 药物

  1. 为预防致死性室性心律失常，每日给予200 mg胺碘酮和2.5 mg比索洛尔。药物治疗从缺血手术前1周开始，持续每日给药直至随访结束。
  2. 此外，在缺血手术前1天，给予动物口服氯吡格雷（300 mg）和乙酰水杨酸（300 mg），以预防支架植入后急性支架内血栓形成。
  3. 在缺血手术开始时，静脉注射100 mg利多卡因和2.5 mL（246 mg/mL）MgSO4，以预防室性心律失常。
  4. 每次手术开始时，肌肉注射头孢呋辛（500 mg），用于预防感染。
  5. 在缺血手术开始时静脉注射依诺肝素30 mg，并在手术后皮下注射，用于预防血栓形成。
  6. 麻醉与镇痛方案：给予阿托品1.5 mL、阿扎哌隆（40 mg/mL）6 mL、丙泊酚（20 ....

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结果

在进行基因递送之前，可通过冠状动脉造影和经胸超声心动图确定运动减弱区域（图1）来验证缺血手术是否成功。冠状动脉阻塞的状态可通过冠状动脉造影进行评估，而电生理解剖标测可确认缺血区域和冬眠心肌区域。

可通过测量周向应变、射血分数以及采用15H2O-PET评估心肌灌注来分析基因治疗的疗效（图3）。通过将心脏与电生理解剖图谱进行比对，可直接从基因转导区域采集组织样本。通过免疫组织化学分析，可在β-半乳糖苷酶染色后分析阳性细胞数量，并在CD31染色后分析心肌毛细血管面积，从而评估转基因表达和治疗性血管生成（图4）。此外，可通过诊断性影像学（通过超声心动图评估心包积液）、免疫组织化学以及分布分析来评估基因治疗的安全性。

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讨论

本方案的时间点可根据所使用的病毒载体进行调整。此外，免疫组织学分析可根据治疗基因的选择而定。如有需要，也可在本方案中增加更多时间点和终点指标。

本方案包含若干关键步骤，这些步骤对于实验成功至关重要，且一旦出错将无法在后续进行补救。首先，若未能成功诱导适当的缺血状态，则该动物必须从后续操作和分析中剔除。方法和影像学操作的标准化至关重要，以确保不同时间点及不同动物之间的结果具有可比性。其次，必须从确切的基因转导区域采集样本，并成功完成后续处理，以便进行进一步分析。此外，本方案要求操作者熟练掌握血管造影技术及多种影像学方法。例如，对跳动的心脏进行冠状动脉造影和病毒注射需要经过大量训练，正确实施经胸超声心动图也同样重要。然而，这些影像学方法能够评估心肌功能与灌注情况，为后续研究提供关键信息。

由于猪的心血管系统在解剖学和生理学上与人类相似，因此常被用于模拟心血管疾病的机制和相关操作。然而，由于动物生长迅速，其随访时间通常限制在约6个月以内。超过6个月后，动物的管理将变得困难，且成像质量会下降。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Maria Hedman、Tiina Laitinen、Tomi Laitinen、Pekka Poutiainen、Annika Viren 和 Severi Sormunen 在库奥皮奥大学医院提供 15O-PET 成像技术支持和协助；同时感谢国家实验动物中心的 Heikki Karhunen、Minna Törrönen 和 Riikka Venäläinen 在动物实验方面提供的帮助。

本研究由芬兰科学院、欧洲研究理事会（ERC）以及心血管再生医学欧盟“地平线2020”计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% PFAVWRVWRC28794.295由多聚甲醛粉末配制而成
15% 蔗糖VWRVWRC27480.294由固体蔗糖配制而成
4% PFAVWRVWRC28794.295由多聚甲醛粉末配制而成
5 F 猪尾导管Cordis534-550S
6 F AR2 导管Cordis670-112-00
6 F 导引鞘Cordis504-606X
8 F 导引鞘Cordis504-608X
乙酰水杨酸不同生产商
胺碘酮不同生产商
血管造影系统GE Healthcare
血管实验室套装Mölnlycke专为本血管实验室需求设计，包含无菌铺巾、容器和棉签
比索洛尔不同生产商
头孢呋辛不同生产商
氯吡格雷不同生产商
Coroflex Blue 支架B.Braun Medical5029012货号取决于支架尺寸
Crile 止血钳
回旋加速器GE Healthcare
多巴酚丁胺不同生产商
电生理标测系统Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson 公司
依诺肝素不同生产商
芬太尼不同生产商
心肌内注射导管Johnson & Johnson
碘对比剂Iomeron
厨房刀不同生产商
利多卡因不同生产商
液氮不同生产商
MgSO4不同生产商
18 G 针头Cordis12-004943
灌注泵
PET-CT 扫描仪Siemens Healthcare
聚四氟乙烯管
丙泊酚不同生产商
11 号手术刀片VWRSWAN0503
舌下含服硝酸甘油Takeda
超声设备Philips

参考文献

  1. Naghavi, M., et al. Global, regional, and national age-sex specifc mortality for 264 causes of death, 1980-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
  2. Knuuti, J., et al.

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15O PET

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