心肌基因治疗在缺血性心脏病的未来治疗中具有广阔前景。本文介绍了一种用于评估基因治疗在缺血性心脏中疗效的大动物模型。
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摘要
摘要
冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的重要原因之一。尽管现有治疗方法不断进步，仍有相当比例的冠状动脉疾病患者持续存在症状。基因治疗介导的治疗性血管生成为改善心肌灌注和缓解症状提供了一种新的治疗策略。已有少数临床试验研究了使用不同促血管生成因子的基因治疗。由于该方法较新，心肌基因治疗的发展仍处于从实验室到临床的持续探索过程。因此，需要大型动物模型来评估其安全性和有效性。大型动物模型若能更准确地模拟临床疾病特征和终点指标，则临床试验的结果将更具可预测性。本文介绍了一种用于评估缺血性猪心模型中基因治疗效果的大型动物模型。我们采用与临床相关的成像方法，如超声成像和15H2O-PET。为将基因转导靶向至目标区域，使用了电生理解剖标测技术。该方法的目的包括：（1）模拟慢性冠状动脉疾病；（2）在心脏缺氧区域诱导治疗性血管生成；（3）利用相关终点指标评估基因治疗的安全性和有效性。
引言
冠状动脉疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因1。目前的治疗策略包括经皮介入治疗、药物治疗和旁路手术2。然而，尽管现有治疗方法不断进步，许多患者仍遭受所谓难治性心绞痛的困扰，凸显了对新型治疗手段的迫切需求3。基因治疗介导的治疗性血管生成可能针对这一患者群体。
心肌基因治疗最常通过使用不同的病毒载体进行递送，其中最常用的是复制缺陷型腺病毒4。作为治疗性基因，目前使用了多种促血管生成生长因子。其中研究最为深入的是血管内皮生长因子（VEGFs），它们通过血管内皮生长因子受体（VEGFRs）及其共受体介导促血管生成信号传导5。多项临床试验已证实心脏基因治疗的有效性和安全性，使这种新型治疗方法成为治疗缺血性心脏病的现实选择6,7。然而，在进入临床应用之前，该策略仍需在大型动物模型中进一步优化所使用的治疗基因和病毒载体。猪因其心脏与人类心脏高度相似而被广泛用作实验动物。猪的心血管系统大小允许使用与人类相同的导管装置。所有适用于人类的影像学检查方法均可用于猪8。
目前存在多种用于慢性缺血研究的大动物模型，其中最常用的是缩窄性内膜环模型9,10,11。该方法的缺点在于其侵入性较强，因为需要通过开胸手术才能接触到冠状血管。此前，我们课题组已建立了一种用于慢性心肌缺血的微创瓶颈支架模型12。本研究亦采用该方法来诱导心肌缺血。
尽管超声成像技术已有一定历史，但其应用性已得到显著发展。例如，心肌应变目前仍主要处于研究应用阶段，因其相对较新。心肌应变能够比传统M型超声心动图的射血分数测量更准确地反映心脏收缩功能的变化13。因此，在本大型动物模型中采用了心肌应变测量方法。为评估心脏功能，还通过血管造影期间对左心室的电影成像来测量心输出量。心输出量分别在静息状态和多巴酚丁胺诱导的应激状态下进行测量，以评估心肌在应激状态下的功能表现。
除了心脏功能的测量外，在以治疗性血管生成为目标的基因治疗研究中，心肌灌注信息也至关重要。在此动物模型中，采用15O标记的放射性水正电子发射断层扫描（15H2O-PET）对动物进行成像，因为这是测量心肌灌注的金标准。15H2O-PET 既往已验证可用于测量缺血性猪心的心肌灌注14。
因此，上述方法和模式为评估缺血性心脏基因治疗的疗效提供了良好的视角。
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方案
本研究所涉及的实验使用约10周龄的雌性家猪进行，并已获得芬兰动物实验委员会的批准。实验开始时动物体重为30–40 kg，可使用与人类相似的操作设备和成像方式。在基因转移前14天诱导慢性缺血，基因转移后的随访时间取决于所使用的病毒载体。研究方案见图1。该方案可用于实施腺病毒或腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗注射。样本采集时间需根据外源基因表达的峰值进行调整，该峰值取决于所使用的病毒载体。例如，在进行腺病毒基因转移时，样本采集时间设定为基因转移后第6天。
1. 药物
- 为预防致死性室性心律失常，每日给予200 mg胺碘酮和2.5 mg比索洛尔。药物治疗从缺血手术前1周开始，持续每日给药直至随访结束。
- 此外，在缺血手术前1天，给予动物口服氯吡格雷（300 mg）和乙酰水杨酸（300 mg），以预防支架植入后急性支架内血栓形成。
- 在缺血手术开始时，静脉注射100 mg利多卡因和2.5 mL（246 mg/mL）MgSO4，以预防室性心律失常。
- 每次手术开始时，肌肉注射头孢呋辛（500 mg），用于预防感染。
- 在缺血手术开始时静脉注射依诺肝素30 mg，并在手术后皮下注射，用于预防血栓形成。
- 麻醉与镇痛方案：给予阿托品1.5 mL、阿扎哌隆（40 mg/mL）6 mL、丙泊酚（20 mg/mL）以15 mg/kg/h的速度输注，以及芬太尼（50 µg/mL）以10 µg/kg/h的速度输注。每头猪的药物剂量相同。具体给药剂量请参照当地的动物使用指南。
- 所有手术过程中均应对动物实施麻醉。所有操作均应在无菌环境中采用无菌技术进行。
2. 经胸超声心动图
- 在缺血手术、基因转导和安乐死前进行经胸超声心动图检查，以评估是否存在可检测到的心包积液并测定心肌应变。
- 将探头置于猪腋下第三或第四肋间，获取二尖瓣水平、乳头肌水平及心尖水平的胸骨旁短轴切面图像（视频 1）。探头标记应指向猪的胸骨。如需保存图像片段，请按采集按钮。
3. 在荧光透视引导下的血管内操作
- 在缺血手术、基因转导和组织采集之前，先进行左心室电影成像，随后进行冠状动脉造影。
- 手术准备
- 通过肌肉注射1.5 mL阿托品和6 mL阿扎哌隆对猪进行镇静，以准备手术。
- 镇静后，采用丙泊酚（15 mg/kg/h）和芬太尼（10 µg/kg/h）进行全身麻醉，用于猪的血管造影操作。
注意：在整个操作过程中，猪均保持麻醉状态。 - 通过气管插管连接呼吸机支持通气，并监测心电图（ECG）和呼吸参数等重要生理指标。
- 导入鞘管置入
- 按照心脏病学常规操作，将导入鞘管置入右侧股动脉，用于所有手术操作。使用超声定位股动脉，并用穿刺针（18 G）穿刺动脉。
注意：心肌内基因转导使用8F导入鞘管，其他所有操作使用6F鞘管。将鞘管导丝经穿刺针送入动脉，引导鞘管进入，随后撤出穿刺针，保持导丝位置固定。 - 沿导丝插入导入鞘管，到位后撤出导丝，并向猪舌下给予1.25 mg硝酸异山梨酯，以诱导冠状动脉扩张。
- 按照心脏病学常规操作，将导入鞘管置入右侧股动脉，用于所有手术操作。使用超声定位股动脉，并用穿刺针（18 G）穿刺动脉。
- 冠状动脉造影
- 在缺血手术、基因转导和组织采集前直接进行冠状动脉造影。造影所需设备如图2所示。
- 在X线透视引导下，使用6F导管和碘对比剂对右冠状动脉和左前降支冠状动脉进行成像（视频2）。
- 静息及多巴酚丁胺负荷状态下的左心室电影成像
- 通过5F猪尾导管，使用自动注射器将21 mL碘对比剂团注至左心室。首先将团注时间设为3秒，总体积设为21 mL，然后点击 Single 和 Yes。
- 使用血管造影工作站的测量软件计算射血分数。进行计算时，选择相应图像的 Ventricular Analysis 功能。滚动图像，选择一个舒张末期和一个收缩末期的时间帧，并使用工具分别勾画两个时间点的心室轮廓。
注意：软件将采用Simpson法自动计算射血分数和每搏输出量。射血分数的测量在静息状态和多巴酚丁胺诱导的应激状态下分别进行。
- 应激成像
- 静脉输注多巴酚丁胺，剂量从10 µg/kg/min逐步增加至20 µg/kg/min，用于诱导应激成像，直至达到目标心率160 bpm，随后进行电影成像。
- 缺血手术
- 在基因转导前14天，将一个缩窄型支架置入左前降支冠状动脉（LAD），以诱导慢性心肌缺血。支架置入后，通过造影检查确认其位置是否正确，是否有效限制冠状动脉血流。
注意：该缩窄型支架安装在扩张导管上，由金属裸支架外覆一段呈瓶颈状的聚四氟乙烯管构成，用于减少冠状动脉血流9。
- 在基因转导前14天，将一个缩窄型支架置入左前降支冠状动脉（LAD），以诱导慢性心肌缺血。支架置入后，通过造影检查确认其位置是否正确，是否有效限制冠状动脉血流。
- 确定支架尺寸
- 根据血管造影图像中左前降支冠状动脉的大小，使用血管造影工作站的自动测量软件选择支架尺寸，可选规格为3.0/3.5/4.0 × 8 mm（视频3）12。
- 支架置入
- 将导丝送入左冠状动脉，沿导丝将缩窄型支架送至左前降支，置于第一对角支远端。
- 使用压力泵将支架在动脉内扩张至额定压力，支架与管腔比率为1.3，以固定瓶颈结构。再维持15秒后，释放压力并撤出器械。
注意：通过血管造影确认缩窄型支架是否正确就位。
4. PET 成像
注意：基因转导前一天，进行静息态和应激态15O标记的放射性水PET/CT扫描（需在医院环境中由放射科技师操作）。
- 参考成像
- 在静息和负荷成像前进行计算机断层扫描（CT）。利用CT信息进行衰减校正。
- 15O标记的放射性水成像
- 使用800 MBq的15H2O团注进行静息和负荷成像。
- 负荷成像
- 在适当的放射性衰变12分钟后，再使用800 MBq的15O-水团注进行负荷成像。
注：通过静脉输注腺苷（200 µg/kg/min）诱导充血，方法如前所述12。
- 在适当的放射性衰变12分钟后，再使用800 MBq的15O-水团注进行负荷成像。
5. 基因转移
- 电生理解剖标测
- 在完成冠状动脉造影及功能学检查（超声心动图、左心室造影成像）后，进行电生理解剖标测。
- 在X线透视引导下，经股动脉鞘管将标测导管送入左心室。
注：使用标测导管在左心室周围采集约100–150个点，以构建电生理解剖图。
- 完成电生理解剖图的构建
- 删除异常点，以获得更可靠的左心室电生理解剖图。
- 通过选择地图的裁剪平面，删除偏离心室形态结构的点；随后选择地图视图中的轨迹，删除在采点过程中发生水平位移的点。
注：确保剩余的点能够充分覆盖左心室，必要时补充采集更多点。
- 基因转导注射
- 在X线透视引导下，经股动脉鞘管将心肌内注射导管送入左心室，设定注射针长度为3 mm。
- 心肌内注射的标准
- 在电生理解剖标测系统的引导下，将注射靶点定位于左心室具有活性但运动减弱的区域。
注：以单极电压大于5 mV作为心肌存活的标准；以局部线性缩短率（LLS）尽可能低为运动减弱的依据，至少低于12%，最好低于6%13。
- 在电生理解剖标测系统的引导下，将注射靶点定位于左心室具有活性但运动减弱的区域。
- 心肌内注射操作
- 在30秒内将载体材料注入选定的靶点（步骤5.4），注射完成后保持注射针在心肌内停留额外5秒，再行回撤，以防止回流至左心室腔内。
6. 安乐死与样本采集
注意：在分别完成步骤 3.4.1 和 3.5.2 中所述的冠状动脉造影和射血分数测量后，向麻醉后的猪静脉内注射 50 mL 饱和氯化钾溶液。
- 心脏灌注固定
- 从胸腔中取出心脏，用水冲洗。在主动脉瓣上方插入18 G针头，并将针头连接至灌注泵。用750 mL的1%多聚甲醛（PFA）对心脏进行灌注。
- 样本采集
- 使用锋利的厨房刀将心脏切成1 cm厚的切片。从基因转导区域采集样本，分别置于4% PFA和液氮中。
注意：为获取阴性对照样本，需从左心室后壁采集对照样本。
- 使用锋利的厨房刀将心脏切成1 cm厚的切片。从基因转导区域采集样本，分别置于4% PFA和液氮中。
- 安全性组织采集
- 从远端组织（如肺、肝、肾、脾和卵巢）采集样本，并分别置于4% PFA和液氮中。
7. 样品储存
- 将样本置于4%多聚甲醛（PFA）中，4 °C下保存48小时用于染色。
注意：每天更换新鲜的PFA溶液。- 48小时后，用去离子水中含15%蔗糖的溶液替换PFA。在将样本包埋于石蜡块之前，至少保存24小时。速冻样本则在-70 °C下保存。
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结果
在进行基因递送之前，可通过冠状动脉造影和经胸超声心动图确定运动减弱区域（图1），以本方案确认缺血手术是否成功。冠状动脉阻塞状态可通过冠状动脉造影进行评估，而电生理解剖标测可准确定位缺血区域及冬眠心肌区域。
可通过测量周向应变、射血分数以及使用15H2O-PET评估心肌灌注来分析基因治疗的疗效（图3）。通过将心脏与电生理解剖图谱进行比对，可直接从基因转导区域采集组织样本。通过β-半乳糖苷酶染色后分析阳性细胞数量，以及通过CD31染色后分析心肌毛细血管面积，可利用免疫组织化学方法评估转基因表达和治疗性血管生成（图4）。此外，可通过诊断性影像学（通过超声心动图评估心包积液）、免疫组织化学以及分布分析来评估基因治疗的安全性。
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讨论
本方案的时间点可根据所使用的病毒载体进行调整。此外，免疫组织学分析可根据治疗基因的选择而定。如有需要，也可在本方案中增加更多时间点和终点指标。
本方案包含若干关键步骤，这些步骤对于实验成功至关重要，且一旦出错将无法在后续进行补救。首先，若未能成功诱导适当的缺血状态，则该动物必须从后续操作和分析中剔除。方法和影像学操作的标准化至关重要，以确保不同时间点及不同动物之间的结果具有可比性。其次，必须从确切的基因转导区域采集样本，并成功完成后续处理，以便进行进一步分析。此外，本方案要求操作者熟练掌握血管造影技术及多种影像学方法。例如，对跳动的心脏进行冠状动脉造影和病毒注射需要经过大量训练，正确实施经胸超声心动图也同样重要。然而，这些影像学方法能够评估心肌功能与灌注情况，为后续研究提供关键信息。
由于猪的心血管系统在解剖学和生理学上与人类相似，因此常被用于模拟心血管疾病的机制和相关操作。然而，由于动物生长迅速，其随访时间通常限制在约6个月以内。超过6个月后，动物的管理将变得困难，且成像质量会下降。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Maria Hedman、Tiina Laitinen、Tomi Laitinen、Pekka Poutiainen、Annika Viren 和 Severi Sormunen 在库奥皮奥大学医院提供 15O-PET 成像技术支持和协助；同时感谢国家实验动物中心的 Heikki Karhunen、Minna Törrönen 和 Riikka Venäläinen 在动物实验方面提供的帮助。
本研究由芬兰科学院、欧洲研究理事会（ERC）以及心血管再生医学欧盟“地平线2020”计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% PFA | VWR | VWRC28794.295 | 由多聚甲醛粉末配制而成 |
| 15% 蔗糖 | VWR | VWRC27480.294 | 由固体蔗糖配制而成 |
| 4% PFA | VWR | VWRC28794.295 | 由多聚甲醛粉末配制而成 |
| 5 F 猪尾导管 | Cordis | 534-550S | |
| 6 F AR2 导管 | Cordis | 670-112-00 | |
| 6 F 导引鞘 | Cordis | 504-606X | |
| 8 F 导引鞘 | Cordis | 504-608X | |
| 乙酰水杨酸 | 不同生产商 | ||
| 胺碘酮 | 不同生产商 | ||
| 血管造影系统 | GE Healthcare | ||
| 血管实验室套装 | Mölnlycke | 专为本血管实验室需求设计，包含无菌铺巾、容器和棉签 | |
| 比索洛尔 | 不同生产商 | ||
| 头孢呋辛 | 不同生产商 | ||
| 氯吡格雷 | 不同生产商 | ||
| Coroflex Blue 支架 | B.Braun Medical | 5029012 | 货号取决于支架尺寸 |
| Crile 止血钳 | |||
| 回旋加速器 | GE Healthcare | ||
| 多巴酚丁胺 | 不同生产商 | ||
| 电生理标测系统 | Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson 公司 | ||
| 依诺肝素 | 不同生产商 | ||
| 芬太尼 | 不同生产商 | ||
| 心肌内注射导管 | Johnson & Johnson | ||
| 碘对比剂 | Iomeron | ||
| 厨房刀 | 不同生产商 | ||
| 利多卡因 | 不同生产商 | ||
| 液氮 | 不同生产商 | ||
| MgSO4 | 不同生产商 | ||
| 18 G 针头 | Cordis | 12-004943 | |
| 灌注泵 | |||
| PET-CT 扫描仪 | Siemens Healthcare | ||
| 聚四氟乙烯管 | |||
| 丙泊酚 | 不同生产商 | ||
| 11 号手术刀片 | VWR | SWAN0503 | |
| 舌下含服硝酸甘油 | Takeda | ||
| 超声设备 | Philips |
参考文献
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