用于评估缺血性心脏病基因治疗疗效的大动物模型

摘要

心肌基因治疗在缺血性心脏病的未来治疗中具有广阔前景。本文介绍了一种用于评估基因治疗在缺血性心脏中疗效的大动物模型。

摘要

冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的重要原因之一。尽管现有治疗方法不断进步，仍有相当比例的冠状动脉疾病患者持续存在症状。基因治疗介导的治疗性血管生成为改善心肌灌注和缓解症状提供了一种新的治疗策略。已有少数临床试验研究了使用不同促血管生成因子的基因治疗。由于该方法较新，心肌基因治疗的发展仍处于从实验室到临床的持续探索过程。因此，需要大型动物模型来评估其安全性和有效性。大型动物模型若能更准确地模拟临床疾病特征和终点指标，则临床试验的结果将更具可预测性。本文介绍了一种用于评估缺血性猪心模型中基因治疗效果的大型动物模型。我们采用与临床相关的成像方法，如超声成像和¹⁵H₂O-PET。为将基因转导靶向至目标区域，使用了电生理解剖标测技术。该方法的目的包括：（1）模拟慢性冠状动脉疾病；（2）在心脏缺氧区域诱导治疗性血管生成；（3）利用相关终点指标评估基因治疗的安全性和有效性。

引言

冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因¹。目前的治疗策略包括经皮介入治疗、药物治疗和旁路手术²。然而，尽管现有治疗方法不断进步，许多患者仍遭受所谓难治性心绞痛的困扰，凸显了对新型治疗手段的迫切需求³。基因治疗介导的治疗性血管生成可能针对这一患者群体。

心肌基因治疗最常通过使用不同的病毒载体进行递送，其中最常用的是复制缺陷型腺病毒⁴。作为治疗性基因，目前使用了多种促血管生成生长因子。其中研究最为深入的是血管内皮生长因子（VEGFs），它们通过血管内皮生长因子受体（VEGFRs）及其共受体介导促血管生成信号传导⁵。多项临床试验已证实心脏基因治疗的有效性和安全性，使这种新型治疗方法成为治疗缺血性心脏病的现实选择^6,7。然而，在进入临床应用之前，该策略仍需在大型动物模型中进一步优化所使用的治疗基因和病毒载体。猪因其心脏与人类心脏高度相似而被广泛用作实验动物。猪的心血管系统大小允许使用与人类相同的导管装置。所有适用于人类的影像学检查方法均可用于猪⁸。

方案

本研究所涉及的实验使用约10周龄的雌性家猪进行，并已获得芬兰动物实验委员会的批准。实验开始时动物体重为30–40 kg，可使用与人类相似的操作设备和成像方式。在基因转移前14天诱导慢性缺血，基因转移后的随访时间取决于所使用的病毒载体。研究方案见图1。该方案可用于实施腺病毒或腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗注射。样本采集时间需根据外源基因表达的峰值进行调整，该峰值取决于所使用的病毒载体。例如，在进行腺病毒基因转移时，样本采集时间设定为基因转移后第6天。

1. 药物

1. 为预防致死性室性心律失常，每日给予200 mg胺碘酮和2.5 mg比索洛尔。药物治疗从缺血手术前1周开始，持续每日给药直至随访结束。
2. 此外，在缺血手术前1天，给予动物口服氯吡格雷（300 mg）和乙酰水杨酸（300 mg），以预防支架植入后急性支架内血栓形成。
3. 在缺血手术开始时，静脉注射100 mg利多卡因和2.5 mL（246 mg/mL）MgSO₄，以预防室性心律失常。
4. 每次手术开始时，肌肉注射头孢呋辛（500 mg），用于预防感染。
5. 在缺血手术开始时静脉注射依诺肝素30 mg，并在手术后皮下注射，用于预防血栓形成。
6. 麻醉与镇痛方案：给予阿托品1.5 mL、阿扎哌隆（40 mg/mL）6 mL、丙泊酚（20 ....

结果

在进行基因递送之前，可通过冠状动脉造影和经胸超声心动图确定运动减弱区域（图1）来验证缺血手术是否成功。冠状动脉阻塞的状态可通过冠状动脉造影进行评估，而电生理解剖标测可确认缺血区域和冬眠心肌区域。

可通过测量周向应变、射血分数以及采用¹⁵H₂O-PET评估心肌灌注来分析基因治疗的疗效（图3）。通过将心脏与电生理解剖图谱进行比对，可直接从基因转导区域采集组织样本。通过免疫组织化学分析，可在β-半乳糖苷酶染色后分析阳性细胞数量，并在CD31染色后分析心肌毛细血管面积，从而评估转基因表达和治疗性血管生成（图4）。此外，可通过诊断性影像学（通过超声心动图评估心包积液）、免疫组织化学以及分布分析来评估基因治疗的安全性。

讨论

本方案的时间点可根据所使用的病毒载体进行调整。此外，免疫组织学分析可根据治疗基因的选择而定。如有需要，也可在本方案中增加更多时间点和终点指标。

本方案包含若干关键步骤，这些步骤对于实验成功至关重要，且一旦出错将无法在后续进行补救。首先，若未能成功诱导适当的缺血状态，则该动物必须从后续操作和分析中剔除。方法和影像学操作的标准化至关重要，以确保不同时间点及不同动物之间的结果具有可比性。其次，必须从确切的基因转导区域采集样本，并成功完成后续处理，以便进行进一步分析。此外，本方案要求操作者熟练掌握血管造影技术及多种影像学方法。例如，对跳动的心脏进行冠状动脉造影和病毒注射需要经过大量训练，正确实施经胸超声心动图也同样重要。然而，这些影像学方法能够评估心肌功能与灌注情况，为后续研究提供关键信息。

由于猪的心血管系统在解剖学和生理学上与人类相似，因此常被用于模拟心血管疾病的机制和相关操作。然而，由于动物生长迅速，其随访时间通常限制在约6个月以内。超过6个月后，动物的管理将变得困难，且成像质量会下降。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	由多聚甲醛粉末配制而成
15% 蔗糖	VWR	VWRC27480.294	由固体蔗糖配制而成
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	由多聚甲醛粉末配制而成
5 F 猪尾导管	Cordis	534-550S
6 F AR2 导管	Cordis	670-112-00
6 F 导引鞘	Cordis	504-606X
8 F 导引鞘	Cordis	504-608X
乙酰水杨酸			不同生产商
胺碘酮			不同生产商
血管造影系统	GE Healthcare
血管实验室套装	Mölnlycke		专为本血管实验室需求设计，包含无菌铺巾、容器和棉签
比索洛尔			不同生产商
头孢呋辛			不同生产商
氯吡格雷			不同生产商
Coroflex Blue 支架	B.Braun Medical	5029012	货号取决于支架尺寸
Crile 止血钳
回旋加速器	GE Healthcare
多巴酚丁胺			不同生产商
电生理标测系统	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson 公司
依诺肝素			不同生产商
芬太尼			不同生产商
心肌内注射导管	Johnson & Johnson
碘对比剂	Iomeron
厨房刀			不同生产商
利多卡因			不同生产商
液氮			不同生产商
MgSO4			不同生产商
18 G 针头	Cordis	12-004943
灌注泵
PET-CT 扫描仪	Siemens Healthcare
聚四氟乙烯管
丙泊酚			不同生产商
11 号手术刀片	VWR	SWAN0503
舌下含服硝酸甘油	Takeda
超声设备	Philips